Cải tiến sản lượng Cephalosporin C bằng ADN tái tổ hợp được hợp nhất trong Acremonium chrysogenum

Kháng sinh là một nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong y học điều trị các bệnh viêm nhiễm do vi sinh vật gây ra.

CHUYÊN ĐỀ:

«CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C

BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM»

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Minh Hằng

Nhóm sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Kim Liên

Nguyễn Thị Huyền Cấn Đỗ Tuần

Hoàng Tiến Quyên Trần Đức Tài

«CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP

ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM»

1. Đặt vấn đề

2. Tổng quan

3. Nội dung và phương pháp

4. Kết luận

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh là một nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong y học điều trị các bệnh viêm nhiễm do vi sinh vật gây ra

Áp dụng các kĩ thuật di truyền đã cải thiện quy trình tìm kiếm các chủng cho sản lượng cao.

Từ đó cho phép tạo ra chủng nấm

Acremonium chrysogenum mang ADN tái

tổ hợp cho sản lượng kháng sinh cao trong quy trình sản xuất.

Các gen được hợp nhất trong chủng

Acremonium chrysogenum là các gen quan

trọng trong con đường sinh tổng hợp CPC:

cefEF, cefG ,vgb

SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG

SINH

Hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh

của vi khuẩn Bacillus anthracis (Pasteur

và Joubert, 1877)

1 chế phẩm tách từ nấm mốc dùng để

điều trị các bệnh truyền nhiễm trên da

do cầu khuẩn gây ra (Gratia và đồng

nghiệp, 1925)

SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG

những người bị thương với số lượng lớn.

Các nhà khoa học nhận thấy rằng không chỉ các vi sinh vật mà cả thực vật, động vật cũng có khả năng sinh kháng sinh.

SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG

SINH

Từ thực tế đó, Glasby(1976) đã đưa ra định nghĩa về chất kháng sinh: “ Một chất kháng sinh là một hợp chất được tổng hợp ta từ cơ thể sống và ức chế quá trình sống của vi

sinh vật ngay ở nồng độ thấp”

Trong số đó thì kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng nhiều và phổ biến nhất

Các Cephalosporin C là kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm β-lactam hiện đang được sử dụng rộng rãi vì phổ kháng khuẩn rộng và ít độc với con người

SƠ LƯỢC VỀ KHÁNG SINH

Cephalosporin C gồm các thế hệ 1,2,3,4 Trong đó sử dụng nhiều là CPC thế hệ 1,2,3 còn thế hệ 4 được sử dụng hạn chế.

Chủng vi nấm được sử dụng để sản xuất

CPC trong công nghiệp là Acremonium

chrysogenum (Cephalosporium

acremonium).

NẤM MỐC ACREMONIUM

CHRYSOGENUM.

Acremonium chrysogenum được dùng chủ yếu để

sản xuất CPC trên quy mô công nghiệp.

Cephalosporium là một chi thuộc nấm bất

toàn (Deuteromycetes).

Căn cứ vào đặc điểm của sinh sản hữu tính,

thấy đó là các nấm thuộc chi Emericellopis trong chi nấm túi (Ascomycetes).Chi này còn

có tên khác là Peyronellula hoặc

Saturnomycetes.

NẤM MỐC ACREMONIUM

CHRYSOGENUM

Đặc điểm chủ yếu của Acremonium

chrysogenum:

 Khuẩn lạc có hình dạng khác nhau trên môi

trường tổng hợp hoặc môi trường thạch –

glucose – khoai tây

Màu sắc của khuẩn lạc Cephalosporium sp có

thể là màu đỏ nhạt, đỏ thẫm trắng, màu tro hoặc màu vàng

NẤM MỐC ACREMONIUM

CHRYSOGENUM

Khuẩn lạc khá chặt, sinh trưởng nhanh

trên môi trường thạch – glucose – khoai tây, ban đầu màu trắng sau chuyển dần

NẤM MỐC ACREMONIUM

CHRYSOGENUM

Các bào tử trần tụ lại thành khối chất

nhày, khi gặp nước thì tan ra Cuống bào

tử trần ngắn, thẳng, không phân nhánh, không có vách ngăn, dạng gần tròn, hình trứng hoặc oval

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐƯỢC SỬ DỤNG:

 Thành phần của môi trường YPS (%):

Thành phần môi trường thạch – glucose – khoai tây (g/l):

CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP CPC

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Tạo chủng Acremonium chrysogenum

mang ADN tái tổ hợp

2. Quy trình sản xuất CPC

3. Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng

A.chrysogenum mang gen tái tổ hợp

TẠO CHỦNG ACREMONIUM CHRYSOGENUM MANG ADN TÁI TỔ HỢP

Bước 1: Tách ADN tổng số từ khuẩn ty

của nấm Acremonium chrysogenum bằng

phương pháp tách chiết ADN

Bước 2: Nhân dòng cefEF, cefG bằng kĩ

thuật PCR

Bước 3: Tạo chủng Acremonium

chrysogenum tái tổ hợp

Bước 4: Kiểm tra các chủng biến nạp

bằng kĩ thuật lai Southern

1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG

 Thu nhận mẫu từ đất, nước, bùn.

 Sử dụng YPS và môi trường thạch – glucose – khoai tây được bổ sung Cephalosporin C (CPC) nhằm ức chế các chủng nấm và vi

khuẩn khác không có khả năng kháng lại

2.BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA GIỐNG

Giống được bảo quản trong glycerin vô

trùng, và có thể dung ngay trong ống

nghiệm bảo quản để nhân giống gốc

trong sản xuất CPC bằng chủng này

Để bảo quản lâu dài sử dụng phương

pháp đông khô là tốt nhất

Giống được hoạt hóa trên máy lắc 3-4 ngày

(28oC, 200vòng) trước khi đưa vào môi trường lên men

3 LÊN MEN SẢN XUẤT

Tiến hành lên men theo 2 pha:

 Pha đầu: nuôi thu sinh khối trong 2 – 3 ngày, nhiệt độ: 20 – 300C, pH: 6,5 – 6,8

 Pha sau: lên men thu sản phẩm, nhiệt độ: 22 – 250C, pH thường thấp hơn pha

đầu do tạo ra ở các pha đầu là các acid,

thời gian lên men từ 5 – 7 ngày, chất phá bọt thường được sử dụng: mỡ lợn, dầu

thực vật…

4 TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN

CHỦNG A.CHRYSOGENUM MANG GEN

TÁI TỔ HỢP Phải đảm bảo các yếu tố môi trường như:

 Nguồn Carbon: nguồn glucose và rỉ đường là nguồn

cacbon tốt nhất cho quá trình nhân giống chủng

A.chrysogenum Lượng sinh khối hình thành sau 96h

trong điều kiện nuôi cấy lắc đạt 8,35-8,50mg/ml.

 Nguồn Nitơ:casein thủy phân, các muối amoni sunphat

và amoni clorua có tác dụng tốt tới quá trình lên men sinh tổng hợp CPC.

 Ngoài ra còn có bột đậu tương cũng là nguồn nitơ có giá trị cao, acid gluctamic: 19,46%, acid aspartic: 3,89%,

cystein: 1,12%, gluxit:22-35,5% , 1 số vitamin và muối khoáng.

MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

Ngoài ra còn cần chú ý đến các điều kiện khác như:

Thời gian nhân giống thích hợp cho lên men CPC là 96h

Độ thông khí: do A.chrysogenum là sinh vật

hiếu khí bắt buộc nên lượng môi trường trong bình lên men thích hợp nhất là 10% thể tích

bình lên men

86-Việc tìm thấy điều kiện lên men tối ưu cho

chủng nấm Acremonium chrysogenum mang

ADN tái tổ hợp cũng có vai trò rất lớn trong

quy trình sản xuất CPC bằng phương pháp lên men chìm

KẾT LUẬN

 CPC được điều chế bằng phương pháp lên

men sinh tổng hợp bằng chủng Acremonium

chrysogenum tuy nhiên hoạt tính kháng

khuẩn không cao bằng các CPC bán tổng

hợp Để sản xuất các CPC bán tổng hợp có

giá trị chữa bệnh cao phải chuyển hóa kháng sinh này thành “nhân” 7-ACA từ đó bán tổng hợp thành kháng sinh mới

 Quá trình sinh tổng hợp CPC bán tổng hợp có thể bằng con đường enzym và con đường hóa học Quá trình được mô tả qua sơ đồ sau: