BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR" ppsx

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Khoa Sinh học - Trường Đại Họ

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương

Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQG Tp HCM

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I

Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

TỔNG QUAN

Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật chất di truyền là ARN Đây là một trong những tác nhân chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut

tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV

(Lymphoid Organ Virus) YHV tác động trên tôm chủ yếu

ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành Tôm bệnh

sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng

ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể Các quan sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với

sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất

Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh

Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú

Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồng thời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình Quy trình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Mẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV do Viện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp Các mẫu này được bảo quản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -200C

Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm được

nghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate, phenol pH8, glycerol, sodium acetate) 200 l dịch nghiền được ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol Sau ly tâm, cặn được làm khô và hòa lại trong 50 l H2O đã xử lý DEPC (Diethyl pyrocarbonate)

Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng các phần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồi dùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ gen YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999) Các đoạn mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3',

YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC

GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi

5'-GTCTCACACACATGGACTTC-3'

đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp

và cung cấp

Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở

420C-45 phút Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi

và nước vừa đủ 50 l Chương trình PCR : 950C-3'; 15 chu

kỳ 940C-30", 620C-30", 720C-30"; 36 chu kỳ 940C-30",

480C-30", 720C-30"; 720C-6'

Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điện

di và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (Hybond N+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tự đoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP Bộ kit DIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) được

sử dụng để phát hiện các phân tử lai

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Kết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng: Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng để nhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị trí bắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1)

Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ

ARN hệ gen YHV

Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồi thiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trên ARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp với dịch chiết tôm Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuật PCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhân

bản đoạn ADN có kích thước 303 bp, (2) PCRII nhân bản đoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI

Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCRI và II từ RNA YHV

1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp);

3 : Thang X 174 Hae-III;

4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp)

Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm

1 : Thang 186 bp

2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch

chiết tôm

Các kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được có cường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thời

không thấy sản phẩm ký sinh Phản ứng tiến hành trên dịch chiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dương tính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARN trong mẫu Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trình PCR hoạt động tốt

Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫu

dò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sản phẩm PCR nhận được Phản ứng Southern blot được tiến hành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từ ADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADN WSSV (White Spot Syndrome Virus)

Hình 4 A, B : Kết quả điện di và Southern blot với mẫu dò

đặc hiệu cho YHV 1,2 : Sản phẩm PCR từ MBV; 3,4 : Sản phẩm PCRI từ

YHV; 5: Thang X174- HaeIII; 6,7: Sản phẩm PCRII từ

YHV; 8,9: Sản phẩm PCR từ WSSV

Kết quả (hình 4 A và B) cho thấy tín hiệu lai là hoàn toàn đặc hiệu cho các mẫu YHV

Độ nhạy của quy trình RT-PCR : Độ nhạy của quy trình được xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trên ARN YHV (30 g/l) pha loãng nhiều bậc

Hình 5 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm

PCR từ RNA YHV pha loãng 6: Thang 100 bp; 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11: Các sản phẩm PCR ứng với độ pha loãng 1, 2, 3, 4, 5,

10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 của RNA YHV

Kết quả trên cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được

6 pg ARN YHV hiện diện trong mẫu

Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đầu vàng

Quy trình đã thiết lập trên ARN YHV được áp dụng để phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm, kết quả được trình bày trong hình 6 cho thấy có 2/20 mẫu khảo sát cho

kết quả dương tính Các mẫu còn lại, tuy đã được chẩn

đoán mô học là dương tính với bệnh đầu vàng nhưng lại cho kết quả RT-PCR âm tính Điều này có thể do nhiều nguyên nhân : (1) đoạn mồi không phát hiện được các biến chủng của YHV địa phương, (2) Mẫu không được bảo quản tốt dẫn đến sự phân hủy ARN virut, (3) Bệnh do một virut tương cận nhưng không phải là YHV

Hình 6: Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi

nhiễm đầu vàng

11: Thang 100 bp ; 1 - 21: Sản phẩm PCR từ các mẫu tôm

nghi nhiễm

KẾT LUẬN:

- Quy trình RT-PCR do chúng tôi thiết lập phát hiện được YHV với độ đặc hiệu cao và độ nhạy là 6pg ARN YHV tinh sạch

- Trên 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm, quy trình phát hiện 02 mẫu nhiễm YHV

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Cowley J.A., Dimmock C.M., Wongteerasupaya C.,

Boonsaeng V., Panyim S & Walker P.J 2001 Yellow

head virus from Thailand and gill-associated virus from Australia are closely related but distinct prawn viruses Dis Aquat Org.,

2- Tang K.F.J & Lightner D.V 1999 A yellow head virus gene probe : nucleotide sequence and application for in situ hybridization Dis Aquat Org., 35:165-173

3- Wongteerasupaya C., Tongchuea W., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B & Flegel T.W 1997 Detection of yellow-head virus (YHV)

of Penaeus monodon by RT-PCR amplification Dis

Aquat Org., 31:181-186

SUMMARY

Detection of yellow head virus (yhv) in black tiger

shrimp (penaeus monodon) by RT-PCR

Yellow head disease (YHD) is one of the most threatening epidemic diseases in shrimp rearing Data collected in some coastal regions of Viet Nam in 2001 showed an infection rate of about 50-60% in post larvae

We set up a RT-PCR-based protocol for the detection of YHV (Yellow Head Virus), one of the main causing agents

of YHD generally called YHCV (Yellow Head Complex Viruses) We designed primers based on genomic sequence previously reported (Tang & Lightner, 1999)

Amplification reaction with these primers showed high

specificity and a detection limit of 6pg of pure YHV RNA

On 20 shrimp samples collected from rearing ponds, RNA was extracted by Trizol method and amplified using the established protocol We obtained two positive signals with low intensity This low positive rate may be due to high genetic polymorphism of YHV or the presence of other members of the YHCV

ACKNOWLEDGMENTS: We gratefully acknowledge J.A Cowley who provided YHV RNA

Ngưòi thẩm định nội dung khoa học: GS Lê Đình Lương