BÁO CÁO KHOA HỌC: "NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO" ppsx

NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc trong chi Camellia đều có hoa to và đẹp, nhiều màu sắc

NHÂN GEN MÃ HOÁ RARN 5,8S Ở LOÀI TRÀ HOA VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO

Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc

trong chi Camellia đều có hoa to và đẹp, nhiều màu sắc

khác nhau, mùa nở hoa của chúng lại đúng vào dịp Tết (từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau) Chính vì vậy tiềm năng kinh tế về mặt làm cây cảnh của các loài trong

chi Camellia là rất lớn, trong số đó các loài Trà hoa vàng

hiện nay đang được đặc biệt quan tâm

Theo những thống kê chưa đầy đủ thì số lượng loài trong

chi Camellia khá lớn (khoảng 300 loài), trong đó nhiều loài

có dạng đồng hình [1] Chính vì vậy việc phân loại chi

Camellia dựa trên các phương pháp phân loại cổ điển như:

phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so sánh, đôi khi gặp phải những khó khăn nhất định, cần phải

có sự hỗ trợ của các phương pháp phân loại hiện đại

Thực tế hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử, phương pháp phân loại phân tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong phân loại học nói chung và phân loại thực vật nói riêng Các nhà khoa học đã chứng minh rằng đối với đối tượng thực vật việc giải trình tự gen mã hoá rARN 5,8S cũng như một số vùng gen khác như ITS1, ITS2, microsatellite là một trong những công cụ hữu hiệu của phân loại phân tử.[3]

Việc phân loại loài Trà hoa vàng Camellia petelotii ở Vườn

Quốc gia Tam Đảo cho đến này vẫn tồn tại hai ý kiến trái ngược nhau: 1 ý kiến cho rằng loài Trà này và loài Trà

Camellia chrysantha ở Trung Quốc chỉ là một, ý kiến khác lại cho rằng 2 loài này là khác nhau và loài Trà Camellia petelotii là loài đặc hữu của Việt Nam, chỉ có ở Vườn Quốc

gia Tam Đảo Đến nay 2 ý kiến này vẫn chưa đi đến thống nhất, vì vậy việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử đối với trường hợp này là cần thiết và sẽ góp phần đưa đến

thống nhất việc phân loại loài Trà Camellia petelotii

Trong bài này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu về

nhân gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii

nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu phân loại phân

Đảo do TS Trần Ninh, bộ môn Thực vật, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp

Các hoá chất và dụng cụ thí nghiệm do các hãng Sigma, Bio - Rad, cung cấp đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật của Samuel S M Sun và cộng sự (1994) [6] có 1 vài thay đổi cho phù hợp với đối tượng

- Phương pháp phát hiện và kiểm tra độ sạch của ADN bằng điện di trên gel agarose [5]

- Phương pháp nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR [5]

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết ADN tổng số từ lá Camellia petelotii

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN theo qui trình sau:

Nghiền 0,75g lá trong Nitơ lỏng, bổ sung 5ml đệm chiết ở 600C (CTAB 2%, NaCl 1,4M,  - mercaptoetanol 0,2%, EDTA 20mM, Tris - HCl 100mM)

Ủ mẫu ở 600C trong 30 phút, bổ sung hỗn hợp Chloroform : Isoamylalcohol (24: 1), trộn đều

Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

Thu pha trên, tủa trong cồn tuyệt đối, rửa tủa bằng cồn 800

Hoà tan tủa bằng đệm TE

Kết quả kiểm tra sự có mặt của AND tổng số được thẻ hiẹn trên hình 1

Hình 1: ADN tổng số chưa loại ARN của loài Camellia

petelotii

Qua hình 1 ta thấy xuất hiện 1 băng ADN đậm có kích thước khoảng 23.1 kb Kích thước này phù hợp với kích thước ADN tổng số ở thực vật chứng tỏ trong dịch chiết có chứa ADN tổng số Tuy nhiên băng ADN còn chưa gọn và phía dưới còn có vệt sáng ARN, vì vậy chúng tôi đã tiến hành loại ARN bằng RNase Kết quả thể hiện trên hình 2

Hình 2: ADN tổng số đã loại ARN của loài Camellia

petelotii

M: Marker - ADN ở cắt bằng Hind III

Giếng 1, 2: ADN tổng số đã loại ARN

Qua hình 2 ta thấy băng ADN tổng số sau khi loại ARN đậm và gọn hơn, đồng thời vệt sáng ARN phía dưới đã

hoàn toàn biến mất Điều đó chứng tỏ ARN trong dịch chiết

đã được loại bỏ hoàn toàn

3.2 Nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR

Để nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S của loài

Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá rARN 5,8S của chi Camellia Cặp mồi này được thiết kế

dựa trên việc so sánh trình tự gen ADNr 5,8S cuả 2 loài

trong chi Camellia đã được công bố trên mạng Internet: Camellia fascicularis và Camellia nitidissima

Cf: Camellia fascicularis

Cn: Camellia nitidissima

Hình 3: So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá

rARN 5,8S ở 2 loài Trà Camellia fascicularis và Camellia

nitidissima

Các trình tự này được xử lý nhờ phần mềm PC - GEN và qua đó có được cặp mồi có kí hiệu và trình tự như sau:

HP1 (mồi xuôi) : 5' GCC CGC CGG GAG CGC GCC

Hình 4: Phổ điện di sản phẩm PCR L: Ladder - Thang ADN chuẩn 100 bp

Giếng 1: Sản phẩm PCR

Kết quả của phản ứng PCR được thể hiện trên hình 4

Qua hình 4 ta thấy chỉ xuất hiện 1 băng ADN duy nhất, đậm, gọn có kích thước gần 500bp, phù hợp với kích thước

mà chúng tôi dự kiến trong quá trình thiết kế mồi Như vậy

có thể nói với cặp mồi này chúng tôi đã nhân thành công

đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii

4 KẾT LUẬN

1 Đã tách chiết được ADN tổng số của loài Trà Camellia petelotii Sản phẩm ADN thu được đủ hàm lượng và độ

sạch cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Đã nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S ở loài Trà

Camellia petelotii với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chi Camellia

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Trần Ninh (2001), Kết quả nghiên cứu phân loại các loài Trà hoa vàng của Việt Nam, Báo cáo tại Hội thảo các loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

2 Albert L Lehninger, David L Nelson, Michael M Cox (1993), Principles of biochemistry, Worth publishers

3 David V Jobes, Lconard B Thien (1997), "A Conserved Motif in the 5,8S ribosomal RNA gene is a useful

diagnostic marker for plant internal transcribed spacer

(ITS) sequences", Plant moleculer biology reporter, (15),

pp 326 - 331

4 Pauline Nicholson (1997), "extraction of DNA from

plant system", Life science news, (23), pp 12 - 14

5 Sambrook J , Fritsch E F., Maniatis T (1989),

Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press

6 Samuel S M Sun (1994), Methods in plant moleculer biology and agricultural biotechnology, Asian Vegetable Research and Developement Center, Taiwan

SUMMARY

The 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species -

Camellia petelotii - in Tam Dao national park

Nguyen Thi Nga, Nguyen Van Mui, Truong Quoc

Phong

Faculty of Biology HaNoi University of Science

Up to now, biologists in the world haven't been agreed be

of classifying the yellow tea species - Camellia petelotii yet Some scientists think that Camellia petelotii and

Camellia chrysantha belong to only one species, others think they are two different species and Camellia petelotii

is endemic to Viet Nam Traditional identification methods can't give out the final opion to stop this argument

Therefore, it's neccessary to classify by the modern

molecular biology techniques Sequencing 5.8S rDNA is one of those techniques

In this article, we expound our results in the 5.8S rDNA

amplification of the yellow tea species - Camellia petelotii

- in Tam Dao national park in order to serve molecular classification techniques

We have extracted total genomic DNA from the leaves of

Camellia petelotii by the method of Samuel S M Sun

(1994) with some small modifications The total genomic DNA product we have obtained is enough quantity and

purification to research in molecular biology Then we used this total genomic DNA as the template to amplify 5.8S rDNA by PCR technique The 5.8S rDNA specific pair of primers in this reaction have designed based on known 5.8S rDNA sequence of two species in Camellia genus which have been published on the Internet Using this pair of

primers, we have amplified 5.8S rDNA of Camellia

petelotii with the length approximately 500bp

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS Trịnh Đình Đạt

SO SÁNH KIỂU NHÂN CỦA LOÀI ANOPHELES

DIRUS Ở ĐẢO HẢI NAM VÀ ANOPHELES DIRUS

PEYTON HARRISON 1979 Ở VIỆT NAM Ngô Giang LiênĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Anopheles dirus là một trong những vectơ truyền sốt rét

chính ở Việt Nam và Đông Nam Á Phần lớn các loài muỗi truyền sốt rét là một phức hợp loài (chứa ít nhất từ hai đến nhiều loài đồng hình) Các loài đồng hình này rất giống nhau về hình thái nhưng thực chất chúng cách ly sinh sản

và thường có đặc điểm sinh học, sinh thái học, tập tính khác nhau do đó vai trò truyền sốt rét không như nhau vì vậy sự đáp ứng với các biện pháp phòng chống cũng khác nhau [2,8] Xác định được chính xác các thành viên của phức hợp loài có một ý nghĩa cho các nghiên cứu về di truyền học, sinh thái học, tập tính, vai trò dịch tễ cũng như trong việc lựa chọn các biện pháp phòng chống thích hợp

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

Anopheles dirus trong nghiên cứu này được PCG.TS

Nguyễn Văn Kim khoa nghiên cứu sốt rét chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh đem từ đảo Hải Nam Trung Quốc về sau

đó TS Trần Đức Hinh bộ môn côn trùng viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng đem trứng về nuôi tại phòng nuôi của viện cho các nghiên cứu Các muỗi cái sau khi hút máu được ép đẻ và nuôi theo từng gia đình Một số bọ gậy tuổi 4 dùng để nghiên cứu kiểu nhân, số khác dùng để chạy điện

di Sử dụng phương pháp nhiễm sắc thể nguyên phân của Baimai [2,3], tiêu bản nhiễm sắc thể sau khi để tủ ấm (370) trong 24 giờ đã được nhuộm bằng Giêm sa và được bảo quản trong hộp đựng tiêu bản [1,2]

Các ảnh nhiễm sắc thể được chụp trên máy ảnh Olympus BH2, dùng film Technical Pal Film có độ nhạy phù hợp [4]

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu

Theo sơ đồ nghiên cứu loài đồng hình (sơ đồ 1) các cá thể

Anopheles dirus được thu thập từ Hải Nam Trung Quốc

được xử lý và phân phối cho những nghiên cứu về hình thái, di truyền tế bào, sinh hoá và tập tính

Sơ đồ về nghiên cứu loài đồng hình

Sử dụng phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể nguyên

phân cho thấy Anopheles dirus cũng như các loài muỗi

khác có kiểu nhân (2n = 6) bao gồm 3 cặp nhiễm sắc thể [2,5] Hai cặp thuộc về nhiễm sắc thể thường, một cặp

thuộc về nhiễm sắc thể giới tính Cặp nhiễm sắc thể thường lớn nhất là cặp có tâm lệch (submetacentric) cặp thứ hai ngắn hơn có đặc trưng tâm giữa (metacentric) Cặp giới tính (X và Y đều là tâm nút) chúng đồng hình ở con cái (XX) à dị hình ở con đực (XY) [4]

Phân tích gần 1500 phiếu trung kì từ hơn 200 mẫu nuôi

theo gia đình chúng tôi nhận thấy Anopheles dirus ở Hải

Nam Trung Quốc cũng có sự đa hình về nhiễm sắc thể giới tính Có năm biến dị: ba biến dị thuộc về nhiễm sắc thể X

và hai biến dị thuộc về nhiễm sắc thể Y đã được tìm thấy

sau hơn 20 đợt phân tích (xem bảng tổng kết số mẫu đã

được xử lý)

Bảng tổng kết số mẫu đã được xử lí

Các biến dị này đều là tâm mút khác nhau chủ yếu về số

lượng cũng như sự phân bố và đặc điểm của những băng dị

nhiễm sắc [3] Trong ba nhiễm sắc thể X được phân tích, nhiễm sắc thể X1 chỉ có 2 băng trong khi đó X2 và X3 lại có

3 băng Ngoài ra độ dài của nhiễm sắc thể cũng là một đặc điểm được xem là một chỉ tiêu để phân biệt [3,5] (hình 1)

Hình 1: Sơ đồ hoá bộ nhiễm sắc thể của Anopheles dirus

Các nhiễm sắc thể Y trên tiêu bản nhuộm màu được dễ

dàng phân biệt với nhiễm sắc thể X bởi đặc điểm hầu như

là dị nhiễm sắc Tính đa hình của nhiễm sắc thể Y thể hiện

ở độ dài của nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) : Y1 nhỏ như một dấu chấm trên tiêu bản còn Y2 có độ dài gấp 4 lần

nhiễm sắc thể Y1 và có thể đo được dễ dàng bằng trắc vi vật kính (hình 2)

Hình 1 - 4: Nhiễm sắc thể kỳ giữa nguyên phân tế bào não

bọ gậy tuổi 4 Anopheles dirus Hải Nam Trung Quoc)

1 - 2: X1X2 (con cái; 3: X3Y2 (con đực) 4: X2Y1 (con đực)

3.2 Thảo luận

Anopheles dirus là một phức hợp loài bao gồm 7 thành viên

khác nhau về kiểu nhân [1,4] về mức độ không hoà hợp di truyền qua phép lai [2,3] và sự khác biệt ADN và các đặc điểm sinh học khác [1,7] Sự phân bố rộng rãi của

Anopheles dirus ở Đông Nam Á khiến cho nhiều nhà

nghiên cứu mất nhiều công sức để xác định thành viên của phức hợp loài Những thành viên này được tìm thấy từ tây

Ấn Độ qua lục địa, Đông Nam Á đến đảo Côn Sơn Việt Nam, đảo Hải Nam Trung Quốc và Đài Loan [1,3] Loài A chỉ có mặt ở vùng trung tâm và Đông bắc Thái Lan, loài D phân bố theo biên giới Thái Burmese và phía bắc của vùng tây Pennisula Loài B chiếm ưu thế ở phía nam của

Pennisula Loài C được tìm thấy ở phần giữa phía đông của Pennisula Loài E được tìm thấy ở Ấn Độ và loài F chỉ xuất

hiện ở biên giới Thái Lan - Mã Lai theo Baimai 1988 [3]

Phân tích kiểu nhân của Anopheles dirus ở Hải Nam Trung

Quốc cho thấy kết quả có nhiều điểm tương đồng với kiểu

nhân của dirus A Peyton và Harrison 1979 Loài Anopheles dirus A đã được nghiên cứu nhiều ở Thái Lan [1] và gần

đây đã được đề cập ở Việt Nam theo Ngô Giang Liên 1996 [6] Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố loài

A này truyền sốt rét mạnh ở Thái Lan vì vậy những biện pháp phòng chống đã sử dụng ở Thái Lan, Trung Quốc có thể áp dụng đối với Việt Nam, Lào, Camphuchia là những nước có cùng vectơ truyền sốt rét Tuy nhiên để có những kết luận chính xác về loài cần phải tiến hành thêm các

nghiên cứu về AND (thông qua kỹ thuật PCR, RAPD -

PCR) [7,8,9,10] Vì trong khuôn khổ của một bài báo, kỹ thuật này sẽ được giới thiệu tiếp trong số ra tới của tạp chí

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến tập thể cán bộ Viện sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi về việc sử dụng mẫu để hoàn thành nghiên cứu trên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Baimai.V, 1988 Geographical distribution and bitting bihaviour of four species of The Anopheles dirus complex (Diptera culicidae / in Thai Lan J Med Dubl Mlth Vol 19: 157 - 158

2 Baimai.V., Harbach R.E and Supratman Sukowati, 1988 Cytogenetic evidene for two sibling species within the

current concept of the malario vector Anopheles

leicophyrus in Socetheast Asia Journal of The American mosquito control asscociation Vol 4 N0 1: 44 - 50

3 Baimai, V., R Rattanarithikul, U Kijchalao and C

A1998 of Thailand and Southeast Asia II The Maculatus Group, Neocellia Series, subgenus Cellia Mosq Syst 25:

5 Lien, n.G., T.G Hoc nand T.D Dat 1992 Study on

mitotic karyotypes of the species complex of anopheles minimus Theobald 9Diptera: Culicidae) in Vietnam, p 511 ln: Proc XIX Int Congr Entomol [Abstract]

6 Ngô Giang Liên / 1996 Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền của một số loài muỗi truyền sốt rét tại một số địa điểm của Việt Nam Luận án TS Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

7 Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A and Collins, F.S (1991) Construction of T - Vectors, a rapid and general

system for direct cloning of unmodified PCR products

Nucl Acids Res 19: 1154

8 Wikerson, R.C., Parsons, T.J., Albright, D.G., Kleln, T.A and Braun, M.J (1993) Random amplified

polymorphic DNA (RAPD) markers distinguish cryptic mosquito species (Diptera: Cullcidae: Anopheles) Insect Molec Biol 1: 205 - 211

9 (1993) Genetic analysis using random amplified

polymorphic DNA markers Meth Enzymol 218: 704 - 740

10 Zheng, L., Collins, F.11., Kumar, V and Kafatos, F.C (1993) A detailed genetic map for the X chromosome of the