BÁO CÁO KHOA HỌC: "SƠ BỘ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ MỒI ĐỂ XÁC ĐỊNH HUYẾT THỐNG Ở NGƯỜI" ppsx

Người con có hai băng trong đó một băng dưới trùng với băng của bố còn một băng trên trùng với băng của mẹ, điều đó chứng tỏ người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ, hai alen n

SƠ BỘ NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ MỒI ĐỂ XÁC ĐỊNH HUYẾT THỐNG Ở NGƯỜI

Phạm Hải Sáng, Nguyễn Văn Mùi

Trường Đại học khoa học tự nhiên

I Đặt vấn đề

Công nghệ gen đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, song trong khoa học hình sự trên thế giới được biết đến lần đầu tiên vào năm 1985 nhờ công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và các cộng sự Đây là một công nghệ có tính đột phá trong khoa học hình sự, giúp giải quyết một số

vụ án tưởng chừng như bế tắc [7] Hiện nay, các phòng thí nghiệm tiên tiến trên thế giới đã xác định huyết thống

người bằng phức hợp 10, 14, thậm chí 16 mồi Ở nước ta, việc giám định gen trong xác định huyết thống mới đã được thực hiện ở một số nơi Trung tâm Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội nghiên cứu xác định huyết thống, xác lập cây phả hệ người [4] Viện Khoa học hình sự - Bộ

công an đã sử dụng phức hợp 10 mồi [2,3] và đang tiến hành giám định gen sử dụng hệ (9 gen) nineplex xác định tội phạm Ngoài ra còn có một số cơ sở khoa học đặt vấn đề nghiên cứu, có tính chất điều tra thăm dò mà chưa có tính phổ cập và ứng dụng rộng rãi Tuy nhiên, sự phân tích

nhiều mồi khá tốn kém vì đòi hỏi phải có máy móc hiện đại Vì vậy, chúng tôi thử nghiên cứu sử dụng một số cặp mồi để giám định huyết thống nguời Việt Nam

Như chúng ta đã biết, ở người qua qúa trình thụ tinh, người con bao giờ cũng nhận 23 NST từ bố thông qua tinh trùng và 23 NST từ mẹ thông qua trứng Như vậy hệ gen của người con bao giờ cũng có một nửa có nguồn gốc từ bố

và một nửa có nguồn gốc từ mẹ[1,5] Các locut dùng để xác định huyết thống là các đoạn lặp lại ngắn ( STR – Short Tandem Repeats ) [9,10] Các đoạn lặp lại ngắn này có

chiều dài từ 2 đến 6 nucleotit[13] và ở mỗi cá thể có số lần lặp lại khác nhau, do vậy các locut này có tính đa hình cao nên rất có giá trị để phân biệt cá thể

Để xác định huyết thống bằng phương pháp nhân cặp

mồi đơn ở đây chúng tôi sử dụng 4 cặp mồi TH01, F13A, vWA, FES để nhân bản 4 đoạn gen tương ứng

II Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

1 Nguyên liệu và hoá chất

Mẫu máu, tóc của bố, mẹ, con của 3 gia đình

Các cặp mồi:

+ TH01:

• Nằm ở intron 1 của gen tyrozin hydroxylaza người định vị trên nhánh ngắn NST 11, có 20 alen Số các đoạn STR

trong locus TH01 dao động từ 3 – 14

• Trình tự lặp lại:AATG

• Kích thước alen: 152 – 196[11]

+ FES:

• Nằm ở intron thứ 5 của gen tiền ung thư, định vị trên

nhánh dài của NST 15, có 9 alen

• Trình tự lặp lại: ATT

• Kích thước alen: 206 – 238[11]

+ F13A:

• Nằm trên nhánh ngắn của NST số 6, có 16 alen

• Trình tự lặp lại: AAAG

• Kích thước alen: 179 – 235[11]

+ vWA:

• Nằm trên nhánh ngắn NST số 12, có 20 alen

• Trình tự lặp lại: TCTA

• Kích thước alen: 179 – 235 bp[11]

Cùng các hoá chất và thiết bị của các hãng Sigma,

Pharmacia đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu sinh học phân tử

2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Chelex[11]

- Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế[1]

- Phản ứng PCR [6]

- Kỹ thuật điện di gel polyacrylamit [12]

- Kỹ thuật nhuộm bạc [12]

III Kết quả và thảo luận

1 Định lượng ADN

Sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp sử dụng chelex ADN được định lượng bằng máy đo quang phổ Kết qủa

OD thu được, tính theo công thức:

CADN(g/ml) = OD260 x độ pha loãng x 50g

Các mẵu ADN tách chiết có độ sạch (OD260nm/OD280nm)

từ 1,52 – 1,75, đủ để làm phản ứng PCR

2 Phản ứng PCR

Mẫu ADN đã đủ độ sạch đem thực hiện phản ứng PCR với nồng độ các chất và điều kiện phản ứng thích hợp

Mồi TH01, FES, vWA: 950C – 5 phút, (600C – 1 phút,

720C – 1 phút 30 giây, 940C – 1 phút) x 30 chu kỳ, 600C –

30 phút

Mồi F13A: 950C – 5 phút, (570C – 1 phút, 720C – 1 phút 30 giây, 940C – 1 phút) x 30 chu kỳ, 570C – 30 phút

Sản phẩm PCR thu được đem điện di trên gel polyacrylamit 8%, sau đó nhuộm bạc, kết qủa thể hiện ở các hình 1,2,3

Hình 1 : các locus TH01, vWA, FES, F13A

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC: đối chứng

Qua hình 1a dựa vào ADN thang chuẩn 100 bp, ta thấy sản phẩm PCR nhân lên nằm trong khoảng từ 100 – 200 bp, đúng với kích thước alen của locus TH01 Ta thấy ở locus TH01 của gia đình 1 người bố và người mẹ đều có 2 băng (dị hợp tử) Người con có một băng trùng với băng của bố

và một băng trùng với băng của mẹ, điều đó chứng tỏ rằng người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ Hai alen này có kích thước khác nhau nên người con mang

locus TH01 ở trạng thái dị hợp tử

Qua hình 1b cho thấy, ở locus vWA của gia đình 1 người

bố và người mẹ đều có một băng với kích thước bằng nhau (đồng hợp tử) Người con có hai băng trong đó một băng dưới trùng với băng của bố còn một băng trên trùng với băng của mẹ, điều đó chứng tỏ người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ, hai alen này có kích thước khác nhau nên người con mang locus vWA ở trạng thái dị hợp

tử

Qua hình 1c cho thấy, ở locus FES của gia đình 1 người bố

và người mẹ đều có một băng với kích thước bằng nhau (đồng hợp tử) Người con cũng chỉ có một băng và trùng với băng của cả bố và mẹ, điều đó chứng tỏ rằng người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ, nhưng vì hai alen này có kích thước bằng nhau nên người con chỉ có một băng tức là mang locus FES ở trạng thái đồng hợp tử

Qua hình 1d cho thấy, ở locus F13A của gia đình 1 người

bố và người mẹ đều có 2 băng (dị hợp tử) Người con có một băng dưới trùng với 1 băng của bố và một băng trên trùng với một băng của mẹ, điều đó chứng tỏ rằng người con nhận một alen của bố và một alen của mẹ Hai alen này

có kích thước khác nhau nên người con mang locus F13A ở trạng thái dị hợp tử

Như vậy, Qua hình 1 cho thấy ở cả 4 locus TH01, vWA, FES, F13A người con đều nhận một alen từ bố và một alen

từ mẹ Điều này cho phép kết luận rằng 3 người này có

quan hệ huyết thống với nhau

Hình 2: Các locus TH01, vWA, F13A, FES của gia đình 2

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC: đối chứng

Qua hình 2a cho thấy người bố xuất hiện 2 băng, người mẹ chỉ xuất hiện một băng trùng với băng dưới của bố, điều đó thể hiện người bố mang locus TH01 ở trạng thái dị hợp tử còn người mẹ ở trạng thái đồng hợp tử Người con xuất hiện một băng duy nhất trùng với băng dưới của bố và của

mẹ Điều này chứng tỏ người con đã nhận một alen từ bố

và một alen từ mẹ Người đàn ông đối chứng (ĐC) có một băng duy nhất (đồng hợp tử) không trùng với băng của người con chứng tỏ người đàn ông đối chứng và người con không có quan hệ huyết thống với nhau

Qua hình 2b cho thấy cả bố và mẹ đều xuất hiện 2 băng nghĩa là đều dị hợp tử, người đang ông đối chứng (ĐC) có một băng duy nhất chứng tỏ đồng hợp tử Người con có 2 băng (dị hợp tử) do nhận một băng trên của bố và có băng dưới là do nhận từ mẹ, không có băng nào trùng với băng của người đàn ông đối chứng, chứng tỏ đối chứng và người

con không có quan hệ huyết thống với nhau

Qua hình 2c cho thấy bố có 2 băng và mẹ 2 có 1 băng , người con 2 nhận 1 alen từ bố và 1 alen từ mẹ 2 Do 2 alen này có kích thước bằng nhau nên người người con 2 có 1 băng (đồng hợp tử)

Ở gia đình số 3 người cả bố và mẹ đều có một băng

(đồng hợp tử) Người con có 2 băng, băng trên trùng với băng của người bố còn băng dưới trùng với băng của người

mẹ, hai băng này có kích thước khác nhau nên người con mang locus FES ở trạng thái dị hợp tử Người đàn ông đối chứng có một băng trùng với băng dưới của người con

nhưng do người con đã nhận băng này từ người mẹ nên có thể kết luận người đàn ông đối chứng và người con không

có quan hệ huyết thống với nhau

Qua hình 2d cho thấy người bố xuất hiện 2 băng (dị hợp tử), người mẹ chỉ xuất hiện một băng (đồng hợp tử) Người con xuất hiện 2 băng, băng trên trùng với băng trên của bố

và băng dưới trùng với một băng của mẹ Điều này chứng

tỏ người con nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ Người đàn ông đối chứng có 2 băng (dị hợp tử) nhưng không có băng nào trùng với người con chứng tỏ người đàn ông đối chứng và người con không có quan hệ huyết thống với

nhau

Như vậy, qua hình 2 ở cả 4 locus TH01, vWA, FES, F13A người con đều nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ Điều này cho phép kết luận rằng 3 người này có quan hệ huyết thống với nhau

Hình 3: Các locus FES, TH01, vWA, F13A của gia đình 3

L: thang ADN chuẩn 100 bp, B: bố, M: mẹ, C: con, ĐC: đối chứng

Hình 3a cho thấy ở gia đình số 3 người cả bố và mẹ đều có một băng (đồng hợp tử) Người con có 2 băng, băng trên trùng với băng của người bố còn băng dưới trùng với băng của người mẹ, hai băng này có kích thước khác nhau nên người con mang locus FES ở trạng thái dị hợp tử Người bố đối chứng có một băng trùng với băng dưới của người con nhưng do người con đã nhận băng này từ người mẹ nên có thể kết luận người đàn ông đối chứng và người con không

có quan hệ huyết thống với nhau

Qua hình 3b cho thấy ở người bố xuất hiện 2 băng, người

mẹ chỉ xuất hiện một băng thể hiện người bố mang locus TH01 ở trạng thái dị hợp tử còn người mẹ ở trạng thái đồng hợp tử Người con xuất hiện một băng duy nhất trùng với băng trên của bố và băng của mẹ Điều này chứng tỏ người con đã nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ

Qua hình 3c cho thấy cả bố và mẹ đều xuất hiện 2 băng nghĩa là đều dị hợp tử Người con có một băng trên trùng với băng dưới của bố, một băng dưới trùng với băng trên của mẹ, 2 băng này kích thước khác nhau nên người con ở

trạng thái dị hợp tử Vậy người con nhận một alen từ bố và một alen từ mẹ

Qua hình 3d cho thấy, ở locus F13A của gia đình 3 người

bố và người mẹ đều dị hợp tử (có 2 băng) Người con có một băng trùng với bố và một băng trùng với mẹ, điều đó chứng tỏ người con nhận một alen của bố và một alen của

mẹ Hai alen này có kích thước khác nhau nên người con ở trạng thái dị hợp tử

Như vậy, qua hình 3 cho thấy ở cả 4 locus TH01, vWA, F13A, FES người con đều nhận một alen từ bố và một alen

từ mẹ Điều này cho phép kết luận rằng 3 người này có quan hệ huyết thống với nhau

IV Kết luận

1- ADN tách từ máu và tóc có đủ độ tinh khiết để nhân các cặp mồi TH01, vWA, FES, F13A

2- Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân 4 cặp mồi TH01,

vWA, FES, F13A đối với ADN tóc và máu của người Việt Nam

3- Trong mỗi gia đình phân tích bằng 4 cặp mồi TH01,

vWA, F13A, FES thì đều thấy có liên quan về huyết thống

4- Một trường hợp lấy người đàn ông khác làm đối chứng (hình 2a, 2b, 2d, 3a) thì không thấy có quan hệ huyết thống

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1998), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội, tr 7 - 11

2- Trần Văn Đôn (1999), "Góp phần nghiên cứu một số dấu

di truyền người phục vụ công tác xác định huyết thống” , Tạp chí thông tin bộ nội vụ, số12, tr 4 - 8

3- Hà Quốc Khanh (1999), Nghiên cứu và ứng dụng quy trình kỹ thuật giám định gen từ dấu vết máu người trong điều kiện Việt Nam, Hà Nội

4- Lê Đình Lương, Lưu Xuân Hoà, Nguyễn Xuân Hùng,

Trịnh Đức Anh (2003), Nghiên cứu xác định dấu AND ở người Việt bằng các locut trên nhiẽm sắc thể giới tính,

Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống Hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học Huế

5- Budowle B., Giusti AM., Wage JS., Baechtel FS.,

Fourney RM., Adams DE., Fresley LA et al (1991), Am J Hum Genet, (48), 841-855

6- Henry A.erlich (1989), "PCR Technology: principles and application for DNA amplification” , Am J Hum Genet , (55), 175

7- Jobertson J., Ross A M., Burgoyne A L (1990), DNA

in Forensic Science, Ellis Horwood Limited, 119 - 120 (1960), oxyribonucleic acid”, Sience, tr 129 - 131.8-

Kornberg A Biologycal synthesis of de

9- Promega Corp (1996), GenePrintTMSTR Systems

Technical Manual, USA, tr.12 - 13

10- Promega (1999), Technical manual - Geneprint

fluorescent STR system, USA

11- GenBank http ://

www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/genbank

STRase http :// ibm4.carb.nist.gov:8800/dna/home.htm 12- Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989),

Molecular cloning , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol (1), 6.3 - 6.17

13- D.,Urquhart A J., Oldrod N J., Downes T., Baber M Selection of STR Alliston -Greiner R., Kimton C P., Gill

P D (1996), loci for forensic identification system”,

Advances in forensic Haemogenetics, Volume6, 115 - 117

SUMMARY

Applified single pairs of primer to human descent

determination

Pham Hai Sang, Nguyen Van Mui

Faculty of Biology, Hanoi University of science

Researching some encoded DNA products is to have only eliminated effect on descent determination, not to exactly determine actual parent It’s necessary to use PCR and gene technology techniques to resolve this problem

Human total genomic DNA is extracted from blood and hairs by chelex DNA is quantified by spectrometric

method Extracted DNA is pure enough to run PCR

reactions PCR products are analysed by polyacrylamide gel electrophoresis and detected by silver stain

In this experiment, TH01, FES, F13A, vWA loci are used These loci are valuable to discriminate individual,

especially to determine descent relationship since they have length polymorphism characteristics

When analysis blood DNA of another man, he used for control with four primers TH01, vWA, FES and F13A by PCR, show that he have not been bloodline relations with three study families Because, we can applied four primers before for Vietnamise study bloodline

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS Trịnh Đình Đạt