BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E. COLI" doc

Trichobakin tái tổ hợp sau khi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứng minh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARN ribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E COLI

Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi*

Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG

*Tác giả để liên hệ: Tel 7561903; Fax 8363144; E-mail: pvchi@ibt.ac.vn

1 MỞ ĐẦU

Trichobakin (TBK) là một protein bất hoạt ribosom lớp 1,

được tách chiết từ cây Trichosanthes sp Bac Kan 8-98

thuộc họ Cucurbitaceae [1,2] Trichobakin tái tổ hợp sau

khi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứng

minh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARN

ribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp lucierase trên mô hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate) Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, virut, chúng còn có khả

năng gây ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro

[3] Để có thể có những ứng dụng hiệu quả hơn,

Trichobakin có thể được gắn thêm thành phần hướng đích

để tạo các protein lai theo dạng các “độc tố miễn dịch”

(ITs) nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các quần thể tế bào

mà ở đó có biểu hiện các thụ thể đặc hiệu của thành phần hướng đích bằng công nghệ ADN tái tổ hợp [ 4, 5]

Hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) hay hormon giải phóng thể vàng (luteinizing hormone-releasing hormone: LH-RH) là một neuro-decapeptide, không gây đáp ứng

miễn dịch và có ái lực rất cao (Kd khoảng 10-9 M) với thụ thể của GnRH(GnRHR) [6, 11] GnRHR được biểu hiện nhiều trên bề mặt tế bào ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[7-10] Mặt khác ở các tế bào ung thư mang

GnRH receptor thường có biểu hiện loại “death receptor” Fas[12] Sự liên kết giữa GnRH (hoặc dẫn xuất ) với GnRH receptor sẽ kích hoạt sự biểu hiện của Fas ligand, gây ra quá trình appotosis cho tế bào[13] Do vậy GnRH được xem như là một tác nhân hướng đích lý tưởng, GnRH đã được sử dụng trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp khác nhau như recombinant GnRH-PAP fusion toxin Trong đó PAP cũng là một protein bất hoạt ribosome được tách chiết

từ cây Phytolacca americana GnRH-PAP đã có khả năng

ức chế đặc hiệu các tế bào ung thư có biểu hiện các GnRH receptor bề mặt[6]

Trong báo cáo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu tạo protein lai GnRH-TBK được thiết kế dựa trên sự liên kết đoạn gen mã hoá cho GnRH ở người và trình tự gen mã hoá cho TBK bằng công nghệ ADN tái tổ hợp

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu và hoá chất

Các hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử được mua từ các hãng Sigma, Bio-Rad, Pharmacia-Biotech Các

enzym giới hạn BamHI, NcoI, enzym ghép nối T4 ADN

ligase, Taq ADN polymerase được mua từ hãng New

England Biolabs (Anh) Vector biểu hiện pET 21d(+),

chủng vi khuẩn E.coli BL 21 (DE3) được mua của hãng

Novagen (Mỹ)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Nhân gen gnrh- tbk bằng kỹ thuật PCR

Việc thiết kế gen lai gnrh- tbk được tiến hành trên cơ sở gen tbk đã được tách dòng pQV 20 [1] Gen mã hoá cho

GnRH của người được nối với gen mã hoá cho Trichobakin thông qua một polynucleotid trung gian mã hoá cho 13 axit amin (linker), có vai trò tạo nên sự mềm dẻo trong cấu trúc

và tính tan của protein lai HSP1 Tổ hợp gen này có kích thước 813 bp mã hoá cho protein có kích thước khoảng 30 kDa Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để tạo ra

và nhân lên tổ hợp gen mã hóa cho protein lai GnRH-TBK Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC, 48 giây; 56oC, 48 giây; 72oC, 84 giây; lặp lại 32 chu kỳ; 72oC, 8 phút

2.2.2 Thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợp

Vector pET-21d(+) (Novagen) và sản phẩm PCR cùng

được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI, BamHI và được

nối với nhau nhờ T4 ADN ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK Việc xác định trình tự ADN được tiến

hành trên máy ALF express DNA Sequencer và Thermo Sequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech)

2.2.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E.coli

Plasmid tái tổ hợp mang gen gnrh-tbk được biến nạp vào chủng tế bào khả biến E.coli BL21(DE3) và nuôi trong môi

trường LB lỏng có bổ sung ampicillin ( nồng độ cuối cùng

là 100g/ml), lắc 200 vòng/ phút ở 37C, Khi giá trị

OD600nm của dịch nuôi cấy đạt tới 0.5-0.7, tiến hành cảm ứng bằng IPTG (isopropyl - D- thiogalactoside) với nồng

độ cuối cùng là 0.4 mM Các mẫu tế bào được thu vào các thời điểm 0 h, 1h, 2h, 3h sau khi cảm ứng và 3h không cảm ứng Sự biểu hiện protein lai tái tổ hợp được phân tích bằng SDS-PAGE theo Laemmli [14] và Western blot theo

Towbin [15]

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thiết kế vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

3.1.1 Nhân gen mã hoá cho GnRH- TBK

Dựa trên trình tự các gen mã hoá cho các protein GnRH và TBK cặp mồi phục vụ cho việc tạo ra và nhân gen tái tổ hợp gnrh-tbk bằng kỹ thuật PCR đã được tổng hợp Mồi

xuôi mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn NcoI, toàn

bộ trình tự gen gnrh, trình tự đoạn linker và trình tự

nucleotid mã hóa cho 8 acid amin đầu tiên của TBK Mồi

ngược mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI và

trình tự nucleotidd mã hoá cho 7 acid amin cuối cùng của gen tbk

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel

agarose 0.8 %(hình 1) cho thấy một băng duy nhất có kích thước khoảng 813 bp Kích thước này phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước sản phẩm nối tạo thành giữa

gen gnrh, linker và gen tbk

3.1.2 Vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

Sản phẩm PCR gnrh-tbk và vector biểu hiện pET 21d(+) cùng được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI và BamHI,

và sau đó được nối lại với nhau bằng enzym T4 ADN

ligase nhằm tạo ra plasmid mới mang tổ hợp gen gnrh-tbk

và hệ biểu hiện phù hợp, phục vụ cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp được nghiên cứu Kết quả phân tích bằng điện di trên gel agarose 0.8% (hình 1)

Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy, plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK sau khi được xử lý bằng hai enzym giới hạn

NcoI và BamHI (đường chạy 3) tạo thành hai băng sản

phẩm có kích thước 5400 bp và 813 bp Trong đó, sản

phẩm 5400 bp tương ứng với kích thước của vector pET

21d(+) sau khi đã được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI

và BamHI và sản phẩm 813 bp tương ứng với tổ hợp gen gnrh-tbk (đường chạy 4) Các kết quả này cho thấy tổ hợp gen gnrh-tbk đã được gắn vào vector biểu hiện pET 21d(+)

Kết quả xác định trình tự pGnRH-TBK cũng đã khẳng định

sự có mặt của tổ hợp gen gnrh-tbk trong vector biểu hiện

pET 21d(+) đúng ở vị trí mong muốn và không thấy có một

thay đổi, đột biến nào trong trình tự của tổ hợp gen cũng như trong các trình tự chức năng của vector biểu hiện

Plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK tiếp tục được biến nạp vào

E.coli chủng Bl21(DE3) để biểu hiện protein

3.2 Biểu hiện GnRH-TBK ở vi khuẩn E.coli

Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang plasmid

pGnRH-TBK được nuôi cấy và gây cảm ứng bằng IPTG Các mẫu

tế bào được thu tại các thời điểm và 0, 1, 2, 3 giờ sau khi cảm ứng Dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào

được phân tích bằng SDS-PAGE (hình 2) Kết quả điện di

SDS-PAGE cho thấy, trong dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các đường chạy từ 1-4), có xuất hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử khoảng

30 kDa so với mẫu tế bào không được cảm ứng bởi IPTG (đường chạy 5) Như vậy, hệ biểu hiện của vector pET

21d(+) mang tổ hợp gen gnrh-tbk đã hoạt động ổn định,

dẫn đến sự biểu hiện một loại protein mới Protein này có trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết về

trọng lượng phân tử của protein tái tổ hợp GnRH-TBK Để

có thể khẳng định một cách chắc chắn hơn chúng tôi tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể một là huyết thanh kháng TBK kết quả thu được thể hiện ở hình 3

Hình 2 Điện di SDS-PAGE các sản phẩm protein tái tổ

hợp GnRH-TBK biểu hiện ở E.coli

M: thang protein chuẩn; 1-4: protein tổng số của vi khuẩn sau 0, 1, 2, 3h sau cảm ứng bằng IPTG; 5: protein tổng số của vi khuẩn sau 3 h không cảm ứng IPTG

Hình 3 Phân tích GnRH-TBK bằng Western blotting

M: Thang protein chuẩn; 1-3: Biểu hiện protein lai tái tổ hợp GnRH- TBK (mũi tên)ở các thời điểm 1 , 2, 3 giờ sau cảm ứng bằng IPTG

4 KẾT LUẬN

Đã tạo được được tổ hợp gen gnrh-tbk có kích thước 813

bp dựa trên cơ sở gen mã hoá cho GnRH có nguồn gốc từ người và gen mã hoá cho Trichobakin bằng kỹ thuật PCR

Tổ hợp gen này đã được đưa vào vector biểu hiện pET

21d(+) và được biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3)

Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot cho thấy,

protein tái tổ hợp được biểu hiện ổn định và có trọng lượng phân tử 30 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết của protein lai GnRH-TBK

Các nghiên cứu về tính chất của GnRH-TBK đang tiếp tục được nghiên cứu làm rõ và sẽ được trình bày trong những công bố tiếp theo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy

Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) //Biotechnol Appl Biochem 34, 85-92

2 Phan Văn Chi, Hoàng Quốc Trường, Ngyễn Thuý Hà, Phạm Công Hoạt, Lê Trần Bình, (2000)// Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, NXB Đại học Quốc gia

Hà Nội, tr 23-28

3 Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu & Phan Văn Chi (2002)// Tap chí Y học (đang in)

4 Phan Văn Chi (2001) // Hội thảo Sinh học Quốc tế

2001, Hà nội, tr 66-68

5 Lê Thị Bích Thảo, Hà Văn Huân & Phan Văn Chi (2003)// Tap chí Y học (đang in)

6 Schlick J.L., Dulieu P., Desvoyes B., Adami P.,

Radom J, Jouvenot M (2000) // FEBS Letters 472,

241-246

7 Emos, G., Schroder, B., Ortmann, O., Westphalen, S., Schultz, K.D and Schally, A.V (1993) // J Clin

Endocrinol Metab 77, 1458-1464

8 Eidne, K.A., Flanagan, C.A., Harris, N.S and Millar, R.P (1987)// J Clin Endocrinol Metab 64, 425-432

9 Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K and Waxman, J (1990)// Br J Cancer 62, 96-99

10 Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T and Tamaya,

T (1994) // Cancer 74, 2555-2561

11 Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060

12 Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno, T., and Tamaya, T., (1997) // Eur J Obstet, Gynecol

Report Biol.74, 73-78

13 Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and

Tamaya, T (1997) // Int J Oncol 13, 97-100

14 Laemmli, U.K (1970)// Nature (London) 227,

680-685

15 Towbin, H., Staehelin, T and Gordon, J (1979) // Proc Natl Acad Sci USA 76, 4350-4354

SUMMARY

Construction and expression of the fusion protein

GnRH-TBK in E coli

Đang Thanh Nam & Phan Van Chi

Institute of Biotechnology (IBT),

National Center for Natural Science & Technology (NCST)

Immunotoxins and recombinant toxins are cytotoxic agents and designed to selectively kill populations of cells that display specific cell surface antigens These toxins usually

composed of a targeting moiety linked to a protein toxin by chemical coupling or recombinant DNA technology The targeting domain controls the specificity and is usually derived from Fv fragment of an antibody, a growth factor,

or a soluble receptor The protein toxins are obtained from bacteria (e.g., Pseudomonas endotoxin [PE] or diptheria toxin [DT]) or from plants (e.g., Ribosome-Inactivating Proteins [RIPs]) Trichobakin (TBK), a type I

ribosome-inactivating protein isolated from the plant Trichosanthes

sp Bac Kan 8-98 (family Cucurbitaceae) with specific

rRNA N-glycosidase activity, was proved to have potent antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm Therefore, TBK is a good candidate to be used the

construction of different fusion proteins as recombinant

“immunotoxins” In this paper, the result of the

construction of a bacterial expression plasmid encoding TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing

hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites

on several gynaecologic tumors is presented The fusion cDNA were amplified by PCR using specific primers

designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk

genes As a result, the DNA sequence with the size of 813

bp encoding the fusion protein with 271 amino acids was obtained The target gene was cloned in pET-21d(+)

plasmid where the cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase The resulting recombinant plasmid, designated as pGnRH-TBK was used

for the expression of the protein in E.coli strain BL 21

(DE3) The extression was induced by the addition of

IPTG The identity of recombinant protein has been

confirmed on SDS-PAGE by its size with the molecular mass of about 30 kDa and Western blot using rabbit

antiserum against Trichobakin The purification and

biochemical characterization of the recombinant protein is now under study and will be reported in the next papers

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Đinh Duy Kháng