BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO" pot

Để nghiên cứu, tìm hiểu các tính chất của FGF-10 và sự biến đổi của nó liên kết với các mạch carbohydrate , chúng tôi đã sử dụng và thiết kế vector pcDNA3.1- Myc-His Invitrogen để biểu h

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI

(HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH

FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Nguyễn Bích Nhi

Viện Công nghệ Sinh học

Masashi Suzuki

National Istitute of Bioscience and Human Technology, Tsukuba, Japan

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast Growth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine, được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phân bào mạnh Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinh

trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạch

máu, sửa chữa và làm lành vết thương (Mc Keehan và

cs., 1998)

Nhiều thành viên của nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệu

peptide mã hóa cho các protein tiết FGF-10 là thành viên thứ 10, dược phát hiện ra bởi Yamasaki và cs., 1996 cDNA của hFGF-10 mã hóa cho một protein gồm 208 acid amin, trong đó 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, là đoạn có vai trò như một tính hiệu peptide (Yamasaki và cs.,

1996, Emoto và cs., 1997 Do đó FGF-10 có thể có khả năng tiết Nhiều thành viên của nhóm FGF như FGF-5

(Bates và cs., 1991; Ozawa và cs., 1998, Clements và cs., 1993), FGF-6 (Asada và cs), FGF-7 (MacArthur và cs., 1995), FGF-9 (Santos - Ocampo và cs., 1996) có chứa vị trí N-glyccosyl và một số thành viên của nhóm FGF được tinh chế ở dạng glycosyl hóa Để nghiên cứu, tìm hiểu các tính chất của FGF-10 và sự biến đổi của nó liên kết với các mạch carbohydrate , chúng tôi đã sử dụng và thiết kế vector pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hiện hFGF-10

ở các tế bào động vật có vú

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ARN tổng số từ não người (Toyobo)

2 Vector tách dòng PCR -TRAP (GenHunter)

3 Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)MycHis Version B

(Invitrogen)

4 Làm sạch sản phẩm PCR: sử dụng PCR QiaQuick PCR Kit (Qiagen)

5 Tách ADN plasmid sử dụng MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem)

6 Xác định trình tự ADN sử dụng thiết bị ABI 310 -

PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thiết kế cặp mồi để biểu hiện hFGF-10 ở tế bào động vật có vú:

Dựa vào trình tự của toàn bộ đoạn gen hFGF-10 (số đăng kí trong Gen Bank là AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhân hFGF-10 đã được thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-) Myc-His để biểu hiện ở tế bào động vật có vú với đầu 5'

gắn thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và đầu 3' gắn

vị trí cắt của enzym HindIII Trình tự cặp mồi như sau:

2 Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) :

Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ)

từ ARN tổng số được tách ra từ não người và cung cấp bởi hãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reverse

transcriptase) đã được tiến hành trong tổng thể tích 50 l với các thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm 5 X RT, 2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithio threitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5l

RNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLV Reverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùng

và 4l ARN tổng số (250 ng/l) Phản ứng được tiến hành

ở 37oC trong 75 phút Sau đó hỗn hợp phản ứng (cDNA đã được tổng hợp) được pha loãng 10 lần bằng nước cất và bảo quản ở -20oC

Phản ứng PCR được tiến hành tiếp theo sử dụng cDNA vừa được tổng hợp làm mẫu (template) để nhân toàn bộ đoạn gen hFGF-10 Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 25l bao gồm: 11l nước cất vô trùng, 2.5l 10 X đệm Pfu, 2l dNTPs (2.5mM), 8l sản phẩm của phản ứng RT

đã pha loãng 10 lần, 0.5l mồi xuôi (10pmol), 0.5l mồi ngược (10pmol) và 0.5l Pfu polymerase (0.5U/l)

Chương trình chạy PCR: các điều kiện để chạy PCR đã được tối ưu hóa như sau: Biến tính ở 94oC trong 2 phút; 40 chu trình : 94oC trong 45 giây, 55oC trong 45 giây và 72oC trong 2 phút; lần kéo dài chuỗi cuối cùng ở 72oC trong 10 phút

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 1% (hình 1) Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy sản phẩm PCR là một băng đậm đặc hiệu, có kích thước khoảng 650 bp tương đương với kích thước của

hFGF-10 có cộng thêm các vị trí cắt của các enzyme giới hạn đã thiết kế Để kiểm tra xem sản phẩm PCR nhận được

có phải là hFGF-10 hay không, sản phẩm PCR sau khi

được tinh chế bằng Qia Quick Kit đã được cắt bằng enzyme

NsiI và ScaI Phản ứng cắt kiểm tra được tiến hành trong

tổng thể tích là 10l với các thành phần như sau: 1l đệm

10X NsiI (hoặc đệm NE-II đối với ScaI), 2l sản phẩm

PCR, 0.8l NsiI enzyme Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37C trong 1 giờ Sản phẩm thủy phân được điện di để kiểm tra trên gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2)

Hình1: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy

số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn

/HindIII

Hình 2 Kiểm tra cắt sản phẩm PCR bằng enzyme ScaI

Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp;

đường chạy số 2: sản phẩm PCR sau khi bị cắt bởi ScaI

Kết quả nhận được ở hình 3 cho thấy sản phẩm PCR sau

khi bị thủy phân bởi enzyme ScaI có 1 điểm cắt trong trình

tự của hFGF-10 tại vị trí 273 sản phẩm PCR sau khi xử lí

ScaI được chia thành 2 băng nhỏ hơn có kích thước khoảng

273 và 357 bp (hình 3, giếng 2) Như vậy sơ bộ có thể cho rằng sản phẩm PCR nhận được có nhiều khả năng là

hFGF-10

2 Tách dòng hFGF-10:

Để kiểm tra trình tự của sản phẩm PCR, vector tách dòng (PCR-TRAP Cloning System, version 3.0- GenHunter

Corporation) Sản phẩm PCR được gắn vào vector TRAP trong tổng số 10l với thành phần sau: 2l PCR-TRAP vector đã chuẩn bị sẵn sàng để gắn các đoạn gen (insert), 1l 10X đệm gắn (ligation buffer), 2.5l sản phẩm PCR và

1l T4 -DNA ligase Phản ứng được tiến hành ở 16C, qua đêm (khoảng 16 giờ) Sau đó hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào các tế bào khả biến chủng vi khuẩn GH với thành phần phản ứng bao gồm: 20l tế bào khả biến GH , 4l hỗn hợp phản ứng trên để ở trong đá (0C) trong 45 phút Sốc nhiệt ở 42C trong 2 phút rồi để ngay vào đá 2 phút và cho thêm vào 0.4 ml môi trường LB (Luria-Bertani) lỏng, trộn đều và nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) tiếp ở 37C trong 1 giờ Sau đó cấy trải dịch nuôi cấy trên lên đĩa petri LB đặc

có bổ sung tetracycline (nồng độ cuối cùng 20 g/ml) Để đĩa petri qua đêm trong tủ ấm 37C qua đêm Hôm sau

kiểm tra đĩa thấy mọc các khuẩn lạc trắng Kiểm tra sự gắn của sản phẩm PCR vào vector bằng cách phân tích khuẩn lạc Lấy một ít khuẩn lạc bằng đầu côn cho vào ống

eppendorf vô trùng có chứa 50l đệm TE (10mM Tris,

1mM EDTA pH8) có bổ sung 0.1% Tween 20 Trộn đều và

ủ ở 95C trong 10 phút Li tâm nhanh Lấy 2l dịch nổi làm mẫu để chạy PCR với thành phần như sau: 2l 10 X đệm PCR, 2ldNTPs (200 mol), 2l mỗi loại Lgh và Rgh mồi được cung cấp bởi Kit, 0.2l Taq DNA polymerase

Chương trình PCR như sau: 30 chu trình của 94C trong 30 giây, 52C trong 40 giây , 72C trong 1 phút; tiếp theo 72C trong 5 phút và kết thúc ở 4C Sau khi chạy PCR, phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1.5% (hình 3)

Hình 3 Điện di phân tích khuẩn lạc bằng phương pháp

PCR Đường chạy số 1: Thang ADN chuẩn /HindIII;

đường chạy số 2,3: sản phẩm PCR của khuẩn lạc 1 và 2; đường chạy số 4:thang ADN chuẩn bậc thang 123 bp

Kết quả phân tích khuẩn lạc cho thấy mẫu ADN của khuẩn lạc 1 cho 1 băng đặc hiệu có kích thước khoảng 770bp

tương ứng với kích thước của đoạn gen hFGF-10 và cộng

120bp là phần thêm của vector TRAP như trong hướng dẫn

sử dụng của vector Như vậy ADN của khuẩn lạc 1 có

mang đoạn gen cần gắn Đối với mẫu khuẩn lạc 2, sản

phẩm PCR là 2 băng có kích thước nhỏ không đúng với kích thước của đoạn gen cần gắn do đó ADN của khuẩn lạc

2 không chứa đoạn gen cần gắn

Sau khi dã xác định được khuẩn lạc 1 có chứa đoạn gen nhân được, khuẩn lạc 1 được nuôi ở môi trường LB lỏng có

bổ sung tetracycline và tách ADN plasmid sử dụng kit

MiniPrep, ADN sau đó được kiểm tra OD260/280nm để định lượng và sử dụng 500 ng để xác định trình tự Kết quả cho thấy sản phẩm PCR nhân được có trình tự ADN hoàn toàn trùng khớp với trình tự của gen hFGF-10 trong ngân hàng gen, số đăng kí AB 002097 DDBJ Như vậy là việc tách dòng gen hFGF-10 đã được thực hiện

4 Gắn gen hFGF-10 vào vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His:

pcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) là vector 5.5 kb được

thiết kế để biểu hiện các protein tái tổ hợp trên tế bào động vật có vú Vector có 3 vị trí đọc để gắn đoạn gen đích với đầu C tận cùng của polypeptide có gắn đuôi Histidine (His tag) và Myc (C-myc) epitope cho phép xác định và tinh chế hiệu quả protein tái tổ hợp Promotor của vector -human cylomegalovirus (CMV) cho phép biểu hiện cao ở nhiều loại tế bào động vật có vú Vector biểu hiện pcDNA3.1(-) Myc-His và vector tách dòng có chứa đoạn gen hFGF-10

cùng được xử lí bằng XhoI và HindIII, sau đó sản phẩm

vector và gen đã xử lí enzyme được kiểm tra trên gel

agarose 1% và tinh chế bằng phương pháp thôi gel, sử dụng Qia Quick Kit Sau khi tinh sạch và xác định hàm lượng, gen được gắn vào vector nhờ phản ứng gắn sử dụng

enzyme T4-ligase với thành phần như sau: 0.75l đệm gắn T4, 3l vector đã xử lí (250ng/l), 3.5l gen hFGF-10

(insert) đã xử lí (60ng/l) và 0.25l T4-ligase Phản ứng được thực hiện ở 16C qua đêm và cấy trải trênaTiếp đó hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào tế bào khả biến DH5 đĩa LB có bổ sung ampicilline (50g/ml) và nuôi trong tủ

ấm 37C qua đêm Các khuẩn lạc được nuôi nhân trong

môi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline và tách ADN plasmid Kiểm tra sự gắn của gen vào vector biểu hiện

pcDNA3.1(-)Myc-His bằng cách xử lí ADN plasmid tách

được bằng 2 enzyme XhoI và HindIII Kết quả được thể

hiện trên hình 4

Hình 4 Các ADN plasmid được xử lí bằng enzyme XhoI và HindIII Đường chạy số 1-5: ADN các plasmid từ 1-5 được

xử lí bằng XhoI và HindIII; đường chạy số 6: Thang ADN

chuẩn bậc thang 123bp

Kết quả trên hình 4 cho thấy chỉ trừ các plasmid số 4

(đường chạy 4) là không chứa đoạn insert, các plasmid còn lại đều có chứa đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp

tương ứng với hFGF-10 Như vậy việc gắn hFGF-10 vào

vector biểu hiện pcDNA3.1(-)myc.his đã thành công ADN của các plasmid này đã được sử dụng để chuyển gen

hFGF-10 vào tế bào động vật có vú (Cos-7- tế bào thận khỉ) sử dụng các hóa chất chuyển gen (Lipo Fectamin-2000,

SuperFect )

KẾT LUẬN

1 Đã tách dòng được gen hFGF-10 từ ARN tổng số não người bằng phản ứng RT-PCR

2 Đã thiết kế được vector biểu hiện pcDNA3.1(-)Myc-His

có gắn đoạn gen hFGF-10 để biểu hiện ở tế bào động vật có

vú

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Asada M., Yoneda A., Oda Y., Ota K., Ozawa K.,

Fukuta K., Omae M., Orikasa N., Suzuki M., Oka S.,

Makino T and Imamura T (1999) Growth Factor 16,

293-303

2.Bates B., Hardin J., Zhan X., Drickamer K., and Goldfarb M.(1991) Mol.Cell Biol 11,1840-1845

3 Clements D.A., Wang J.K., Dionne C.A and Goldfarb

M (1993)Oncogene 8, 1311-1316

4 Emoto H., Tafashira S., Mattei M.G and Yamasaki M, (1997) J Biol Chem Vol 272, No.37, 23191-23194

5 Hsu Y.R., Hsu E.W., Katta V., Brankow D., Tseng J., Hu S., Morris C.F., Kenney W.C and Lu H.S (1998) Protein Expr.Purf 12, 189-200

6 MacArthur C.A., Lawshe A., Shankar D.B.,

Heikinheimo M., Shackleford G.M (1995) Cell Growth Differ 6,817-825

7 McKeehan W.L., Wang F and Kan M (1998)

Prog.Nucleic Acid Res Mol Biol 59 135-176

8 Revest J.M., DeMoerlooze L and Dickson C (2000) J.Biol.Chem 275, 8083-8090

9 Santos-Ocampo S., Colvin J.S., Chellaiah A and Ornitz D.M (1996) J.Biol.Chem 19, 1726-1731

10 Yamasaki M., Miake A., Tagashira S and Itoh N

(1996) J.Biol.Chem 271,15918-15921

11 Yoneda A., Asada M., Suzuki M and Imamura T

(1999)Biotechniques 27, 576-590

SUMMARY

Construction of mammalian expression vector For

human fibroblast growth factor-10 (hfgf-10)

Nguyen Bich Nhi

Institute of Biotechnology (IBT), NCST

Masashi Suzuki

National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Tsukuba, Japan

Full length human Fibroblast Growth Factor (hFGF-10) cDNA (650 bp) was amplified from human brain total

RNA (Toyobo) by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using synthetic oligonucleotide primers These primers contain sequences that flank both ends of the full length hFGF-10 (amino acid 1-208) with additional XhoI and HindIII sites located at their 3’ and 5' ends,

respectivetly The amplified product was sub-cloned into the PCR-TRAP (GenHunter) cloning vector and the DNA sequence was verified by ABI310-PRISM Genetic

Analyzer as the hFGF-10 (acession number AB 002097 in the DDBJ and GenBank Nucleotide Sequence Databases) For expression of recombinant hFGF-10 protein in

mammalian cells, we used an expression vector,

pcDNA3.1(-)Myc-His (Invitrogen) which is designed to introduce a C-terminal peptide containing a myc sequence and polyhistidine metal -binding sequence tags into the target protein for efficent detection and purification The

amplified product was digested with XhoI and HindIII

restriction enzymes, purified by QiaQuick Kit (Qiagen) and

was ligated at XhoI and HindIII sites of the corresponding

sites of the enzyme-digested pcDNA3.1(-)Myc-His vector

to allow production of recombinant protein in mammalian cells from T7 promoter The ligation product then was

transformed into the DH5- competent cells and cultured at 37C overnight The plasmid DNAs were extracted from the culture of white colonies by using MiniPrep Kit (PE Applied Biosystem) and the recombinant expression

pcDNA 3.1(-) Myc-His vector bearing hFGF-10 gene was

confirmed by XhoI/HindIII enzyme digestion of plasmid

DNAs

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị Ngọc Dao