Thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị b độc tố không chịu nhiệt heat labile toxin (độc tố không chịu nhiệt) của ETEC và sản xuất kháng thể đa dòng không heat labile toxin (độc tố không chịu

Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố ETEC là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển... Trên thế giới nhiều nhà khoa học đó n

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân téc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến ngộ độc cấp tính, ngộ độc mạn tính, các bệnh truyền qua thực phẩm Chất độc tính lũy trong cơ thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả năng lao động, gây các bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa và có thể gây ung thư Không những thế, nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc tế [13] Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngõa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22]

Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đó cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5600000

ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong Riêng trong 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12

ca tử vong Thực tế theo các chuyên gia phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [10].[20]

Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ chính tác động đến sức khoẻ con người trên thế giới (Wood và CS 1983) Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển

và cho khách du lịch đến những vựng cú dịch lưu hành Thực phẩm và nước

bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở vựng cú dịch lưu hành (Black và CS, 1981,1982; Ryder và CS, 1976) Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ

là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt ST và độc tố không chịu nhiệt LT Độc tố không chịu nhiờt cú cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholerae toxin) Vì vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước trầm trọng Trên thế giới nhiều nhà khoa học đó nhiờn cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và

sử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán các ETEC gây bệnh bằng kỹ thuật ELSA và latex đã thu được kết quả tốt (Cryan B,1990; Oto và CS,1983) Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây miễn dịch tạo ra kháng thể kháng LT sau

đó sử dụng kháng thể này để phát hiện độc tố LT của ETEC Tuy nhiên giá thành của sản phẩm này còn cao do vậy chưa đáp ứng được với điều kiện kinh

Với điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam và sự thiếu hiểu biết về vệ

sinh an toàn thực phẩm của người dân nên ngộ độc thực phẩm do E Coli sinh

độc tố (ETEC) chiếm tỷ lệ không nhỏ Phương pháp nuôi cấy không thể phát hiện được ETEC trong thực phẩm mà phải phát hiện được sự có mặt của độc

tố ETEC trong thực phẩm bằng kỹ thuật ELISA hay latex nhằm phát hiện các gen mã hóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm

Cho đến nay có một nghiên cứu ở Việt Nam của tác giả Nguyễn Thị Thanh Yến và CS năn 2005 tại viện dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA

để phát hiện khả năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm Tuy nhiên các kỹ thuật này giá thành còn cao và phức tạp cho nên rất khó áp dụng cho các phong xét nghiệm thực phẩm ở tuyến tỉnh Xuất phát từ thực

tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC và sản xuất kháng thể

đa dũng khỏng LT trên quy mô phũng thớ nghiệm” Đây là bước quan

trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB và biến nạp vào tế bào khả biến DH5α

2 Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21

3 Sản xuất kháng thể kháng LT trên thỏ ở quy mô phòng thí nghiệm

Chương 1TỔNG QUAN

1.1.Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm

1.1.1.Trên thế giới

Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngõa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22]

Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm Ở Mỹ hàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyên nhân ăn uống và hơn 9000 trường hợp tử vong [12].[48]

Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh

ở New-York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990 [6]

Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm do virus viêm gan A làm tử vong 9 người Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thực phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người Nguyên nhân chính là do thực phẩm bị ô nhiễm VSV là 8.505 trường hợp, do hóa chất là 9.506 trường hợp, thực vật hặc động vật có chất độc là 2.719 trường hợp Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy tại các căng tin là 7.529 trường hợp[2] Một thống kê trong

10 năm xác định các yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Trung Quốc cho thấy 93,24 % là nguyên nhân vi sinh vật, chỉ có 6,76% bởi các yếu

tố hóa học [23]

Ngộ độc thực phẩm do VSV ngày càng gia tăng ở các quốc gia đang phát

triển và ở cả các quốc gia đã phát triển, đăc biệt là E.coli Ở Nhật Bản năm 1996

có khoảng 800 người bị nhễm bệnh do Enterohaemorrhagie E.coli [3].

1.1.2 Ở Việt Nam.

Tình trạng ô nhiễm thực phẩm đang diễn ra khá phổ biến trên cả nước, chủ yếu là ô nhiễm mầm bệnh sinh học và hóa chất [10] Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10] Điều tra tại thành phố

Hồ Chí Minh cho thấy, 100% các mẫu thực phẩm được kiểm tra: bánh mì, thịt nguội, thịt quay và dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm về mặt vi sinh [3] Tại Hải Phòng có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh, trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9% Có tới 85% mẫu thực phẩm ăn ngay tại các chợ không đạt tiêu chuẩn về vi sinh, với số lượng

vi khuẩn có trong thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể cả các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [20] Không chỉ ở các thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở rất nhiều địa phương khác trên

Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người

tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người nhập viện

Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là

Salmonella, Streptoccocus, E.Coli và Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và

hóa chất Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấy được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở

Mới đây nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc 4 công ty trên địa bàn quận 12 và huyện Húc Mụn, TP.HCM đã lần lượt phải nhập viện cấp cứu

vì ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng com.vn)

1.2.Ngộ độc thực phẩm do E.coli

1.2.1 Vài nét về E.coli

E.coli do Eschirich phân lập từ phân người năm 1885

E.coli ký sinh bình thường trong đại tràng người và một số động vật

Sau khi trẻ ra đời khoảng 3h, người ta đã thấy E.coli trong đại tràng và từ đó

nó sống suốt đời với cơ thể vật chủ

E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất một số

sinh tố, giữ thăng bằng vi khuẩn chí ở ruột Trong số vi khuẩn hiếu khí ở đại

tràng, E.coli chiếm 80%

Một số hình ảnh của E.coli

Hình 1 Hình ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử

Hình 2: khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo

1.2.2 Phân loại

Có nhiều cách phân chia loài E.coli nhưng cách phân loại theo type

huyết thanh là hay được dùng hơn cả Cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng nguyên khác nhau cú trờn bề mặt tế bào vi khuẩn

- Kháng nguyên O là quyết định kháng nguyên quan trọng nhất Bản chất

là lipopolisaccharide nằm trờn vỏch tế bào vi khuẩn Có 171 loại kháng nguyên O đã được xác định, một số trong số chỳng cú phản ứng chéo với các

vi khuẩn khác [34].[44]

- Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt Kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên O Người ta đã xác định được khoảng 80 loại kháng nguyên K khác nhau [14].[34]

- Kháng nguyên H là kháng nguyên lụng cú bản chất hóa học là protein

Có 56 loại kháng nguyên lông khác nhau [14].[34]

Dựa trên các kháng nguyên O, K và H người ta đã phân biệt được trên

700 type huyết thanh khác nhau của E.coli

Phân loại dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu có khoảng 50 type phagePhân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm 5 loại [21]

- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột

- EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột

- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột

- EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột

- EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bám dính đường ruột

1.2.3 Đặc điểm sinh học

1.2.3.1 Hình thái học

- E.coli là trực khuẩn kích thước trung bình 1-3àx 0,5àm, đứng riêng rẽ

hoặc đôi khi thành đôi Trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ: trong môi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ

- Bắt mầu Gram (-)

- Di động bằng hệ thống lông xung quanh thân hoặc không di động

- Có thể có vỏ

1.2.3.2 Tính chất nuôi cấy

- Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện

- Nhiệt độ thích hợp 37oC nhưng có thể mọc ở 40oC, sống được ở nhiệt

đô 5-40o C

- pH 7,4

- E.coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một

số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng

- Ở những điều kiện thích hợp, E.coli phát triển rất nhanh, thời gian phân

chia thành một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút

- Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli đã làm đục

nhẹ môi trường, sau 24h làm đục đều Những ngày sau, dưới đáy ống có thể

có cặn

- Trên môi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp có thể thấy được khuẩn lạc Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc điển hình là dạng S: tròn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, nhưng cũng có thể gặp dạng M hoặc dạng R

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khúm trũn ướt (dạng S) màu trắng đục Để lâu khóm trở nên khô nhăn (dạng R) Kích thước khóm 2-3mm

- Trên thạch mỏu: Cú chủng dung huyết β, có chủng không dung huyết α

- Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khúm tớm ánh kim

- Trên môi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím.- Trên môi

trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ.- Trờn cỏc môi trường đường: Lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen

- Trên môi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ

- Trên các môi trường đường: Lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen.

1.2.3.3 Tính chất sinh vật hóa học

- Phản ứng oxydase(-), Citrat Simmons(-)

- Lên men glucose (+), Lên men sorbitol (-), Lên men lactose(+/-)

- Phản ứng RM (+), Phản ứng VP (-), Urease (-), Indole (+), H2S (-), Sinh hơi (+), Lysine decarboxylase (+), Arginine dihydrolase (+), Ornithin decarboxylase (+), ONPG (+)

1.2.4 Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa

E.coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội

Hiện tại người ta đã xác định được 5 loại E.coli có khả năng gây tiêu

chảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC

♦ ETEC

Để gây được bệnh tiêu chảy, E.coli đòi hỏi phải có hai yếu tố độc lực đó là:

+ Khả năng bám và cư ngụ ở niêm mạc ruột

+ Khả năng sản sinh ra độc tố

•Các yếu tố bỏm dớnh:

- Khả năng bám và cư ngụ của ETEC vào tế bào màng nhầy biểu mô ruột non là điều kiện quan trọng trong quá trình gây bệnh Quá trình này được thực hiện qua một số các yếu tố trung gian gọi là CFA (Colonization Factor Antigen “yếu tố kháng nguyên cư ngụ”) hoặc các yếu tố kháng nguyên trên bề

mặt E.coli (E.coli surface antigen) Các CFA này có bản chất là protein và

chúng có tính kháng nguyên nguyên mạnh, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loài khác nhau [36].[38].[46]

- Cho đến nay người ta đã phát hiện ra một số loại CFA khác nhau như CFA I, CFA II, CFA III, CFA IV CFAII được mô tả như một yếu tố kháng

nguyên lông riêng biệt có chứa 1 hoặc 2 kháng nguyên lông bề mặt khác [36].[38].[46].

- Các CFA này còn liên quan chặt chẽ với các yếu tố độc lực LT và ST: CFA I và CFA II liên quan với LT và ST hoặc chỉ ST đơn thuần nhưng CFA III chỉ liên quan với chủng ETEC chỉ sản xuất LT [36]

- Các yếu tố CFA được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid và plasmid này cũng mã hóa cho các độc tố LT và ST, [36].[38].[46]

- Các nghiên cứu về dịch tễ học thấy rằng CFA I, CFA II và CFA IV xuất hiện khoảng 75% trong các chủng ETEC gây bệnh ở người trên thế giới [34]

● Độc tố

ETEC gây tiêu chảy nhờ hoạt động của độc tố ruột không chịu nhiệt LT

và độc tố ruột chịu nhiệt ST Một chủng E.coli có thể chỉ có LT, chỉ có ST

hoặc cả 2 loại độc tố này

◘ Độc tố không chịu nhiệt LT

LT là một protein có tính kháng nguyên mạnh, có tính chất của một

ngoại độc tố Cấu trúc và chức năng gần giông với choleragen của vi khuẩn

tả Có 2 type huyết thanh của LT là LT I và LT II, chúng không có phản ứng miễn dịch chéo với nhau LT I có ở những chủng gây bệnh cho cả người và động vật, LT II hiếm khi phân lập được ở trên người Nhưng cả động vật và người, sự có mặt can LT II không liên quan đến bệnh Do vậy thuật ngữ LT chỉ để ám chỉ LT I LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86 kDa bao gồm

28 kDa tiểu đơn vị A và 11,5 kDa của 5 tiểu đơn vi B (LTB) Khả năng bỏm dớnh của tiểu đơn vị B vào thụ thể GM1 trên niêm mạc ruột non sẽ cho phép độc tố này xâm nhập vào bên trong của tế bào niêm mạc ruột Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzym gồm 2 peptid A1 và A2 nối với nhau bởi cầu nối disulfide (Giannella và CS, 1974, 1981; Streatfield và CS, 1992) [41]

- Cơ chế gây tiêu chảy của LT

Sau khi phần B giúp độc tố bám vào tế bào biểu mô ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào Peptide A1 có hoạt tính enzym ADP- ribosyltransferase và hoạt động bằng cách chuyển một nửa phân tử ADP- ribosyl từ NAP tới tiểu đơn vị A của protein gắn GTP, Gs, làm hoạt hóa enzym adenylate cyclase Khi enzym adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc vòng nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na+ ở tế bào niêm mạc ruột co lông, tăng bài tiết Cl- vào lòng ruột, làm cho áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng nhanh Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoài lòng ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào, gây tiêu chảy (Giannella và CS, 1974, 1981; Streatfield và CS, 1992) [41].

◘ Độc tố chịu nhiệt ST

ST có trọng lượng phân tử thấp trong cấu trúc can nó cú chứa nhiều cystein mà chính nhờ các cầu nối disufide, ST bền vững với nhiệt độ Có 2 lớp ST khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động là Sta và STb Gen mã hóa cho 2 lớp này thường nằm trên plasmid, cũng có khi nằm trên transposon Độc tố ST hoàn chỉnh chứa 18-19 acid amin trọng lượng phân tử 2 kDa Receptor của STa là enzym trên màng gai là Guanyl cyclase(GC-C) Khi Sta gắn với GC-C trên tế bào biểu mô ruột, kích thích hoạt động can GC làm tăng GMPc GMPc hoạt động giống AMPc STb chứa 48 acid amin throng lượng phân tử 5,1 kDa STb làm mất nhung mao hoặc teo một phần nhung mao ruột [41]

- Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy

trầm trọng và kéo dài

♦ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các type thường gặp O26:B6, O44, O55:B5, O112:B11, O124, O125:B5, O142 là nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi

♦ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những E.coli này bỏm lờn niêm

mạc và làm tróc niêm mạc gõy loột niêm mạc do đó gõy tiờu chảy có đờm lẫn

máu (giống Shigella) Các chủng này có thể lên men hay không lên men đường lactose và có phản ứng lysin decarboxylaza âm tính Thường gặp các type O125, O157, O144…

♦ Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảy vừa là nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) và làm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù (ederma) rất nguy hiểm đến tính mạng (do biến chứng) Nhóm VETEC bao gồm các type: O26, O11, O113, O145, O157 ; đây là ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy Các biến chứng trên do vi khuẩn tiết ra một trong 2 loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) và VT2 gây tác động thần kinh

Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7

Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây (theo CDC, Center for Disease Control and prevention của Mỹ) :

* Triệu chứng lâm sàng:

Bệnh tiêu chảy do ETEC thường bắt đầu đột ngột sau một thời gian ủ bệnh ngắn 14- 50h Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy toàn nước, không có nhầy máu, ít khi có sốt và cú nụn Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi nhưng cũng

có thể diễn biến nặng giống tả

*Dịch tễ học

ETEC gây bệnh chủ yếu cho trẻ em và khách du lịch, thường gây ra các

vụ dịch nhỏ có tính chất lẻ tẻ Có một số vụ dịch tiêu chảy do ETEC đã được miêu tả trong các y văn

- Ở trẻ em ETEC gây tiêu chảy chiếm tỷ lệ 10-31 % [41]

- Người ta thấy rằng trong số những người đi du lịch bị tiêu chảy thỡ cú 20 -40% là do ETEC

- Bệnh thường xảy ra vào mùa nóng ẩm.

- Bệnh lây qua thực phẩm và ít gặp hơn ở nguồn nước bị nhiễm khuẩn Sự lây truyền qua thức ăn sam của trẻ cai sữa là rất quan trọng đối với nhiễm bệnh ở trẻ nhỏ Hiếm gặp bệnh lây trực tiếp qua tay bị nhiễm khuẩn [17].[34]

- Sự lưu hành của bệnh là nhiễm trùng chủ yếu ở các nước đang phát triển Ở các nước đang phát triển, trẻ em trong 3 năm đầu của cuộc đời nhiều lần bị nhiễm trùng đường tiêu hóa do ETEC Trẻ lớn và người lớn ít gặp hơn [17].[34].[39]

1.3 Ngộ độc thực phẩm do ETEC

1.3.1 Trên thế giới

Trên thế giới, khoảng 210 triệu ca mắc và 380.000 ca tử vong, xảy ra chủ yếu ở trẻ em do ETEC, theo số liệu của tổ chức Y tế thế giới ETEC là nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu chảy ở những nguời đi du lịch Thực phẩm và nước bị ô nhiễm - những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi

khuẩn này Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở vựng cú dịch lưu hành Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra

vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước

ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ

em các nước đang phát triển nhưng không phải là yếu tố chớnh gõy tiêu chảy

ở trẻ em các nước phương Tây ETEC là một vi khuẩn quan trọng gây tiêu chảy ở người Âu châu, nhưng lại không quan trọng bằng EAEC ở người Á châu Các chủng ETEC thường kết hợp với 2 hội chứng lâm sàng chính là sự tiêu chảy ở trẻ em mới thôi bú mẹ ở các nước phát triển và sự tiêu chảy ở những người đi du lịch

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, E.coli là một trong những căn nguyên quan trọng gây tiêu

chảy ở trẻ em đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi.[4] Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tớnh khỏng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường

gặp (1988 – 1994) thì E.coli đứng thứ hai ( sau S.aureus) về tỉ lệ phân lập

được tính chung tất cả các loại bệnh phẩm ở nước ta

Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm hiểu vai trò gây bệnh của ETEC tại viờt nam cho thấy: khoảng 5-8% các trường hợp tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi là do ETEC Kỹ thuật ELISA cũng đã được áp dụng để phát hiện khả năng sinh độc tố của các chủng ETEC cho thấy 14/221 (6,3%) các chủng

E coli phân lập từ các bệnh nhân tiêu chảy cấp có sinh độc tố ruột Thêm vào

đó các nghiên cứu sâu về E coli sinh độc tố bằng các kỹ thuật sinh học phân

tử như phát hiện tỷ lệ mang gen độc tố của E coli (bao gồm cả độc tố LT) của

các trường hợp tiêu chảy cấp tinh của trẻ em Hay việc phát hiện gen độc tố

của E coli ở các trang trại bò sữa cũng đã được tiến hành tại Việt Nam Tuy

nhiên trong lĩnh vực Vệ sinh An toàn thực phõm, phần lớn chúng ta mới áp

dụng các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống để phát hiện mức độ ô nhiễm E coli trong thực phẩm các kết quả đều cho thấy mức độ ô nhiễm E coli trong thực

phẩm ở Việt nam khá cao chiếm 50%-90% các mẫu xét nghiệm, tuy nhiên

chúng ta chưa có các thống kê về tình hình ô nhiễm của các E coli gây bệnh

trong đó có ETEC, do vậy, trong tương lai, rất cần có những nghiên cứu sâu

hơn để đánh giá tỷ lệ lưu hành của các E coli gây bệnh trong thực phẩm.

1.4.Các phương pháp xác định E.coli

1.4.1 Phương pháp định danh kinh điển

- Bệnh phẩm phân được cấy trên môi trường ức chế chọn lọc cho các vi khuẩn đường ruột như Endo, Mac- Conkey, DCL,SMAC Việc xác định

E.coli dựa vào các tính chất sinh vật hóa học, nhưng chỉ khoảng 90% số chủng E.coli lên men đường lactose, một số chủng DEC chủ yếu là các EIEC

không có khả năng lên men đường này Test indole dương tính ở 99% chủng

E.coli Đây là test đơn giản nhất để phân biệt E.coli với các thành viên khác trong họ vi khuẩn đường ruột Tiếp theo, định loại E.coli bằng kháng huyết

thanh mẫu đặc hiệu với các yếu tố kháng nguyên O, H, K Tuy nhiên phương

pháp này thường chỉ có giá trị phân biệt E.coli với các thành viên khác trong họ vi

khuẩn đường ruột Nó hầu như cũng không thể phân biệt giữa các DEC với nhau

và DEC với các E.coli trong hệ vi khuẩn chí ở đại tràng của người do các tính chất sinh vật hóa học của nhiều DEC giống nhau và giống E.coli không gây tiêu chảy

- Đồng thời người ta cũng thấy với cùng một type huyết thanh có thể gây

ra các bệnh cảnh lâm sàng khác nhau thuộc hai nhóm DEC gây tiêu chảy khác nhau Ví dụ: bệnh cảnh lâm sàng do ETEC (tiêu chảy phân toàn nước không

có máu) và EIEC (tiêu chảy phân nhầy mũi) là hoàn toàn khác nhau nhưng có thể có chung một type huyết thanh gây ra: O124: H9, O167: H9 [34]

- Do sự đa dạng về cấu trúc kháng nguyên nờn đó hạn chế độ nhạy và độ đặc hiệu can phản ứng này Thêm vào đó phương pháp này cũng tốn kém và

mất rất nhiều thời gian do có quá nhiều tupe huyết thanh của E.coli Đồng

thời một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác có thể phản ứng chéo

với kháng huyết thanh của E.coli như Shigella, Samonella, V cholerae non

01 [34]

1.4.2 Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu

Thử nghiệm này tường được dùng để sàng lọc EAEC Độ nhạy và độ đặc hiệu của thử nghiệm tạo vỏng trờn môi trường lỏng trong chẩn đoán EAEC khoảng 90% Hơn nữa nó cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở các la

bo vi sinh bệnh viện [11]

1.4.3 Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm

Một số thử nghiệm trên súc vật dựa trên đặc điểm độc lực can DEC đã được thực hiện như phương pháp quai ruột dùng để phát hiện độc tố ruột ST, phương pháp thử nghiệm trên chuột đang bú, thử nghiệm Sereny…[34] Phương pháp này không những tốn kém mà còn thiếu sự tiêu chuẩn hóa ( Nguyễn Vũ Trung, 2004)

1.4.4 Phương pháp miễn dịch

Một vài xét nghiệm miễn dịch đã được sử dụng như miễn dịch phóng xạ

và ELISA dùng để xác định các độc tố LT và ST của ETEC , Kỹ thuật ELISA dùng để phát hiện nhanh các chủng EPEC và EHEC thuộc nhóm huyết thanh O26 [34]

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

(1) Kháng nguyên- antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này

và tạo tín hiệu có thể xác định được

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa

KN-KT Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu

1.4.4.1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính:

- Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa) KN

sẽ được cố định trên bề mặt Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết

- Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn

- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn) Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khỏc lờn bề mặt của đĩa

- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh

- Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme)

- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ

- Thêm cơ chất Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại)

Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất

kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này

1.4.4.2 Sandwich ELISA:

Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):

(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT

(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt

(3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định

(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi

(5) Thờm cỏc KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán

(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho

KT sơ cấp ở bước 5)

(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi

(8) Thêm cơ chất Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện

(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT

Các bước trong Sandwich ELISA (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát

hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.

1.4.4.3 ELISA cạnh tranh:

(1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN

(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN

(3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh"

(4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1) KT thứ cấp gắn với enzym

(5) Thêm cơ chất Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu

Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu

Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT

1.4.5 Phương pháp nuôi cấy trên tế bào

Các tế bào Hela, Hep-2… được dùng để xác định khả năng và cơ chế gây bệnh can DEC, đặc biệt là khả năng sinh độc tố và các gen quy định các yếu tố độc lực Thử nghiệm bỏm dớnh trờn tế bào Hep-2 hiện nay vẫn được coi là “tiờu chuẩn vàng” để xác định EAEC Phương pháp này cũng có giá trị nhất định trong phân biệt cỏc nhúm E.coli bỏm dớnh và gây tiêu chảy Thử nghiệm bỏm dớnh trờn tế bào Hep-2 được thực hiện bằng cách cấy truyền các chủng E.coli cần xác định trên tế bào 1lớp và ủ trong 3h ở điều kiện 37o C, khí trường có 5% CO2 Sau đó các tế bào này được rửa, trộn, nhuộm và kiểm tra dưới kính hiển vi khuẩn quang học có vật kính dầu Các kiểu cách bỏm dớnh trờn tế bào thể hiện rất rõ ràng [34]

Tuy nhiên phương pháp này không được sử dụng phổ biến vì rất phức tạp và tốn kém, đòi hỏi các chuyên gia nhiều kinh nghiệm cũng như chỉ thực hiện được ở một số rất ít những labo tiêu chuẩn.

1.4.6 Kỹ thuật sinh học phân tử

Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên cứu, phân tich gen và hệ gen Trước đây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen nằm ở chỗ chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lượng ít trong một

hệ gen phức tạp và khổng lồ Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn [4].[7]

Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong đó DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Về nguyên tắc để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA, hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotide gọi là mồi sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu

Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR Việc thao tác được thực hiện trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trờn cỏc gen của vi khuẩn ) để khuyếch đại đặc hiệu trên hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thời gian ngắn [7].[9]

Như vậy, số cặp mồi cần thiết sẽ tương ứng với số đoạn DNA cần khuếch đại Mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự tham gia của một cặp mồi đặc hiệu Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽ mất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gây tốn kém [15]

Chính vì vậy, nhiều tác giả đã cải tiến đưa ra phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR, để cùng một lúc khuếch đại được

nhiều đoạn DNA Trong chẩn đoán vi sinh, điều này đông nghĩa với việc phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ bằng một phản ứng PCR Kỹ thuật này được gọi là PCR đa mồi Ưu điểm của PCR đa mồi là tiết kiệm được rất nhiều thời gian và nguyên vật liệu.

Tuy nhiên sự có mặt của một số chất trong phân như: sắc tố mật, muối mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đó tiờu húa…và một lượng lớn DNA không phải từ E.coli sẽ ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao chiết tách và tinh sạch được DNA của các chủng E.coli gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm

Đã có một số phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA trực tiếp từ phân như phương pháp tách chiết dùng ethanol, phương pháp sắc ký lỏng cao

áp, phương pháp dung bi thủy tinh hoặc bi silic….[1] Đơn cử như phương pháp dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS) [42] Quy trình cụ thể như sau:

- 100mg phân được hòa trong 0,5ml nước muối sinh lý và ly tâm với tốc độ 600rpm trong 3 phút, lấy nước nổi

- Ly tâm tiếp với tốc độ 11000rpm trong 3 phút, lấy cặn

- Thêm 50àl dung dịch lyozyme, ủ 37o C/30 phỳt Thờm 150àl hỗn dịch proteinase K ủ 50oC trong vòng 30 phỳt Thờm 300àl dung dịch phenol bão hòa Ly tâm với tốc độ 11000rpm trong 3 phut lấy nước nổi

- Thêm 12àl dung dịch acetat natri 3.3M Thêm 330 àl cồn tuyệt đối đã

để lạnh, để ở nhiệt độ phòng 10 phút

- Ly tâm tiếp với tốc độ 12000rpm trong 15 phút, lấy cặn

- Rửa cặn bằng cách thêm 300 àl cồn 70o đã để lạnh và ly tâm với tốc độ 11000rpm trong 10 phút, lấy cặn

- Làm khô cặn bằng bỡnh hỳt chân không trong 15 phút

* Hầu hết các phòng thí nghiệm VSATTP hiện nay ở Việt nam chưa phát hiện được độc tố không chịu nhiệt LT của E.coli trong thực phẩm Tại viện dinh dưỡng quốc gia đó cú một đề tài nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện độc tố LT trong thực phẩm, tuy nhiên do kỹ thuật này còn tương đối phức tạp, tốn nhiều thời gian hơn so với que thử nhanh và giá thành cao nên vẫn chưa được áp dụng rộng rãi tại Việt Nam.

Ngày nay kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic) đang được

sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán như que thử nhanh phát hiện kháng nguyên bề mặt (HbsAg) của vius viêm gan B, hay que thử nhanh

để phát hiện V cholerae O1 và O139 trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng (Crystal Vc, dipstick)… Ở nghiên cứu của chúng tôi cũng dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic), kháng thể tiểu đơn

vị B của độc tố LT đã được gắn hạt vàng được sử dụng để phát hiện nhanh, chính xác độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm

CHƯƠNG 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid

- Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α sử dụng cho

mục đích tỏch dũng và biểu hiện protein EltB,

- Tế bào biểu hiên protein BL21

- Chủng ETEC chuẩn (… ) mang gen độcn tố LT

- vector biểu hiện pGEX mang đoạn gen mã hóa cho protein EltB

2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Phiến nhựa 96 giếng làm ELISA

- Complete adjuvant (Sigma)

- Incomplete adjuvant (Sigma)

- Ete

- Fomalin 38%

- PBS 1X

- Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ)

- Máy đọc trình tự gen ABI (Applied Biosystem)

- Máy điện di ngang Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động :Chemidoc EQ- Bio-Rad ( Mỹ)

- Máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức

- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

- Máy đo nồng độ DNA và độ đục vi khuẩn Eppendorf (Đức)

- Môi trường LB đặc

200ml LB đặc4g agarose→ môi trường LB đặc 2%

Khử trùng 121o C/20 phút

2.1.4 Cặp mồi sử dụng

Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này để tạo các điểm cắt của hai

enzym giới hạn là XhoI- R và BamHI – F ở hai đầu đoạn gen mó hoỏ cho

protein EltB có trình tự như sau

5’ CGCGGATCCGGAGCTCCTCAGTCTATTA 3’EltB BamHI-F

5’ CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCG 3’ EltB XhoI-R

2.2 Phương pháp nghiên cứu