Chọn nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6

Probiotic là những vi sinh vật dưới dạng sản phẩm thực phẩm hoặc chất bổ sung có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ.

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn PGS TS LÊ THANH MAI, người đã tận tình động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo hướng dẫn ThS HỒ PHÚ

HÀ đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm đã cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học đại học

Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè, những tình cảm tốt đẹp nhất vì sự động viên, quan tâm, giúp đỡ của mọi người dành cho em trong thời gian làm luận văn

Sinh viên

Trần Minh Trang

TÓM TẮT

Probiotic là những vi sinh vật dưới dạng sản phẩm thực phẩm hoặc chất bổ sung có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ

Chủng Lactobacillus fermentum HA6 có tác dụng kháng vi nấm, ức chế sự tăng sinh

của các tế bào ung thư nên được dùng làm chế phẩm probiotic Tuy nhiên, việc thu

hồi sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 nuôi trên môi trường MRS rất

đắt tiền, không phù hợp với điều kiện Việt Nam Để giảm giá thành sản phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm môi trường mới thích hợp cho sự phát triển của chủng

Lactobacillus fermentum HA6 với tỷ lệ tiếp giống 2 g/l, đường Saccaroza hàm lượng

40 g/l, thay thế 50% Nitơ bằng dịch nấm men thủy phân, nuôi ở điều kiện pH = 6.1, yếm khí 5% CO2

SUMMARY

Probiotics are defined as living microorganisms in forms of food or supplement

in sufficient number, which colonize in a compartment of the host and express health

benefits to the host One of the potential strain is Lactobacillus fermentum HA6 which

was found to have antifungal activity and the inhibitory toward proliferation of cancer

cells However, taking Lactobacillus fermentum HA6 biomass on MRS culture is very

expensive and not fit well with Vietnamese condition In order to decrease the price of the product, we have studied new suitable culture with the initial concentration 2 g/l, Sucrose 40 g/l, replace 50% of Nitrogen by yeast hydrolysis solution, pH = 6.1, in anaerobic 5% CO2 condition Results show the good development of Lactobacillus fermentum HA6.

MỤC LỤC

I.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 3 I.1.4 Một số đặc điểm của Lactobacillus và L.fermentum 4

I.2.2 Dạng chế phẩm và ứng dụng của probiotic 8

I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối

của vi khuẩn lactic.

I.3.2.3 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh

trưởng

15

I.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh 17

trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

19

III.1. Đặc tính của chủng Lactobacillus fermentum HA6 29

III.2 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình

tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6

32

III.2.1 Lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình tạo

sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6

32

III.2.2 Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy

của chủng Lactobacillus fermentum HA6

37

III.2.3 Động học của quá trình sinh trưởng và phát triển của

5 HS: Hiệu suất thu hồi sinh khối

6 HLA: Hàm lượng axit

7 HLD: Hàm lượng đường sót

8 KpH: Không duy trì pH

MỞ ĐẦU

Các vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong tự nhiên nói chung và ngành thực phẩm nói riêng, đồng thời là loại vi sinh vật được nghiên cứu rất nhiều từ trước tới nay

Qua nhiều thế kỉ, người tiêu dùng biết đến những sản phẩm thực phẩm góp phần cải thiện và nâng cao sức khoẻ con người như: sữa chua, pho mát hay thuốc uống: men tiêu hoá Những sản phẩm đó chứa nhiều vi sinh vật sống có lợi đặc biệt là

vi khuẩn lactic [15]

Năm 1989 Parker đã đưa ra định nghĩa:”Probiotics là những vi sinh vật dưới dạng thực phẩm hoặc chất bổ sung, có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khoẻ vật chủ” [15]

Elie Metchknikoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic Nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấy chế phẩm probiotic đã tạo ra những thay đổi về khu hệ vi sinh vật trong đường ruột theo hướng cân bằng có lợi, trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số lượng các vi khuẩn có khả năng gây bệnh giảm mạnh [5] Thuật ngữ probiotic ra đời từ đây Probiotic có nghĩa là tăng cường sự sống, người ta giả thiết probiotic có lẽ do ghép hai chữ tiếng anh: prophylaxia-phòng bệnh và biotic-sự sống [5]

Trong đó Lactobacillus fermentum là vi khuẩn an toàn, có khả năng kháng vi

sinh vật gây hại, hỗ trợ vi khuẩn có ích nên được ứng dụng vào chế phẩm probiotic

Hiện nay, ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic hầu hết phải nhập ngoại với giá cao chưa đáp ứng đủ nhu cầu của người tiêu dùng Một yêu cầu cấp thiết đặt ra là phải nghiên cứu thu hồi sinh khối vi khuẩn lactic với hiệu suất thu hồi cao đồng thời đảm bảo hiệu quả kinh tế để có thể sản xuất với quy mô lớn

Với muc đích như vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Chọn nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng

Lactobacillus fermentum HA6.

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Vi khuẩn lactic

I.1.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic (LAB):

Vi khuẩn lactic là gì? Một câu hỏi lớn đặt ra cho các nhà khoa học nghiên cứu

để có câu trả lời đồng nhất Trở lại lịch sử của thời kì trước thế kỉ 20, thuật ngữ vi khuẩn lactic được sử dụng để chỉ những vi khuẩn làm chua sữa Năm 1873 J.Lister

lần đầu tiên đã phân lập đươc một loại vi khuẩn đặt tên là “Bacterium lactis” (hay có thể gọi là Lactococcus Lactis) Khi nghiên cứu về việc phân loại vi khuẩn lactic người

ta đã tìm thấy những nét tương tự giữa vi khuẩn lactic trong sữa và các vi khuẩn trong các sản phẩm chứa axit lactic khác như thịt, rượu vang, và các loại vi khuẩn lactic có ích trong đường ruột [16]

Trong các định nghĩa trước đây thì vi khuẩn lactic được coi là nhóm vi khuẩn

có khả năng lên men và đông tụ sữa, bao gồm cả vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn

lactic Năm 1901, Beijernick đã miêu tả sinh vật có tên lactobacillus là dạng vi khuẩn

G(+) và phân biệt hẳn vi khuẩn đường ruột với vi khuẩn lactic Chúng là một trong những vi khuẩn lactic hữu ích nhất, hầu hết được tìm thấy trong bộ máy tiêu hoá

Bước vào thế kỉ 20 sự quan tâm về Lactobacillus xuất hiện trong thực đơn con

người tăng lên khi Elie Metchnikoff ở viện Pasteur Paris phát triển và ứng dụng loại

vi khuẩn này để bổ sung vào khẩu phần ăn nhằm ngăn ngừa và chữa bệnh Nhưng lý thuyết của ông về việc kéo dài sự sống và sự khoẻ mạnh nhờ vào việc ăn dạng thực phẩm chứa vi khuẩn này đã gây tai tiếng cho ông Bởi tác dụng của các sản phẩm này không được như mong muốn người tiêu dùng và hiển nhiên chưa đủ cơ sở khoa học

để chứng minh sự ưu việt của nó

Từ đó tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic nhờ vào những kĩ thuật hiện đại con người đã miêu tả đầy đủ hơn về hình dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh

lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic Trong đó kỹ thuật di truyền trở thành một công cụ phân loại vô cùng quan trọng với việc xác định hàm lượng phần trăm mol C+G chứa trong DNA hay phương pháp điện di để xác định các gen [4,8]

I.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân loại theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm… Năm 1919, Orla – Jensen là người tiên phong trong việc nghiên cứu, phân loại có hệ thống các vi khuẩn lactic Về hình dáng ông phân chúng thành bốn giống:

Lactobacillus; Pediococus; Streptococus và lactococus; Leuconostoc Ngày nay người ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi [16,

17, 22]

- Lactobacillus: Trực khuẩn, có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ Nhiệt độ tối ưu

là 300C - 450C Lên men được galactoza, glucoza, sacaroza, fructoza Bao gồm ba

nhóm có ba loài đặc trưng: L.bulgaricus, L brevis, L casei.

-Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng Lên men đường dextran,

trioza, sản phẩm tạo thành là axit D- lactic, etanol, CO2 Có hai loài đặc trưng là

L.mensenteroides và L lactic.

-Pediococus: Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn Lên men

đường glucoza theo con đường EMP, axit lactic tạo thành có dạng DL, D(-) hay D(+)

Có ba loài đặc trưng là P.acidilactici, P.dextranicum, P halophilus.

-Streptococus và Lactococus: Dạng cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi Có khả năng lên

men đường hexoza thành axit lactic và các loại đường khác Có ba loài đặc trưng

được sử dụng trong sữa: S lactis, S.cremoris, S.thermophilus.

-Bifidobacterium: Lên men dị hình, có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình ovan, có

lúc lại hình que Có khả năng lên men lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic

I.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae Chúng không

đồng nhất về mặt hình thái,các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào [6] Tuy nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất Chúng đều là các vi khuẩn Gram(+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết

ra axit lactic Chúng không chứa các riboxom và enzym catalaza nên không phân giải trực tiếp peroxit thành nước và oxy.

Một đặc điểm quan trọng của các vi khuẩn lactic là có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp Không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+ Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn lactic vẫn đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như phôtphat, lưu huỳnh, vitamin, axit amin, lipit, những chất này phải

có trong môi trường lên men [5]

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn latic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là

nhu cầu về vitamin và nitơ Lấy ví dụ Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có đòi

hỏi về dinh dưỡng cao nhất Chúng đòi hỏi không chỉ các cở chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho

sự phát triển như vitamin, muối vô cơ [18]

I.1.4 Một số đặc điểm của Lactobacillus và Lactobacillus fermentum

a) Lactobacillus

Lactobacillus là trực khuẩn, không có tiên mao, kị khí hoặc kị khí tuỳ tiện,

Gram (+), không tạo bào tử, không di động, có khả năng lên men lactic điển hình, và

đa số đều chịu được axit Lượng Guamine và Cytosine trong DNA của chúng nằm trong khoảng 32 mol % đến 51 mol % [5] Chúng có hơn 60 loài Gần đây có một số loài được chia thành hai giống mới Weissella và Carnobacterium Năm 1919, Orla

Jensen chia Lactobacillus thành ba họ:

- Thermobacteria.

- Streptobacteria.

- Betabacteria.

Mặc dù sự phân chia trên chưa được coi là sự phân loại có giá trị nhưng nó vẫn

được sử dụng để phân chia họ Lactobacillus thành ba nhóm vi khuẩn cơ bản sau:

- Vi khuẩn lên men đồng hình bắt buộc

- Vi khuẩn lên men dị hình tùy tiện

- Vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc

Lactobacillus được tìm thấy trong các môi trường giàu dinh dưỡng và

cacbonhydrate như thực vật, thịt, sữa và các sản phẩm sữa Ngoài ra chúng còn được tìm thấy trong phân, nước thải, trong ruột non, dạ dày, âm đạo, vòm họng người và vật nuôi [17]

b) Lactobacillus fermentum HA6

Lactobacillus fermentum HA6 là chủng vi khuẩn đươc phân lập và tuyển chọn

từ thực phẩm lên men Việt Nam Đây là vi khuẩn ưa ấm, có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, lên men dị hình chặt chẽ, có thể lên men các đường riboza, galactoza, glucoza, fructoza, maltoza, saccaroza, lactoza Người ta đã chứng minh được rằng

Lactobacillus fermentum là vi khuẩn có lợi cho sức khỏe con người và động vật

Chúng có khả năng chống chịu trong dịch dạ dày, dịch ruột non, kháng các vi sinh vật

gây bệnh, kháng vi nấm và ức chế các tế bào ung thư Ngoài ra Lactobacillus fermentum còn có khả năng phân giải Demorphin, Gluten Exorphin C, và β-Casomorphin-7 là các peptide gây kích thích hệ thần kinh, là ba trong số các chất gây bệnh tự kỷ ở trẻ em [10, 11]

Vì vậy việc tạo sinh khối vi khuẩn Lactobacillus fermentum để ứng dụng chúng vào thực phẩm là một nhu cầu rất cần thiết, nhất là trong điều kiện Việt Nam

chưa có khả năng sản xuất được vi khuẩn này

I.2 Probiotic

Thuật ngữ "probiotic" đã được Lilley và Stiwell đưa ra vào năm 1965 để mô tả những chất được sản sinh bởi một vi sinh vật, giúp tăng trưởng một vi sinh vật khác

Từ đó đến nay có rất nhiềt định nghĩa khác nhau về probiotic

"Probiotic là những sản phẩm chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi,

có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe con người hay động vật sử dụng chúng bằng cách cải thiện hệ thống vi sinh vật bên trong cơ thể" [15]

I.2.1 Đặc điểm và chức năng của probiotic

a) Đặc điểm

Probiotics là những chất bổ sung vào thực phẩm, chủ yếu gồm những vi khuẩn hay nấm men có lợi, vi khuẩn lactic là một trong những loại được sử dụng thường xuyên nhất Nó có thể sinh ra Bacterioxin-một loại hợp chất có hoạt tính kháng sinh

và phổ ức chế các vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột, tăng khả năng tiêu hoá Probiotic trong đường ruột có thể tự tái thiết lập cân bằng khi cần thiết [28].

Những tác động tích cực của probiotic cần phải phụ thuộc vào liều lượng được tiêu thụ, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy chỉ khoảng 10-30% lượng probiotic có trong thực phẩm còn lại trong hệ tiêu hóa sau khi được hấp thụ Do đó hàm lượng probiotic cần thiết trong thực phẩm tối thiểu phải đạt 107 CFU/ml [20]

Probiotic được chia làm 2 loại:

• Vi khuẩn không sinh lactic

Bacillus subtilis, Escherichia coli strain nissle…

Chỉ có duy nhất một loài nấm men được sử dụng trong chế phẩm probiotic, đó

là Saccharomyces boulardii.

• Vi khuẩn lactic

- Giống Lactobacillus: L acidophilus, L casei, L plantarum, L fermentum, L reuteri, L bulgaricus, L paracasei…

- Giống Bifidobacterium: B bifidum, B breve, B longum, B lactic…[28].

Trong đó, hệ vi khuẩn axit lactic là hệ vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất trong

các sản phẩm probiotic, chủ yếu là giống Lactobacillus, do có khả năng chuyển hóa

đường (bao gồm cả lactoza) và các hydratcacbon khác thành axit lactic Nó không chỉ tạo vị chua cho các sản phẩm sữa lên men như sữa chua mà còn có tác dụng như một chất bảo vệ bằng cách hạ pH, giảm khả năng phát triển của các vi sinh vật có hại

b) Chức năng của probiotic

• Tăng cường khả năng miễn dịch

Đối với con người: hiệu quả của vi khuẩn lactic là liên kết bộ máy tiêu hoá và tạo hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng đường ruột Vi khuẩn lactic có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch theo hai cách: chúng vừa chuyển qua thành ruột non, phát triển và nhân lên tới một số lượng nhất định đồng thời những kháng nguyên giải phóng ra được cơ thể hấp thụ và kích thích hệ miễn dịch hoạt

động Một hướng khác, các giống Lactobacillus hoạt động gián tiếp bằng cách tác

động lên các thành phần khác của ruột non Đó là sản phẩm của sự biến đổi tạo ra đáp ứng miễn dich

Hệ miễn dịch được cải thiện nhờ vi khuẩn lactic được biểu hiện theo ba cách:+ Tăng cường hoạt động của đại thực bào.

+ Tăng cường sự sản xuất kháng thể thường xuyên: IgM, IgG và interferon (tác nhân chống virus đặc hiệu)

+ Tăng lượng kháng thể tại chỗ (IgA) trên bề mặt màng nhầy như thành ruột non, miệng [26]

Trong các thí nghiệm in vitro đã chỉ ra: các lympho bào máu ngoại biên của người đã được kích thích bởi một lượng nhỏ vi khuẩn sinh lactic trong sữa chua sẽ tạo

ra lượng interferon nhiều gấp 3-4 lần bình thường Sự gia tăng lượng interferon kéo theo sự gia tăng số lượng lympho B, và các tế bào NK (natural killer cells) và tăng mật độ IgG [12]

Đối với vật nuôi: Các thí nghiệm với loài gặm nhấm cho thấy Lactobacillus làm tăng hoạt động của đại thực bào (thường là L acidophilus và L casei) Chúng kích thích hoạt động của đại thực bào tới Listeria, làm tăng sự hình thành IgA ở ruột

non Sự gia tăng quá trình sản xuất kháng thể được tham gia với sự bảo vệ chống lại

sự xâm nhiễm của Salmonella typhimurium L casei được sử dụng như một tá dược

để ngăn chặn sự xâm nhiễm từ bên ngoài L acidophillus cũng có hiệu quả trong sự

gia tăng sản xuất kháng thể đường ruột Áp dụng thí nghiệm đó song khuếch tán miễn

dịch đã chứng minh rằng: sau khi cho ăn bổ sung thực phẩm có chứa L.acidophillus

trong 7 ngày, số lượng kháng thể miễn dịch ở ruột non lợn tăng gấp 3 lần [25, 27]

• Ngăn ngừa, ức chế, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

Hệ vi sinh vật đường ruột của cơ thể có các chức năng:

+ Duy trì pH của ruột, dạ dày

+ Kích thích sự tạo thành kháng thể

+ Hỗ trợ quá trình sinh tổng hợp enzyme và vitamin (VTM)

Hỗ trợ quá trình sinh tổng hợp VTM nhóm B (B1, B2, B3, B12), VTM K, enzyme proteaza, lipaza trong quá trình tiêu hóa thức ăn Từ đó cải thiện khả năng tiêu hóa của con người và vật nuôi Với cơ thể không tiêu hóa được lactoza, vi khuẩn

sẽ tổng hợp một lượng khá lớn enzym lactaza giúp tiêu hóa đường lactoza tốt hơn Bộ máy tiêu hóa của con người có hàng trăm loại vi sinh vật có lợi và có hại, ở trạng thái

cân bằng Khi cơ thể bị ốm, tiêu chảy, loạn khuẩn do dùng kháng sinh… sẽ làm mất cân bằng này, ảnh hưởng đến sức khỏe con người Vi khuẩn lactic được đưa vào cơ

thể có thể ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Samonella, E.coli…bằng cách sản sinh ra

axit lactic, H2O2 và các chất thuộc họ Bacteriocin Những chất này làm biến đổi môi trường ruột, tạo môi trường không thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật gây hại làm chúng không sinh trưởng phát triển được hoặc tạo lỗ thủng ở thành tế bào làm kìm hãm quá trình sinh tổng hợp lớp peptidoglucan và làm tăng cường quá trình tự phân của tế bào Nhờ đó đã khôi phục lại sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột

Vi khuẩn lactic được đưa vào thay thế vi sinh vật có lợi bị giết, làm giảm tác dụng phụ của thuốc kháng sinh khi sử dụng kháng sinh chữa bệnh

Ngoài ra vi khuẩn lactic còn làm giảm hoạt tính, mức độ của các chất gây ung thư và sự hoạt động của các khối u, giảm bệnh cao huyết áp, dị ứng, giữ cân bằng lượng ostrogen, tăng khả năng hấp thụ canxi để phòng bệnh loãng xương và bệnh trào ngược thực quản, ngăn chặn các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu, đường hô hấp ở trẻ em [18]

I.2.2 Dạng chế phẩm và ứng dụng của Probiotic

Chế phẩm Probiotic được ứng dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm cũng như các ngành công nghiệp khác: dược phẩm, y học

Hầu hết các dạng phổ biến của probiotic ứng dụng trong thực phẩm là các sản phẩm dạng lỏng hoặc sệt như sữa, sữa chua, nước hoa quả có chứa probiotic Chế phẩm probiotic dùng trong ngành dược thường ở dạng bột hoặc con nhộng chứa vi sinh vật có ích ở dạng đông khô Phương pháp sấy đông khô cho phép bảo quản vi sinh vật trong thời gian dài với tỷ lệ sống sót cao nhưng đòi hỏi chi phí cao và sản phẩm thu được ít, hiệu quả kinh tế không cao, nhất là khi ứng dụng trong ngành thực phẩm Do đó hiện nay trên thế giới người ta sử dụng phương pháp thu hồi chế phẩm bằng sấy phun Sản phẩm thu được ở dạng bột, dễ bảo quản, dễ bổ sung vào nhiều loại thực phẩm khác nhau và giá thành lại rẻ hơn nhiều

Dựa vào các thành tựu khoa học hiện đại, người ta đã phân lập và sản xuất được các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn lactic để bổ sung vào khẩu phần ăn của người già, em bé, và người bệnh nhằm cung cấp vi khuẩn lactic cho hệ vi khuẩn đường ruột để kích thích và điều tiết quá trình tiêu hóa, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm trùng, chữa bệnh đầy hơi và rối loạn tiêu hóa Những dữ liệu mới đưa ra giả thiết probiotic có thể được sử dụng để chữa các bệnh viêm nhiễm, xử lý và ngăn ngừa các bệnh dị ứng, ngăn ngừa bệnh ung thư, và kích thích hệ thống miễn dịch, làm giảm tỉ

lệ mắc các bệnh về đường hô hấp Theo điều tra hiện nay trên thế giới probiotic được

sử dụng phổ biến làm thực phẩm chức năng [13, 14] Hiện nay các nước châu Âu, Nhật Bản và Úc được coi là thị trường rộng lớn nhất đối với các thực phẩm chức năng dạng này Ngoài ra theo phân tích cho thấy đây là một thị trường đầy tiềm năng đối với ngành công nghiệp thực phẩm, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng

Các dạng sản phẩm lên men quen thuộc nhất được sử dụng trên thị trường có nguyên liệu ban đầu là sữa, thịt, dưa chuột, bắp cải trong đó sản phẩm sữa vô cùng phong phú và đa dạng, có khoảng 400 loại phomat khác nhau (Jay và cộng sự 1999)

và số lượng lớn các sản phẩm lên men khác Người ta đang tìm cách đưa các vi khuẩn

có ích vào các thực phẩm này thành thực phẩm chức năng Ở Thụy Sỹ, Pháp, Italia người ta sử dụng chủng hỗn hợp để làm các sản phẩm phomat truyền thống như

chủng Streptococus thermophillus thường kết hợp với các chủng Lactobacillus: L.bulgaris, L.lactis, L.fermentum là những chủng có lợi cho sức khỏe con người Sở

dĩ có sự kết hợp này là do chúng đều có khả năng chịu được nhiệt độ lên men [21]

Các tiêu chuẩn công nghệ sản xuất sản phẩm lên men có chứa probiotic :

- Các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic khi bổ sung vào quá trình lên men phải có khả năng chống đỡ được các điều kiên môi trường mà không tiêu diệt hay kìm hãm các chủng vi khuẩn lên men

- Sản phẩm cuối cùng phải chứa ít nhất 108 CFU/g sản phẩm và ổn định trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thấp

Các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic có các tính chất cảm quan chấp nhận được sau ít nhất 3 tuần bảo quản ở nhiệt độ thấp [23]

I.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lacticI.3.1 Hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều nguồn đường, thường có khả năng phân giải protein và lipit yếu, đòi hỏi nguồn axit amin sẵn có để sinh trưởng

a) Chuyển hóa đường

• Đường hexoza ( glucoza)

Tất cả các vi khuẩn lactic đều sản sinh ra axit lactic từ hexoza và chúng thiếu chức năng để liên kết với electron vận chuyển của mạch và chu trình Krebs, nên chúng thu năng lượng thông qua cơ chất ở dạng photphoryl hóa Axit lactic được sinh

ra có thể ở dạng L (+), ít khi ở dạng D(-), hoặc có thể ở dạng hỗn hợp Dạng axit lactic D(-) không được chuyển hóa bởi cơ thể người và không thấy có khuyến cáo đối với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Con đường hexoza chuyển hóa đã phân chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: lên men đồng hình và lên men dị hình Ta thấy các dạng lên men đồng hình như

Pediococus, Streptococus và một số Lactobacillus sinh axit lactic là thành phẩm chính

và duy nhất của việc lên men glucoza Tuy nhiên đưới điều kiện sinh trưởng thay đổi

và khi cơ chất ban đầu là pentoza thì có thể thay đổi Các chủng lên men đồng hình sử

dụng con đường Embden-Meyergof-Parnas để sinh ra 2 mol lactate trên 1 mol glucoza và nhận được xấp xỉ gấp 2 lần năng lượng trên một mol glucoza so với các chủng lên men dị hình Các chủng lên men dị hình sinh ra một lượng cân bằng giữa lactate, CO2, và etanol từ 1 mol glucoza theo con đường monophotphat hoặc pentoza.

Lactobacillus fermentum chuyển hóa đường theo con đường

6-photphogluconat hoặc photphoketolaza (6-PG/PK)

Con đường chuyển hóa disacarit dựa vào các enzym hydrolase phân cắt mạch thành các monosacarit Trong đó có chuyển hóa disacarit lactoza, lactoza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ các chất mang lactoza và các lacto-pecmeaza để phân cắt lactoza thành glucoza và galactoza, hoặc theo con đường photphoenopyruvat photphotransferaza (PTS) bằng cách phân cắt thành glucoza và galactoza-6-photphat

Chuyển hóa disacarit sacaroza, sacaroza có thể đi vào bên trong tế bào nhờ enzym sacaroza hydrolaza phân cắt sacaroza thành glucoza và fructoza theo nhiều con đường khác nhau Như các giống lactococus chuyển hóa đường sacaroza theo con đường PTS và sacaroza-6-photphat hydrolaza, nó tách sacaroza-6-photphat thành glucoza-6-photphat và fructoza Sacaroza-6-photphat hydrolaza và sacaroza PTS tăng lên khi trong môi trường có nhiều sacaroza Sacaroza cũng có thể hoạt động như một chất cho monosacarit trong quá trình tạo ra exopolysacarit – làm tăng độ kết dính và cấu trúc của các sản phẩm sữa lên men - của vi khuẩn lactic [16, 22]

b) Chuyển hóa Protein

Vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn về các loại axit amin để phát triển, mà khả năng tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ của các vi khuẩn lactic là có giới hạn Hoạt động thủy phân protein được nhắc đến khi trong môi trường không đủ axit amin cung cấp cho sự sinh trưởng và phát triển, ví dụ trong sữa chỉ có khoảng 10mg/100ml,

vì vậy vi khuẩn lactic có thể thủy phân casein ở pH và nhiệt độ tối ưu để tạo các axit amin, di hoặc tri – peptit nhờ các enzym proteaza và peptidaza nằm trong tế bào chất, trên màng và thành tế bào Trong một số trường hợp các proteaza ở thành tế bào không tổng hợp được do thiếu đoạn plasmit mã hóa thì lập tức các peptidaza ở màng

tế bào và tế bào chất sẽ thực hiện quá trình thủy phân các peptit thành các axit amin tương ứng sau khi các oligopeptit đủ nhỏ để được vận chuyển vào trong màng nguyên

sinh chất, vì chỉ có các phân tử thấp mới có khả năng xâm nhập vào tế bào qua màng nguyên sinh chất [8, 22].

Nhờ các loại enzym khác nhau mà vi khuẩn lactic có thể tham gia biến đổi tính chất một số sản phẩm thực phẩm trong quá trình sản xuất

I.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật cho trước [5] Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

I.3.2.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon, vì vậy vấn đề chuyển hóa các nguồn thức ăn cacbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

+ Glucoza ở dạng D-glucoza, là loại monosacarit hấp thụ dễ dàng, được vi sinh vật sử dụng làm nguồn năng lượng

Cấu trúc mặt phẳng Cấu trúc không gian

Hình 1.2: Cấu trúc của Glucoza

+ Sacaroza là disacarit, dưới tác dụng của enzym invectaza bị thủy phân thành đường đơn giản glucoza và fructoza cho vi khuẩn sử dụng dễ dàng.

Cấu trúc mặt phẳng Cấu trúc không gian

Hình 1.3: Cấu trúc của Sacaroza

+ Lactoza là disacarit, hay còn gọi là đường sữa, vì có trong sữa người và động vật (5-8%) Lactoza cấu tạo từ một phân tử β-D-galactose and α -D-glucose Lactoza

được thủy phân bởi enzym β- galactosidaza.

Hình 1.4: Cấu trúc của Lactoza

+ Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thủy phân tinh bột thành đường, có

3 đến 20 chuỗi Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, có thế sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và

axit lactic Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó xảy ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2 Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau Một số loài vi khuẩn lactic lại có thể sử dụng được dextrin, tinh bột [24] Sự phát triển của một vi khuẩn lactic dưới các nguồn đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình

xử lý sau này Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng

sống sót của L.bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được

bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm; nếu lên men từ manoza thì tỷ lệ

tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructoza và lactoza [9] Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đền vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào

I.3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào Tất cả thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nitơ (protein, axit nucleic ), vì vậy Nitơ có vai trò không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều axit amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ để đảm bảo sự phát triển của mình Axit amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzym proteaza và peptidaza ngoại hay nội bào

Một số lớn các vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu

cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ

có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ Đôi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi

khuẩn lactic, như L helyeticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni

trong môi trường

Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây cũng chính là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng

để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp thì khó có thể sử dụng nguồn nitơ này vì nó rất tốn kém, vì vậy cần nghiên cứu phối trộn chúng với nhau để tăng hiệu suât thu sinh khối và giảm giá thành Trong đó dịch nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều vì có hàm lượng nitơ cao, có 16 loại axit amin trong đó

có 8 axit amin không thay thế [4, 5, 16]

Bảng 1.1: Các axit amin trong dịch nấm men thủy phân [4]

I.3.2.3 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng.

Các muối vô cơ, các chất khoáng chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Chẳng hạn đối với

Lactobacillus, Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic, hay

Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzym proteaza thủy phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng các vai trò chủ yếu sau:

+ Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym

+ Giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của oxy Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza

để thải các gốc O2-

+ Ổn định cấu trúc tế bào Mn2+ tham gia vào việc làm ổn định riboxom

Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn

sử dụng tốt hơn các loại đường Carvalho và cộng sự đã nhận thấy là khi bổ sung NaCl (chất điện ly) và saccaroza (chất không điện ly) vào môi trường MRS khi nuôi

cấy L bulgaricus đem lại những kết quả khác nhau trong quá trình tạo sinh khối và tỷ

lệ sống sót của tế bào trong khi sấy và bảo quản sau này Khi bổ sung NaCl ở nồng độ thích hợp (5g/l) thì có tỷ lệ sống sót cao hơn so với khi chỉ dùng saccaroza trong môi

trường nuôi cấy L bulgaricus [1, 9].

Các vi khuẩn lactic , đặc biệt là Lactobacillus rất cần VTM vì vậy cần bổ sung

vào môi trường nuôi cấy các chất có chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, dịch chiết nấm men và nhiều chất khác Các vitamin đóng vai trò là các coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào – một vai trò quan trọng không thể thay thế được E.I.Kvasnikov và O.A.Hestrenko đã nghiên cứu quan hệ giữa các chủng và các

vitamin và đưa ra kết luận rằng yêu cầu về vitamin riêng biệt của từng vi khuẩn lactic

có thể thay đổi trong khi môi trường có chứa các axit amin hoặc axit béo và dizoxylribosit Trực khuẩn lactic cần rất nhiều loại vitamin Tất cả các giống trực khuẩn đều cần đến pantothenate canxi (vitamin B5) và niacin (vitamin B3) và có những đòi hỏi khác nhau đối với những vitamin khác Theo Ruiz-Barba và Jimenez-Diaz (1995) axit nicotinic, pantothenitic, biotin, và vitamin B6 đều rất cần thiết cho sự

phát triển của chủng L plantarum Việc thiếu vitamin B12 (cobalamin) có thể làm giảm sự tổng hợp AND kéo theo sự thay đổi hình thái, tế bào có thể mảnh hơn Mặc

dù có rất nhiều các nghiên cứu khác nhau về nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic, tuy nhiên họ đều có quan điểm chung rằng nhóm vitamin B rất cần thiết để kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamin, nhưng axit folic và axit p-aminobenzoic không ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài

Lactobacillus.

Nhu cầu về vitamin còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như điều kiện nuôi cấy,

pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường thành phần môi trường

Ngoài ra các hợp chất chứa axit béo có mặt trong môi trường không những tác động đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này Ví dụ như Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mật của vi khuẩn lactic [2, 11]

I.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

I.3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống

Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn Nếu

tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men

I.3.3.2 Ảnh hưởng của pH

Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Chính vì vậy, trong quá trình lên men lactic khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3.8) Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi

pH đạt giá trị 4.0 Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4.5-6.5 , nhưng một số lại có thể phát triển ở pH=9.6 và một số

hoạt động ở pH=3.2 như Lactobacillus fermentum có thể chiu được pH =3 Sự liên

quan giữa pH và hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa

học đang tiếp tục nghiên cứu Theo Giraud và cộng sự (1991) đối với vi khuẩn L plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hóa cơ chất Ngoài ra Silva và cộng sự đã tìm ra mối liên hệ giữa pH cuối cùng của môi trường nuôi cấy chủng L bulgaricus liên quan đến quá trình sấy phun và bảo quản khô sau này Họ nhận định

được tế bào sẽ chịu được quá trình xử lý nhiệt độ tốt hơn nếu trong quá trình nuôi cấy không điều chỉnh pH

I.3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt

độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa ấm, phát trển tốt ở nhiệt độ cơ thể người

370C

I.3.3.4 Ảnh hưởng của Oxy

Nói chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy Nhưng có một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt như

Lactobacillus gasseri Khi có mặt của oxy các loại này không có khả năng photphoryl

hóa, tổng hợp cytochrom, tổng hợp enzym Mặc dù các vi khuẩn lactic thường được gọi là các vi khuẩn yếm khí tùy tiện, thông thường các chuỗi vận chuyển electron không hoạt động nhưng quá trình oxy hóa khử DNA vẫn xảy ra Trong điều kiện hiếu khí, ở rất nhiều loại vi khuẩn lactic, phân tử DNA phản ứng với oxy để tạo nên H2O2 hoặc một phân tử nước nhờ NADH Trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn lactic vẫn cần hô hấp để sinh trưởng và phát triển Vì thế trong

nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp, sao cho tốc độ hòa tan nó bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật

 Qua những hiểu biết tổng quan ở trên chúng tôi thấy được tầm quan trọng vô

cùng to lớn của vi khuẩn Lactobaccillus fermentum HA6 trong việc tạo chế

phẩm probiotic, vì vậy vấn đề cần thiết đặt ra là nuôi cấy để thu hồi sinh khối

vi khuẩn trên quy mô lớn Nhằm mục đích đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

 Kiểm tra đặc tính của chủng Lactobaccillus fermentum HA6.

 Chọn nguồn nguyên liệu thích hợp thay thế cho môi trường MRS trong

quá trình nuôi cấy Lactobaccillus fermentum HA6 để giảm giá thành

PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Nguyên vật liệu – hóa chất- thiết bị nghiên cứu.

II.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Lactobacillus fermentum HA6 được phân lập từ các sản phẩm lên men Việt nam tại phòng thí

nghiệm của ngành khoa học môi trường và sự sống, khoa Khoa học và công nghệ thông tin, trường đại học Newcastle, Australia Chủng này đã được cấp giấy chứng nhận là chủng an toàn để sản xuất chế phẩm Probiotic

II.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

+Các loại đường: Glucoza, Sacaroza, Maltodextrin, Lactoza, đường thủy phân

từ tinh bột sắn, Việt Nam

+HCl, bromocresol tía, Tween, NaOH, Trung Quốc

+Thạch, tinh bột sắn, Việt Nam

+ Môi trường nuôi cấy

Môi trường MRS ( Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l

Tween80 1

Môi trường được thanh trùng ở 1210C trong 20 phút, pH = 6.1 - 6.5

Môi trường nuôi cấy tạo sinh khối: thành phần muối như môi trường MRS có một số thành phần chính như nguồn cacbon, nguồn nitơ được thay đổi theo yêu cầu nghiên cứu ( hàm lượng đường, nguồn Nitơ được thay thế một phần )

- Dịch thủy phân tinh bột

- Dịch nấm men thủy phân

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Chuẩn bị môi trường

+ Dịch nấm men thủy phân:

Men sữa sau khi đã được rửa sạch bằng nước vô trùng 5 0C, bổ sung enzim Neutrase 0.1% và đem thủy phân ở 50-55 0C trong 48h ( men:nước là 1:1), Sau đó dịch trong được khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, rồi được bảo quản lạnh trước khi

sử dụng, có hàm lượng nitơ tổng là 4.4g/l

+ Dịch tinh bột sắn thủy phân

Dịch có hàm lượng đường khử là 137 g/l

II.2.2 Phương pháp vi sinh

Chủng Lactobacillus fermentum được giữ giống trong môi trường MRS có bổ

sung 16% glyxerol, bảo quản ở -80 0C.Khi cần hoạt hóa giống trong môi trường lỏng rồi cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các thí nghiệm khác

Giống bảo quản ở ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 40C trong vòng 2 tháng sau thời gian đó phải cấy truyền

Mục đích: Đánh giá chủng giống nghiên cứu là Gram(+) hay không từ đó có

thể khẳng định đặc điểm của chủng giống

Tiến hành: Nhỏ một giọt khuẩn lạc lên một lá kính, dàn đều.Làm khô vết bôi

bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn Tiếp đó, nhuộm vết bôi bằng gentian tím trong

1-2 phút, sau đó dùng nước cất rửa thuốc nhuộm đi Nhỏ vài giọt lugol lên phiến kính rồi giữ trong 1-2 phút rồi dùng cồn 96% rửa lugol trong 10-15 giây Rửa sạch tiêu bản bằng nước rồi nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 1-2 phút Sau đó rửa lại bằng nước sạch, đợi tiêu bản khô rồi đem đi soi dưới kính hiển vi vât kính dầu có

độ phóng đại 1000 lần, đánh giá kết quả Nếu vi khuẩn bắt màu tím là Gram(+), bắt màu đỏ là Gram(-)

Để kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn lactic, tiến hành nuôi một giọt vi khuẩn này trên môi trường thạch MRS có bổ sung vài giọt Bromocresol tía 1.6% Nếu

vi khuẩn có khả năng di động thì axit lactic sinh ra sẽ làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng Nếu vi khuẩn không di động thì sự đổi màu của chỉ thị chỉ quan sát xung quanh giọt canh trường

Nguyên tắc: Dựa vào lượng khí CO2 sinh ra dâng lên trên ống Durham đẩy dịch lỏng khỏi ống

Tiến hành: Úp ống Durham vào ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, khử

trùng môi trường ở 121 0C trong 20 phút Sau đó cấy giống vi khuẩn này vào và tiến hành nuôi trong 24h ở 370C , đánh giá xem có khí sinh ra không

Nhỏ 1 giọt vi khuẩn huyền phù lên đĩa, dùng que trang dàn đều và nuôi trong

tủ ấm Khi thấy khuẩn lạc mọc thì nhỏ một giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc Nếu có các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalaza trong tế bào

Sử dụng phương pháp Koch để xác định số lượng tế bào Tiến hành pha loãng theo tỷ lệ thích hợp và nuôi cấy trên môi trường thạch MRS trong 48h ở 370C, bỏ ra đếm số khuẩn lạc

II.2.3 Phương pháp hóa lý

• Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kendan

Trong quá trình nghiên cứu, sử dụng dịch nấm men thủy phân để thay thế nhằm giảm giá thành sản phẩm Do đó phải xác định hàm lượng N tổng số của dịch nấm men thủy phân, từ đó tính toán được lượng dịch nấm men bổ sung khi pha môi trường

Tiến hành:

-Vô cơ hóa mẫu vật nghiên cứu: Hút 3ml dịch cho vào bình Kendan khô (chú ý không để mẫu dịch dính lên thành bình) Cho thêm 10ml H2SO4 đậm đặc, đồng thời cho khoảng nửa thìa sữa chua hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 theo tỷ lệ 3:1 vào để tăng nhiệt độ sôi Đậy bình, lắc nhẹ rồi đặt lên bếp đun Khi dung dịch có màu vàng sẫm thì nhấc bình ra để nguội Thêm vài giọt H2O2 30% Tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa đến khi dung dịch trong Sau đó đem đi cất đạm

-Cất đạm: Dùng NaOH đẩy NH3 ra khỏi sunfat amon rồi thu khí NH3 vào bình tam giác có chứa sẵn 20ml axit Boric 3% và chỉ thị Tasiro Axit Boric tác dụng với

NH3 tạo thành tetraboric amon, giữ lại được NH3 thoát ra từ bộ cất đạm

Định phân: Dùng H2SO4 0.1N để chuẩn độ từ đó xác định được lượng tetraborat amon tạo thành rồi xác định được lượng N có trong mẫu vật

Đánh giá kết quả:

Hàm lượng N tổng số có trong mẫu vật tính theo công thức

( )% 100 4 , 1

m

a

N= N: Hàm lượng N tổng số tính theo %

Mục đích: Xác định hàm lượng đường khử có trong dịch thủy phân tinh bột

sắn, Maltodextrin, làm môi trường nuôi cấy và xác định hàm lượng đường sót của các mẫu sau khi lên men

Tiến hành: Hút 20ml dung dịch Ferixianua 1% và 5ml dung dịch KOH 2.5N

vào bình tam giác 250ml, sau đó nhỏ thêm vài giọt chỉ thị xanhmetylen ( nếu nồng độ dịch đường thấp hơn 0.25% thì lấy 10ml dung dịch Ferixianua 1% và 2.5ml dung dịch KOH 2.5N ).Lắc nhẹ và đặt bình lên bếp điện đun sao cho 1-2 phút thì sôi Tiếp đó dùng dung dịch đường đã xử lý và pha loãng để chuẩn tới mất màu của xanhmetylen.màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng da cam thì kết thúc Nếu để nguội màu của hỗn hợp sẽ trở lại tím hồng

D: hàm lượng đường có trong mẫu (g/l)

a: Hàm lượng Glucoza tương ứng với 20ml(10ml) Ferixyanua 1%

V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn 20ml (10ml) Ferixyanua 1%

• Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ

Mục đích: Xác định hàm lượng axit tổng số của các mẫu nghiên cứu sau khi

lên men, và xác định độ chua của sữa chua

Tiến hành: Dùng NaOH 0.1 N để chuẩn độ với chỉ thị phenolphtalein để xác

định lượng axit tạo thành trong dịch nuôi cấy

Kết quả

(g l)

V

N V M HLaxit . . /

2

1 2

• Xác định lượng sinh khối

a ) Định lượng bằng cách ly tâm và xác định trọng lượng

Mục đích: Ly tâm nhằm xác định lượng sinh khối của vi khuẩn sau khi nuôi

cấy, tách sinh khối vi khuẩn khỏi môi trường để dễ dàng định lượng sinh khối tạo thành

Tiến hành: Cho 30ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống Falcon, ly tâm ỏ 6000

vòng trong 10 phút, rồi đem cân để suy ra hàm lượng sinh khối trong 1 lit môi trường

b) Định lượng sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp mật độ quang.

Mục đích: Sử dụng phương pháp đo OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic từ

đó xác định được khối lượng sinh khối tạo thành Cơ sở của phương pháp dựa vào sự phụ thuộc tuyến tính của OD giữa canh trường nuôi cấy vi khuẩn và khối lượng tế bào

có trong canh trường đó khi ở một giới hạn nồng độ xác định

Tiến hành: Xây dựng đường chuẩn sinh khối trước Mẫu canh trường cần xác

định được ly tâm ở 6000 vòng trong 10 phút Cân lượng sinh khối thu được rồi đem pha loãng với nước cất đến các nồng đô 1/2, 1/3,1/4, 1/6, 1/8, 1/10 Sau đó đo OD của dung dịch sau pha loãng Vẽ đường chuẩn sinh khối biểu diễn mối quan hệ giữa