Phương pháp được sử dụng rộng rãi là phương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát hiện sự tồn tại của kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh [1, 4, 6, 7, 8].. Tuy nhiên, kháng nguy
Trang 1PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ
CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076
1
Đỗ Thị Huyền, 2 Nguyễn Thành Trung, 2 Nguyễn Thị Thu Hằng, 1 Phạm Thuý Hồng, 3 Trương Văn Dung,
1
Trương Nam Hải, 2 Lê Đình Lương
1: Viện Công nghệ sinh học, 2: Đại học Quốc gia Hà Nội 3: Viện Thú Y Trung Ương
MỞ ĐẦU
Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn
cho người trên toàn cầu Theo số liệu thống kê của Pháp năm 1995, trong số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ăn
đã có tới 3131 bệnh nhân do Salmonella gây ra Bệnh do Salmonella tập trung chủ yếu ở các nước châu Âu, châu Mỹ điển hình là Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan [1, 2] S enteritidis
hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan
trọng nhất trong số các chủng Salmonella
Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ ít hơn và chủng gây bệnh chủ yếu là S typhimurium, S cholera sau đó đến
Trang 2S enteritidis Thông thường bệnh không gây triệu chứng
nặng đối với người lớn nhưng lại gây triệu chứng nghiêm trọng đối với người già, người yếu và trẻ em
Người bị mắc bệnh là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc từ
thịt động vật, gia cầm và trứng đã nhiễm Salmonella Hiện
nay mỗi nước đều có chương trình an toàn thực phẩm và
khuyến cáo để phòng bệnh do Salmonella nhưng hầu như
vẫn chưa loại trừ được mầm bệnh một cách triệt để [1] Một trong những phương pháp để hạn chế sự lây lan của mầm bệnh là phải có phương pháp phát hiện nhanh, tiện lợi, chính xác để phát hiện ra nguồn gia súc, gia cầm nhiễm bệnh
Hiện nay có nhiều phương pháp phát hiện Salmonella [1, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9] Phương pháp được sử dụng rộng rãi là
phương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát hiện sự
tồn tại của kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh
[1, 4, 6, 7, 8] Tuy nhiên, kháng nguyên sử dụng trong các phương pháp này đều mới là kháng nguyên toàn vẹn được tinh chế bằng phương pháp hoá học và lý học nên tính đặc
Trang 3hiệu chưa cao Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi mong
muốn tạo được epitope của kháng nguyên H:g,m có khả
năng phát hiện đặc hiệu S enteritidis bằng công nghệ AND
tái tổ hợp
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 Nguyên liệu
a, Chủng vi sinh vật
- Chủng S enteritidis ATCC13076 là chủng vi khuẩn mang
nguồn gen gm1 do Viện Thú Y Trung Ương cung cấp
- Chủng E coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] được sử dụng
làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, nhân và chọn dòng các plasmit
- Chủng E coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dcm
(DE3) plysS (Caml)] được sử dụng làm chủng nhận trong
Trang 4thí nghiệm biến nạp với vectơ biểu hiện pET22b(+) mang gen gm1
b, Plasmit
- Plasmit pCR2.1 mua của hãng Invitrogen được sử dụng làm vectơ tách dòng gen
- Plasmit pET22b(+) được sử dụng làm vectơ biểu hiện
trong tế bào E coli BL21
2 Phương pháp
a, Phương pháp biến nạp
Tế bào E coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bào
khả biến bằng muối CaCl2 của Seidman C E và cộng sự [10]
b, Các phản ứng cắt, nối ghép các đoạn ADN, điện di trên gel agaroza được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [11]
Trang 5c, Phản ứng PCR
Phản ứng làm biến tính ADN khuôn diễn ra ở 940C trong 2 phút sau đó được tiếp theo với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm
ba bước: bước 1: biến tính sợi ADN khuôn ở 940C trong 1 phút; bước 2: mồi kết cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng trên sợi khuôn ở 490C trong 1 phút; bước 3: tổng hợp, kéo dài chuỗi ở 720C trong 40 giây Phản ứng kết thúc ở 720C trong 5 phút và ủ mẫu ở 40C
Hai đoạn mồi dùng để nhân gen do hãng Amersham
Pharmacia Biotech tổng hợp có trình tự như sau:
gm1f: TCCATggATgAAgCCAAAgCgATAgCTggT
NcoI
gm1r: ACTCgAggTTTTTggTTTTATCATCAAA
XhoI
Trang 6Hình 1: Phân tích ADN hệ gen S enteritidis ATCC13076
trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Hệ gen S enteritidis ATCC13076
Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn
d, Tách ADN hệ gen của S enteritidis
Một khuẩn lạc của S enteritidis được nuôi cấy lắc trong 10
ml môi trường LB ở 370C qua đêm Sau đó tế bào được thu lại bằng ly tâm và được hoà tan vào 567 l TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH8) Mẫu tế bào được bổ sung thêm
30 l SDS 10%, 3 l proteaza K 1% và ủ ở 370C trong 1
Trang 7giờ sau được bổ sung thêm 180 l NaCl 5 M và ủ ở 650C trong 10 phút Protein của tế bào được loại bỏ bằng
Chloroform ADN hệ gen nằm ở pha trên được tủa lại bằng cồn và được hoà vào 40 l TE có bổ sung 0,4 l
ARNaza1% ADN hệ gen được bảo quản ở 40C
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Nhân gen gm1 bằng kỹ thuật PCR
S enteritidis có 3 kháng nguyên quan trọng được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của chúng trong huyết thanh là
kháng nguyên O, H và kháng nguyên lông Trong số các kháng nguyên này, kháng nguyên H và kháng nguyên lông
là đặc hiệu hơn cho S enteritidis Kháng nguyên H của S enteritidis chỉ có một tính đặc hiệu là H:g,m được mã hoá bởi gen fliC Kháng nguyên H được biểu hiện thường
xuyên giúp cho Salmonella vận động và kết dính vào thành
ruột tạo điều kiện cho sự định khu, nhân bệnh và gây bệnh Năm 1995, Van Asten A J A M và cộng sự đã xác định được vùng gen mã hoá cho epitope của kháng nguyên H
Trang 8đặc hiệu cho S enteritidis Epitope này là chuỗi polypeptid
ngắn có trình tự axit amin từ 246-382 [2] Trong thí nghiệm của mình, chúng tôi đặt tên cho gen mã hoá epitope đó là
gm1
Để có được nguồn gen gm1, chúng tôi đã tách chiết ADN
hệ gen của S enteritidis theo như quy trình đã được mô tả ở
phần nguyên liệu và phương pháp ADN hệ gen sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
0,8% Kết quả điện di sản phẩm ADN được trình bày trên hình 1 cho thấy ADN hệ gen là băng sáng, kích thước lớn, không bị đứt gãy Sau đó ADN hệ gen được pha loãng ra
200 lần để làm sợi khuôn nhân gen gm1
Cặp mồi dùng để nhân gen được thiết kế dựa trên trình tự
gen fliC mã số M 84980 trên ngân hàng gen quốc tế Với
mục đích tạo được epitope của kháng nguyên tái tổ hợp hoàn chỉnh, không bị lẫn một số axit amin nằm trong vùng
đa nối của vectơ pET-22b(+), chúng tôi đã thiết kế mồi đầu
5’ và 3’ có chứa thêm trình tự của enzyme hạn chế NcoI và XhoI tương ứng Protein tái tổ hợp sẽ được tiết ra khoang
chu chất của tế bào nhờ tín hiệu dẫn pelB và sẽ được tinh
Trang 9sạch dễ dàng nhờ 6 axit amin Histidin ở tận cùng đầu C đã
được thiết kế sẵn trên vectơ pET-22b(+).Gen gm1 được
nhân lên bằng PCR theo chu trình đã được mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp Sản phẩm của phản ứng được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza 0,8% Kích thước
gen gm1 theo tính toán dài khoảng 0,3 kb (Hình 2)
Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel
agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn
Trang 10Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng
EcoRI trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI
Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn
Trang 11Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang
gen gm1
Trang 122 Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1
Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng
nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh
S enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E coli BL21 vì E coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nhau nên E coli có thể tổng hợp được protein có cấu
trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong
Salmonella
Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng
Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng
pCR2.1 Sản phẩm lai được biến nạp vào E coli DH5 Plasmit trong thể biến nạp E coli DH5 được tách và được cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI Theo tính toán, nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI
sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3) Các
plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào
vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt
vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI Đoạn gen có kích thước
0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza Sản phẩm nối
Trang 13được biến nạp vào tế bào E coli BL21 Sau khi kiểm tra các dòng plasmit trong các thể biến nạp E coli BL21,
chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 như mong muốn Plasmit này được đặt tên là
pETgm1 Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình bày ở hình 4
3 Biểu hiện gen gm1
Các dòng E coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1
được nuôi cấy qua đêm ở 37 0C trong 2ml môi trường LB
có chứa 100g/ml ampicilin Sau đó tế bào được hoà loãng vào môi trường LB có ampicillin đến OD600 0,1 và nuôi cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để
OD600 đạt 0,5 đến 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp Đây là nhiệt độ thuận lợi
để E coli hình thành cấu trúc đúng của protein Sau 6 giờ
nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng đệm xử lý mẫu Protein tổng số được kiểm tra trên gel
acrylamit 13,3% Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E
Trang 14coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước
khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình
5)
Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E coli BL21
trên gel acrylamit 13,3%
Đường chạy 1-5: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 6: Protein chuẩn
Đường chạy 7: E coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 8: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong
điều kiện không cảm ứng
Trang 15Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel
agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn
Trang 16Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng
EcoRI trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI
Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn
Trang 17Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang
gen gm1
2 Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1
Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng
nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh
S enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E coli BL21 vì E coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nhau nên E coli có thể tổng hợp được protein có cấu
trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong
Salmonella
Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng
Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng
pCR2.1 Sản phẩm lai được biến nạp vào E coli DH5 Plasmit trong thể biến nạp E coli DH5 được tách và được cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI Theo tính toán,
Trang 18nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI
sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3) Các
plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào
vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt
vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI Đoạn gen có kích thước
0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza Sản phẩm nối
được biến nạp vào tế bào E coli BL21 Sau khi kiểm tra các dòng plasmit trong các thể biến nạp E coli BL21,
chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 như mong muốn Plasmit này được đặt tên là
pETgm1 Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình bày ở hình 4
3 Biểu hiện gen gm1
Các dòng E coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1
được nuôi cấy qua đêm ở 37 0C trong 2ml môi trường LB
có chứa 100g/ml ampicilin Sau đó tế bào được hoà loãng vào môi trường LB có ampicillin đến OD600 0,1 và nuôi cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để
Trang 19OD600 đạt 0,5 đến 0,8 Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối
cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp Đây là nhiệt độ thuận lợi
để E coli hình thành cấu trúc đúng của protein Sau 6 giờ
nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng đệm xử lý mẫu Protein tổng số được kiểm tra trên gel
acrylamit 13,3% Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước
khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình
5)
Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E coli BL21
trên gel acrylamit 13,3%
Đường chạy 1-5: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy
Trang 20trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 6: Protein chuẩn
Đường chạy 7: E coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 8: E coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong
điều kiện không cảm ứng
