BÁO CÁO KHOA HỌC: "ĐA DẠNG PHÂN TỬ CỦA BACILLUS THURINGIENSIS Ở CÁC TỈNH BẮC BỘ VÀ BẮC TRUNG BỘ" pptx

ĐA DẠNG PHÂN TỬ CỦA BACILLUS THURINGIENSIS Ở CÁC TỈNH BẮC BỘ VÀ BẮC TRUNG BỘ La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị Thứ Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam n

ĐA DẠNG PHÂN TỬ CỦA BACILLUS

THURINGIENSIS Ở CÁC TỈNH BẮC BỘ VÀ BẮC TRUNG BỘ

La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị Thứ

Viện Công nghệ Sinh học

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thiên

nhiên phong phú và đa dạng Các vùng trong lãnh thổ Việt Nam có sự khác biệt khá đậm nét về điều kiện khí hậu, vị trí địa lý, tạo nên sự đa dạng về chủng loại động vật, thực vật và vi sinh vật

Những nghiên cứu đặt nền móng trong lịch sử phát triển Bt

là sự phát hiện ngẫu nhiên ra loài Bacillus gây hại ấu trùng

tằm [8] Trong vòng 100 năm qua, những nghiên cứu về Bt liên tục phát triển Các chế phẩm Bt được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở khắp các châu lục (châu Âu, Á, Mỹ,

Phi…) Nhiều nước trên thế giới đã xây dựng và nghiên

cứu tập đoàn Bt nhằm tìm hiều vai trò của Bt trong môi trường cũng như sự phân bố gen Cry và thu nhận những chủng Bt có hoạt lực diệt côn trùng cao để đưa vào ứng dụng [1]

Người ta cho rằng vùng đất nào nhiều côn trùng thì cũng xuất hiện nhiều Bt diệt côn trùng [1] Điều kiện khí hậu của nước ta thích hợp cho nhiều loài côn trùng sinh trưởng và phát triển vì vậy cũng hứa hẹn có một tập đoàn Bt phong phú và đa dạng về chủng loại cũng như gen Cry Hai vùng lãnh thổ đặc hữu (vùng đồng bằng sông Hồng và Bắc

Trung Bộ) được chọn để nghiên cứu

Bài báo này trình bày kết quả phân lập Bt và sự xuất hiện gen Cry của một số chủng Bt ở hai vùng lãnh thổ trên

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

- Các mẫu đất, bùn và nước thu thập từ các tỉnh thành

thuộc đồng bằng sông Hồng và vùng Bắc Trung Bộ như:

Hà Nội, Hà Tây, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải

Dương, Hưng Yên, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An,

Quảng Bình và Huế

- Các chủng chuẩn Bacillus thuringiensis israelensis (B.t.i) 1884; Bacillus thuringiensis kurstaki (Btk); Bacillus thuringiensis tenebrionis (Btt)

2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phân lập Bacillus [7]

- Phương pháp quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể [4]

- Phương pháp xác định sự tồn tại của các gen Cry [2]

- Phương pháp điện di protein [6]

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Phân lập Bacillus thuringiensis

Nước ta được đánh giá là nước có độ đa dạng sinh học rất cao và mang tính điển hình cho vùng Đông Nam Á Hai vùng đặc hữu chịu ảnh hưởng của sự phân hoá theo địa hình, yếu tố khí hậu và các đặc điểm về đất đai khác biệt (vùng đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ) được chọn nghiên cứu Trung bình mỗi tỉnh thu thập khoảng 30 mẫu thuộc các huyện khác nhau (bảng 1, 2)

Trong số 185 mẫu đất, bùn thu thập ở Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh Bình

đã phân lập được 920 chủng Bacillus với đặc điểm Gram+,

hình que, bào tử không phình Chỉ có 295 chủng trong số

đó có tinh thể hình tròn, tháp đôi, hình kim Các chủng

Bacillus có tinh thể được phân loại thành loài Bacillus

thuringiensis (Bt)

Các mẫu lấy ở Thanh Trì (có sông Hồng chảy quanh) với tỉ

lệ Bacillus thuringiensis/Bacillus (Bt/Ba) chiếm 47% Bên

cạnh đó tỉnh Hưng Yên, các mẫu đất ở Tiên Lữ, Kim Động (đất vườn là chủ yếu) cho tỉ lệ Bt/Ba thấp nhất là 23%

(24/98) Các tỉnh còn lại như Hà Tây, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Ninh Bình thu được tỉ lệ dao động 20-40% Bt/Ba (bảng 1, 2)

Bảng 1 Kết quả phân lập và sự phân bố mẫu tại các tỉnh

đồng bằng sông Hồng

Qua đó có thể nhận định rằng các đặc điểm địa hình của

khu vực lấy mẫu như: độ ẩm, độ phù sa, độ dinh dưỡng của

đất, độ mùn, đất vườn, đất ruộng, đất ao… có khả năng ảnh

hưởng đến tỉ lệ Bt nhận được Mặc dù Bt có trong hầu hết các mẫu thu được nhưng số lượng và đặc điểm của từng chủng phụ thuộc nhiều yếu tố mà đặc điểm của địa hình lấy mẫu rất quan trọng Điều này cũng được chứng minh qua nghiên cứu vùng đồng bằng Bắc Trung Bộ

Vùng Bắc Trung Bộ có những nét thay đổi rõ rệt về thời tiết Mùa khô kéo dài, chịu ảnh hưởng của gió tây nóng, khí hậu mang tính chuyển tiếp, đất đai khô cằn, độ ẩm thấp, dinh dưỡng nghèo nàn, chủ yếu là cồn cát, nghèo mùn,

nghèo đạm

Trong 118 mẫu đất, bùn từ 4 tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Bình và Huế, chúng tôi thu được 168 chủng Bt trên

tổng số 559 chủng Bacillus

Bảng 2 Kết quả phân lập và sự phân bố mẫu tại các tỉnh

đồng bằng Bắc Trung Bộ

So với vùng đồng bằng Bắc Bộ, tỷ lệ Bacillus của các mẫu

thu được ở vùng Bắc Trung Bộ ít hơn và tỷ lệ Bt/Ba cũng

kém hơn Có thể cho rằng khu hệ Bacillus và Bt bị ảnh

hưởng bởi điều kiện khí hậu và dinh dưỡng của đất

2 Sự đa dạng về hình thái tinh thể

Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước ao hồ… Hình dạng tinh thể (một trong những đặc điểm quan trọng

để phân loại Bt thành loài phụ) rất đa dạng Phần lớn các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình tháp đôi (hình 1), một số hình cầu (hình 2) và một số chủng có tinh thể với các hình dạng khác nhau Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập ở các địa phương cũng cho phép dự đoán về sự đa dạng của chúng

Hình 1 Tế bào dinh dưỡng, bào tử, tinh thể hình tháp đôi

của chủng Bacillus thuringiensis TH16

Hình 2 Tế bào dinh dưỡng, bào tử, tinh thể hình tròn của

chủng Bacillus thuringiensis QB11

3 Sự đa dạng gen Cry

Để xác định sự tồn tại gen Cry trong các chủng Bt phân lập, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi được thiết

kế từ gen Cry1 (mã hoá protein diệt côn trùng bộ cánh

vẩy), gen Cry 3 (mã hoá protein diệt côn trùng cánh cứng)

và Cry4 (mã hoá protein diệt côn trùng hai cánh) Các

chủng Bt mang gen Cry nào thì ADN của chúng bắt cặp với

cặp mồi đặc hiệu với gen đó

Cho tới nay có hàng trăm gen Cry đã được công bố, tuy nhiên hầu hết mối quan tâm đều tập trung vào nhóm gen Cry1 , Cry 3 , Cry4 Các chủng mang gen Cry 1 sẽ nhận được sản phẩm PCR: 490bp và 980bp; các chủng mang gen Cry 4 sẽ nhận được sản phẩm PCR: 690bp và 1290bp còn các chủng mang gen Cry 3 sẽ nhận được sản phẩm PCR: 649bp và 1060bp

Bốn chủng Bt có đặc điểm hình thái điển hình của mỗi tỉnh được chọn để xác định gen Cry Kết quả bước đầu cho thấy trong những chủng Bt nghiên cứu của 12 tỉnh thành đã hội

tụ đủ cả gen Cry1, Cry 3 và Cry 4 (hình 3) Đặc biệt có 2 chủng phân lập được ở Thái Bình (57 TB) và Quảng Bình (14 QB) mang gen Cry 3 Thường thì các chủng mang gen Cry 3 rất hiếm, đôi khi chỉ chiếm tỉ lệ 1/1000 so với các chủng Bt tìm thấy Do đó việc dự đoán 2 chủng 57 TB và

14 QB mang gen Cry 3 là một điều lý thú, minh chứng cho

sự đa dạng gen Cry của Bt ở Việt Nam

Hình 3: Sản phẩm PCR của chủng phân lập và chủng chuẩn Chú thích: Cột 1: Thang ADN chuẩn (ADN/HindIII: 23kb, 9kb, 6kb, 2,3kb, 2,1kb, 0,5kb); Cột 2: Sản phẩm PCR

chủng chuẩn Bacillus thuringiensis israelensis 1884 (mang

gen cry 4); Cột 3: Sản phẩm PCR của chủng phân lập 11

QB; Cột 4: Sản phẩm PCR chủng chuẩn Bacillus

thuringiensis tenebrionis (mang gen cry 3); Cột 5: Sản

phẩm PCR của chủng phân lập 57TB; Cột 6: Sản phẩm

PCR chủng chuẩn Bacillus thuringiensis kurstaki (mang

gen cry 1); Cột 7: Sản phẩm PCR của chủng phân lập 16

TH

4 Đa dạng về thành phần protein

Thành phần protein tinh thể của Bt không những quyết định hoạt lực diệt côn trùng mà còn liên quan đến sự tồn tại các lớp gen Cry Các protein 130kDa, diệt côn trùng cánh vẩy

do gen cry1 mã hoá Gen Cry 3 mã hoá protein có trọng lượng phân tử thấp hơn (66-73kDa), diệt côn trùng cánh cứng Protein tinh thể diệt côn trùng hai cánh đa dạng nhất bao gồm các protein 130 kDa, 128kDa, 67kDa, 28kDa do gen cry 4, cry 10, cry 11 mã hoá Các protein này đều có hoạt lực diệt ruồi, muỗi, tuy nhiên mức độ gây độc khác nhau

Tất cả các chủng Bt được chọn để nghiên cứu gen cry cũng được sử dụng để nghiên cứu thành phần protein Tinh thể protein của các chủng Bt sau khi hoà tan với NaOH, SDS, mercaptoethanol được điện di trên gel polyacrylamide Kết quả cho thấy một số chủng nghiên cứu có băng protein 130 kDa giống chủng chuẩn Btk (hình 4), một số chủng khác có protein 130 kDa, 67kDa, 28kDa giống chủng chuẩn Bti Hai chủng 57 TB và 14 QB mang gen Cry 3 đều không có

băng protein 130 kDa mà chỉ có băng 70 kDa giống chủng chuẩn Btt (hình 4)

Hình 4: Thành phần protein của chủng phân lập và chủng chuẩn được điện di trên gel polyacrylamide

Cột 1: protein chuẩn (Phosphorylase 97,4 kDa; Bovine serum albumin 66,2 kDa; Glutamate dehydrogenase 55 kDa; Ovalbumin 42,7 kDa; Aldolase 40 kDa; Carbonic Anhydrase 31 kDa); Cột 2: protein của chủng chuẩn

Bacillus thuringiensis kurstaki; Cột 3: protein của chủng phân lập 16 TH; Cột 4: protein của chủng chuẩn Bacillus thuringiensis israelensis 1884; Cột 5: protein của chủng phân lập 11 QB; Cột protein của chủng chuẩn Bacillus thuringiensis tenebrionis; Cột 7: protein của chủng phân

lập 57TB

IV KẾT LUẬN

Từ 303 mẫu đất, bùn, nước của 12 tỉnh, thành thuộc Bắc Trung bộ và Đồng bằng sông Hồng đã phân lập được 463 chủng Bt có tinh thể hình tháp, hình cầu, hình kim… trên tổng số 1479 chủng Bacillus nhận được

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi được thiết kế từ gen cry 1, cry 3, cry 4 đã phát hiện sự tồn tại của các gen trên

Thành phần protein của các chủng cũng rất đa dạng Trên gel polyacrylamide đã phát hiện protein 130 kDa của các chủng Bt mang gen cry1; 130 kDa, 67kDa, 28kDa của Bt mang gen cry 4 và 70 kDa của các chủng Bt mang gen cry

3

Đây chỉ là kết quả bước đầu nhưng cũng thấy rằng quần thể

Bt ở Bắc Việt Nam rất phong phú, đa dạng về hình thái tinh thể, gen cry và thành phần protein Tuy nhiên số lượng loài,

thành phần loài cũng như loài phụ phụ thuộc đáng kể vào tính chất của mẫu

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Alejandra Bravo, et al, 1998, Characterization of Cry genes in Mexican Bacillus thuringiensis Strain Collection Appl Environ Microbiol, vol 64: 4965- 4972

2 Carozzi N.B, Vance C.K, Gragory W W, Stephen E, Michael G Koziel, 1991 Prediction of insecticidal activity

of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain

reaction product profiles Appl Environ Microbiol, 57: 3057-3061

3 Crickmore N, 1998 Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal protein

Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol 62 : 807-813

4 Gordon R.E, Harner W.C , Pang N.H, 1973 The

Genus Bacillus United states Department of Agriculture, Washington.D.C

5 Hofte H., Whitely H.R, 1989 Insecticidal crystal

proteins of Bacillus thuringiensis Microbial Rev, 53: 242 – 255

6 Laemmli U.K, 1970 Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4

Natural, 227: 680-685

7 Russel.S & S Traver, 1987 Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp Applied and

Environmental Microbiology, Vol 53: 1263-1266

8 Takashi Yamamoto, 2001 One Hundred Years of Bacillus thuringiensis Research and Development

Discovery to Transgenic Crops, Journal of Insect

Biotechnology and Sericology, Vol.70: 1-23

9 Thiery & E Franchon, 1997 Identification, Isolation, Culture and Preservation of Entomopathogenic Bacteria Mannual of Techniques in Insect Pathology ISBNO-12-432555-6 Academic Press Limited : 56-57

SUMMARY

Molecular diversity of Bacillus thuringiensis strains collected at Delta Red River region and North Central

Part of Vietnam

La Thi Nga, Nguyen Minh Duong, Tran Duy Minh, Truong Ba Hung, Vo Thi Thu

Institue of Biotechnology

Samples from 12 provinces of Delta Red River region and North Central part of Vietnam were collected for isolation

of Bt A total of 463 Bt strains were selected from 1479 Bacillus strains obtained The strains were analysed on the based of morphological examination, protein profiles as well as PCR with specific primers that could detect the Cry1, Cry3, Cry4 genes The proteins belonging to the Cry1 group are toxic for Lepidopteran insects The Cry3 proteins are active against Coleopteran insects The Cry4 proteins are toxic for Dipteran

From 185 samples collected at Red river region, 920 spore

- forming isolates were obtained From those 295 isolates (32%) were Bt From 118 samples collected at North

Central Part, 599 spore - forming isolates were obtained

and from those 168 strains (28 %) were Bt

The spore crystal preparations of Bt were examined for toxic protein The electrophoretic patterns of selected

isolates showed 130, 67, 28 kDa bands typical for Cry4 gene protein, other isolates presented ouly 130 kDa band typical for Cry1 gene protein Especially 60 - 70 kDa bands typical for Cry3 gene were found in 2 isolates collected in Quang Binh and Thai Binh provinces

48 isolates were selected at random from the strains

obtained and their genes were characterized by PCR using specific primers for genes Cry1, Cry3, Cry4 (Carozzi et al 1991) In 26 of the isolates found the presence of dipteran specific genes Cry4 The lepidopteran specific Cry1 genes

is reported in 20 strains and especially two strains obtained

in Quang Binh and Thai Binh showed the presence of

coleoptera specific Cry3 genes

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị Kim Cúc