Đặc điểm các gen mã hóa β lactamase phổ mở rộng ở một số vi khuẩn gram âm và nguy cơ lan truyền qua trung gian plasmid

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute các tiêu chuẩn lâm sàng và tiêu chuẩn phòng thí nghiệmCTX-M Loại ESBL có hoạt tính mạnh trên cefotaxime, được phân lập đầu tiên ở Munich

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN HOÀNG THU TRANG

ĐẶC ĐIỂM CÁC GEN MÃ HÓA β-LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG Ở MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ NGUY CƠ LAN TRUYỀN QUA

TRUNG GIAN PLASMID

Chuyên ngành: Di Truyền Học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS STEPHEN BAKER

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

ACKNOWLEDGEMENTS

First and foremost I offer my sincerest gratitude to my supervisor, Dr Stephen Baker, who has supported me thoughout my thesis with his patient guidance, encouragement and advice I have been extremely lucky to have a supervisor who cared so much about my work Without him, this thesis would not have been completed

I would like to thank Doctor James Campbell for his guide on clinical microbiology and his kindness to allow me working in good condition at the microbiology laboratory

LỜI CÁM ƠN

Tôi muốn dành tặng những lời cảm ơn chân thành và thân thương nhất đến hai

người bạn lớn của tôi là chị Thiếu Nga và Thanh Duy Với tôi, họ thực sự là

những bậc Thầy trong lab Sự hiểu biết, sự năng động và những tình cảm mà họ dành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận cũng như sự quan tâm trong thời gian tôi viết bài là điều đáng giá nhất Mong những điều tốt đẹp nhất sẽ đến với

họ

Xin gửi đến Thầy Phạm Văn Tới và chị Minh Viện lời cám ơn chân thành vì sự

giúp đỡ nhiệt tình để tôi có cơ hội làm việc tại OUCRU

Xin gửi lời cám ơn chân thành đến bạn Sĩ Kiệt vì sự giúp đỡ nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm Cám ơn bạn Ngọc Dung, Phương Tú, Khánh Như đã là

những người bạn thật dễ thương cũng như đã dành thời gian đọc bài và đóng góp nhiều ý kiến hữu ích

Xin chân thành cám ơn anh Hoàng và các anh chị phòng thí nghiệm vi sinh đã

giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm việc

Xin chân thành cám ơn các Cô và chị ở phòng pha chế môi trường đã luôn hỗ

trợ tôi kịp thời trong lúc làm thí nghiệm

Tôi sẽ không bao giờ quên các bạn ở OUCRU đã cho tôi một khoảng thời gian đầy ý nghĩa Cám ơn nhóm bi lắc với những buổi trưa thật tuyệt vời!

Với sự biết ơn và trân trọng nhất tôi muốn dành cho Tiến sĩ Nguyễn Trọng Hiệp,

người Thầy suốt đời của tôi Thầy đã định hướng cho tôi những bước đi đầu tiên, đưa tôi đi khắp nơi và chọn cho tôi một điểm đến lý tưởng Tôi cám ơn Thầy vì sự tận tâm hướng dẫn, theo dõi từng thí nghiệm của tôi và góp ý một cách khắc khe để tôi có thể làm tốt công việc của mình Được làm việc với Thầy trong suốt thời gian qua, với tôi, đó là một trải nghiệm khoa học thật bổ ích

Tôi vô cùng biết ơn các Thầy Cô, các chị và các bạn ở Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM đã hết sức giúp đỡ, động viên, chia sẻ và tạo

điều kiện tốt nhất để tôi có thể làm tốt khóa luận của mình Xin cám ơn và mãi khắc ghi những tình cảm ấm áp và sự quan tâm mà mọi người đã dành cho tôi

Tôi biết ơn các Thầy Cô ở trường Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy và truyền đạt

kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Xin chân thành cám ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp ở Khoa Vi sinh Bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi rất nhiều trong

quá trình lấy mẫu bệnh phẩm

Tôi không bao giờ quên các bạn bè ở Khoa Dược, các bạn lớp Di Truyền K18 đã

cùng tôi trong suốt thời gian làm việc, học tập Xin gởi đến các bạn những lời cám

ơn chân thành vì tình bạn, sự động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Từ tận đáy lòng, tôi muốn gởi lời tri ân đến Ba Mẹ vì sự yêu thương, vì đã dành cho

tôi những tình cảm trọn vẹn Rất tự hào vì Ba Mẹ đã luôn bên tôi và mang đến cho tôi những giá trị gia đình thật sự, tổ ấm thân thương nhất trong cuộc đời tôi

Những lời thương yêu nhất tôi muốn dành cho ông xã Nguyễn Bình, người bạn

suốt đời của tôi, vì những tình cảm ngọt ngào, sự động viên và chia sẻ

mà anh đã dành cho tôi

Tôi không quên những thiên thần đáng yêu, Thu Anh và Anh Thư,

luôn luôn bên cạnh và mang đến cho tôi nhiều may mắn

Cuối cùng, tôi muốn gởi lời cám ơn đến tất cả những người thân trong gia đình,

những người đã luôn quan tâm và quý mến tôi

Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người

XUW

MỤC LỤC

ACKNOWLEDGEMENTS i 

LỜI CÁM ƠN ii 

MỤC LỤC v 

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii 

DANH MỤC CÁC BẢNG x 

DANH MỤC CÁC HÌNH xi 

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ xii 

MỞ ĐẦU 1 

Chương 1.  TỔNG QUAN 3 

1.1  Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) 4 

1.1.1  Escherichia coli (E coli) 4 

1.1.2  Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) 5 

1.2  Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam 6 

1.2.1  Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt động 6 

1.2.2  Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn 7 

1.2.3  Phân loại β-lactam 8 

1.3  Enzym β -lactamase 9 

1.3.1  Định nghĩa 9 

1.3.2  Phân loại 9 

1.4  Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL) 11 

1.4.1  Định nghĩa 11 

1.4.2  Phân loại 11 

1.4.3  Phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL 18 

1.4.4  Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen ESBL 19 

1.5  Plasmid 20 

1.6  Tình hình dịch tễ học của các vi khuẩn sinh ESBL 20 

1.6.1  Tình hình trên thế giới 20 

1.6.2  Tình hình Việt Nam 22 

1.7  Dịch tễ học phân tử và sự phát tán các loại ESBL 23 

1.7.1  Tình hình trên thế giới 23 

1.7.2  Tình hình Việt Nam 24 

Chương 2.  VẬT LIỆU và PHƯƠNG PHÁP 26 

2.1  Chủng vi khuẩn 27 

2.2  Định danh họ vi khuẩn Enterobacteriacae 29 

2.3  Xác định kiểu hình ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi 29 

2.3.1  Nguyên tắc 29 

2.3.2  Thực hiện 30 

2.4  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các chủng sinh ESBL 30 

2.5  Chiết DNA từ tế bào vi khuẩn 31 

2.5.1  Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn 31 

2.5.2  Tách chiết plasmid theo phương pháp của Kadou – Liu [25] 31 

2.6  Phản ứng khuếch đại DNA xác định gen mã hóa ESBL 32 

2.7  Tinh sạch DNA 33 

2.8  Giải trình tự sản phẩm khuếch đại 34 

2.9  Thí nghiệm tiếp hợp 35 

2.10 Lai DNA bằng phương pháp Southern Blot 36 

2.10.1 Chuyển DNA lên màng 36 

2.10.2 Đánh dấu mẫu dò 37 

2.10.3 Lai DNA với mẫu dò 38 

2.10.4 Phát hiện sự quang hóa của mẫu dò bởi ECL 39 

Chương 3.  KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 41 

3.1  Kiểu hình ESBL của các vi khuẩn thử nghiệm 42 

3.1.1  Đặc điểm lâm sàng 42 

3.1.2  Đặc điểm kiểu hình ESBL 42 

3.2  Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn sinh ESBL 43  3.3  Đặc điểm các gen mã hóa ESBL 45 

3.3.1  Phản ứng khuếch đại gen (PCR) 45 

3.3.2  Giải trình tự các gen blaTEM, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9 46 

3.3.3  Phân tích plasmid của các chủng sinh ESBL 49 

3.3.4  Lai Southern Blot xác định vị trí các gen bla trên plasmid 51 

3.3.5  Khả năng tiếp hợp của các plasmid mang gen mã hóa ESBL 53 

3.4  Bàn luận 55 

Chương 4.  KẾT LUẬN và ĐỀ NGHỊ 58 

4.1  Kết luận 59 

4.2  Đề nghị 59  TÀI LIỆU THAM KHẢO I  PHỤ LỤC V 

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

(các tiêu chuẩn lâm sàng và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm)CTX-M Loại ESBL có hoạt tính mạnh trên cefotaxime, được phân lập

đầu tiên ở Munich

dH2O Distilled water (nước cất)

ECL Enhanced Chemiluminescence (hóa phát quang tăng cường)

ESBL Extended-spectrum beta-lactamase (β-lactamase phổ mở rộng)

LB Môi trường Luria – Bertami

SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends

(nghiên cứu về kiểm định khuynh hướng đề kháng kháng sinh)

Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase

TEM Temoneira (một loại enzym β-lactamase được đặt theo tên của

bệnh nhân đầu tiên mang vi khuẩn tiết enzym này)

TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh

UV Ultra violet (tia tử ngoại)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số kháng sinh họ β-lactam 8 

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi dùng để phát hiện gen mã hóa ESBL 32 

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 33 

Bảng 2.3 Chương trình phản ứng PCR 33 

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự 34 

Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR giải trình tự 34 

Bảng 3.1: Kiểu hình đề kháng kháng sinh ở các chủng vi khuẩn sinh ESBL 44 

Bảng 3.2 Đặc điểm gen bla và plasmid mang gen trên các chủng thử nghiệm 54 

Bảng 4.1: Các biến thể của gen bla được sử dụng so sánh trong nghiên cứu V 

Bảng 4.2 : Bảng biện giải giá trị MIC cho các vi khuẩn Enterbacteriaceae V  Bảng 4.3 : Kết quả thử nghiệm đĩa đôi và nồng độ ức chế tối thiểu của các chủng vi khuẩn thử nghiệm VI  Bảng 4.4: Kích thước plasmid ở các chủng sinh ESBL VIII 

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Sự khuếch tán của kháng sinh qua thành tế bào và sự đề kháng kháng

sinh ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm 7 

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các nhóm kháng sinh họ β-lactam 8 

Hình 1.3 Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại TEM 15 

Hình 1.4 : Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại SHV 16 

Hình 1.5 : Sự phân nhóm của CTX-M và vị trí các amino acid 17 

Hình 1.6 : Tỉ lệ các vi khuẩn sinh ESBL ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương 22 

Hình 1.7: Sự phân bố kiểu gen CTX-M trên thế giới, số liệu năm 2009 24 

Hình 2.1 Phương pháp thử nghiệm đĩa đôi 30 

Hình 2.2 Phương pháp xác định MIC 31 

Hình 2.3 Chuyển DNA lên màng bằng máy hút chân không 37 

Hình 2.4 Nguyên lý đánh dấu mẫu dò của bộ kít ECL 38 

Hình 2.5 Nguyên tắc hiện phim 40 

Hình 3.1: Các dạng kiểu hình ESBL 42 

Hình 3.2 Kết quả điện di với các cặp mồi CTX-M-1, CTX-M-9, TEM 46 

Hình 3.3 Kết quả phân tích trình tự gen blaTEM 47 

Hình 3.4: Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-1 48 

Hình 3.5 Kết quả phân tích trình tự gen blaCTX-M-9 49 

Hình 3.6 Độ tương đồng các plasmid của 32 chủng vi khuẩn 51 

Hình 3.7 : Kết quả lai DNA plasmid của các chủng vi khuẩn 52 

Hình 3.8 : Plasmid của các chủng vi khuẩn trước và sau tiếp hợp 53  Hình 4.1 Kích thước thang 1kb ladder (Invitrogen) XIII 

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm trùng cao so với thế giới,

trong đó những vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea như Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, là những tác nhân phổ biến gây ra các bệnh nhiễm trùng

nguy hiểm ở người Việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt hiện nay đã làm cho tình hình vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày một gia tăng [1],[3], [34] Theo đó, một số chủng vi khuẩn Gram âm ở Việt Nam đã đề kháng ngày một mạnh hơn với cephalosporin thế hệ thứ 3 và cả với fluoroquinolon, là những kháng sinh thông dụng trong điều trị những bệnh do các vi khuẩn này gây ra Điều này gây khó khăn cho vấn đề trị liệu, tăng chi phí đồng thời tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân [2],[4],[6], [34],[21],[25]

Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh nhóm cepholosporin phổ rộng trên lâm sàng dẫn đến sự đề kháng của vi khuẩn qua cơ chế tiết enzym beta – lactamase phổ rộng (Extended Spectrum Beta-Lactamase – ESBL) ngày càng gia tăng [39] ESBL

là enzym có khả năng ly giải các kháng sinh thuộc họ beta-lactam, chủ yếu là các cephalosporin phổ rộng, penicillin và aztreonam [29], [12], [24] Các vi khuẩn tiết ESBL cũng thường đa đề kháng với các nhóm kháng sinh khác như aminoglycosid, fluoroquinolon, tetracyclin, chloramphenicol, và sulfamethoxazole – trimethoprim [34],[36],[37] Vi khuẩn tiết ESBL thực sự là gánh nặng trong điều trị nhiễm khuẩn khi mà tần suất và tỷ lệ tử vong trên các bệnh cảnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn này ngày càng gia tăng [8],[15],[16],[40]

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã mô tả các gen chịu trách nhiệm cho sự tiết ESBL, đồng thời cũng chứng minh được plasmid đóng vai trò quan trọng trong việc lan truyền những gen này Phần lớn các gen mã hóa ESBL nằm trên các plasmid có kích thước khác nhau và có khả năng tiếp hợp cao Các plasmid kích thước lớn (hơn

50 kb) mang gen mã hóa ESBL cũng thường mang các gen đề kháng với các kháng sinh khác [9],[32]

Tại Việt Nam có rất ít các nghiên cứu về cơ chế đề kháng cephalosporin cũng như cơ chế lan truyền các gen đề kháng này ở các vi khuẩn Gram âm Trước tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:

- Khảo sát đặc điểm các gen mã hóa enzym ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram

âm phân lập từ bệnh phẩm tại bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất thành phố Hồ Chí Minh

- Đánh giá nguy cơ lan truyền các gen mã hóa ESBL này qua trung gian plasmid

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)

Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae là một họ rất lớn, phân bố rộng

trên người, động vật, thực vật và ngoài môi trường Nơi thường gặp nhất là ruột người và các loài động vật, đây cũng là nguồn gốc của từ “đường ruột” trong thuật

ngữ tên họ của chúng (Entero – ruột, bacteri – vi khuẩn, aceae – họ) [3]

Một vi khuẩn được xếp vào họ vi khuẩn đường ruột khi có các tính chất sau: trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không có enzym oxidase, lên men đường glucose (sinh gas hoặc không), khử nitrat thành nitrit, có khả năng di động nhờ chu mao hoặc không, không sinh bào tử [3]

Họ vi khuẩn đường ruột có tầm quan trọng bậc nhất trong y học bởi có nhiều loài có khả năng gây bệnh ở người, trong đó có những loài có thể gây thành dịch [38] Chúng chiếm tới hơn 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người [34] Họ

vi khuẩn này đứng đầu trong các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết Ngoài ra, chúng có thể gây viêm đường mật, viêm phổi ở trẻ sơ sinh, viêm màng não, nhiễm khuẩn trong ngoại khoa, nhiễm khuẩn trong bỏng,… Tuy nhiên, 95% các chủng phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng tập trung vào 10 chi với khoảng 20 loài Trong đó, hai vi

khuẩn E coli và K pneumoniae thường chiếm đa số [14] Các yếu tố độc lực chính

của họ vi khuẩn này là khả năng bám vào tế bào vật chủ, khả năng xâm nhập, khả năng sản sinh các độc tố (nội và ngoại độc tố) và các gen độc lực Tùy thuộc vào vị trí gây bệnh mà cơ chế gây bệnh của họ vi khuẩn này có những điểm rất khác nhau [3],[16],[40]

1.1.1 Escherichia coli (E coli)

Escherichia coli do Theodore Echerich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học

người Áo, phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 E coli là vi khuẩn điển hình của chi Escherichia E coli là thành viên thuộc hệ vi khuẩn bình thường của đường tiêu

hóa, chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Chúng có

thể sản xuất ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin), hemolysin, enzym phân hủy một

số kháng sinh (β-lactamase), bacteriocin [3]

E coli là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu trong các tác nhân gây

tiêu chảy (ETEC – Enterotoxigenic E coli), viêm đường tiết niệu (UPEC – Uropathogenic E coli), viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não (MAEC – Meningitidis-associated E coli), viêm phổi ở trẻ sơ sinh [4],[3]

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số

có thể phát triển trên các môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 400C Nhiệt độ tối ưu 370C Trong điều kiện thích

hợp E coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút [3] 1.1.2 Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae)

Klebsiella là một trong những chi quan trọng của họ vi khuẩn đường ruột,

được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức, Edwin Klebs (1834-1913) Trong

đó, K pneumoniae là loài quan trọng nhất và cũng là đại diện điển hình của chi này

[3]

K pneumoniae chủ yếu gây bệnh cơ hội, ở cộng đồng hoặc trong bệnh viện –

là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp K

pneumoniae subsp pneumoniae gây viêm phổi (như tên gọi) đã được biết đến từ

lâu; bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinh, tỉ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị sớm Ngoài ra, nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm tai giữa, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, … [3]

Yếu tố độc lực chính của K pneunoniae là nội độc tố LPS

(lipopolysaccharide) Ngoài ra, chúng còn sinh ra hai loại độc tố ruột (chịu nhiệt và không chịu nhiệt) và bacteriocin (microcin E492) có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác và cảm ứng quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào chủ [3]

Nguồn lây Klebsiella chủ yếu từ đường ruột; ngoài ra có thể từ họng và da

Klebsiella là loại hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi

cấy thông thường Vi khuẩn này có thể xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều đường khác nhau như qua các dụng cụ y tế, qua bàn tay nhiễm khuẩn, qua thức ăn, …[3]

1.2 Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam

1.2.1 Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt động

Beta- lactam là một họ kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, chiếm hơn một nữa các kháng sinh được sử dụng trong điều trị [19],[24] Về mặt cấu trúc, các kháng sinh trong họ này đều có vòng β-lactam Về mặt cơ chế, chúng tác động vào quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn Quá trình này bắt đầu khi các kháng sinh có tính thân nước (như β-lactam) đi qua lớp màng ngoài nhờ sự vận chuyển của các kênh porin, β-lactam gắn vào các protein PBP (penicillin binding protein) – transpeptidase và carboxypeptidase – enzym chịu trách nhiệm chuyển nhóm peptide trong quá trình tổng hợp peptidoglycan Khi đó, quá trình tổng hợp peptidoglycan bị xáo trộn, sự phân chia

tế bào ngừng lại làm tế bào bị ly giải hoặc biến dạng, vi khuẩn chết do khác biệt áp suất thẩm thấu Tương tác giữa PBP với β-lactam nhờ vào ái lực của cấu trúc vòng β-lactam với vị trí hoạt động của PBP Chính vì vậy mà sự hiện diện của vòng β-lactam là cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của các kháng sinh thuộc họ này [1], [24]

 Hình 1.1 : Sự khuếch tán của kháng sinh qua thành tế bào và sự đề kháng kháng

sinh ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm [11]

1.2.2 Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn

Để chống lại sự tương tác giữa β-lactam và PBP, phức hợp acyl-enzym được hình thành và phá vỡ liên kết C-N trong cấu trúc vòng lactam Các đột biến điểm xuất hiện trong quá trình tiến hóa của một số PBP, làm phát sinh một loại enzym β-lactamase – enzym có khả năng thủy phân vòng lactam của kháng sinh So sánh trình tự của tất cả PBP và β-lactamase chứng minh một giả thuyết liên quan đến sự tồn tại một nguồn gốc chung của các protein này.Sự đề kháng với kháng sinh β-lactam của vi khuẩn liên quan đến một trong các cơ chế sau: (i) sự tổng hợp β-lactamase phá hủy các kháng sinh này; (ii) sự giảm bớt, biến mất hay thay đổi đặc tính chức năng của một vài porin sẽ dẫn đến tính thấm của kháng sinh vào vi khuẩn; (iii) thay đổi cấu trúc của PBP; (iv) hoạt động của các kênh bơm kháng sinh ra khỏi

tế bào vi khuẩn (efflux system) Sự tổng hợp β-lactamase được xem như cơ chế đề kháng chủ yếu của các chủng lâm sàng quan trọng ở vi khuẩn Gram-âm với các kháng sinh họ β-lactam [1],[24]

1.2.3 Phân loại β-lactam

Beta-lactam được chia thành 4 nhóm chính dựa theo cấu trúc hóa học: penicillin, monobactam, cephalosporin, carbapenem (Bảng 1.1) Tất cả chúng đều

có vòng β-lactam và bị thủy phân bởi enzym β-lactamase Các nhóm khác nhau bởi các vòng được gắn thêm vào như là vòng thiazolidine đối với penicillins, không có vòng đối với monobactams, nhân cephem đối với nhóm cephalosporins hay là cấu trúc vòng đôi với nhóm carbapenems (Hình 1.2) [19]

 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các nhóm kháng sinh họ β-lactam [28]

Bảng 1.1 Một số kháng sinh họ β-lactam [19]

Penicillin Penicillin G, penicillin

Penicillin kháng lại penicillinase : methicillin, nafcillin,

oxacillin, cloxacillin Aminopenicillin : ampicillin, amoxicillin

Carboxypenicillin: carbenicillin, ticarcillin Ureidopenicillin: mezlocillin, piperacillinCephalosporin Thế hệ I: cefazolin, cephalothin, cephalexin

Thế hệ II: cefuroxime, cefaclor, cefamandole, cefamycins

(cefotetan, cefoxitin)Thế hệ III: cefotaxime, ceftriaxone, cefpodoxime, ceftizoxime,

cefoperazone, ceftazidimeThế hệ IV: cefepime, cefpiromeCarbapenem Imipenem, meropenem, ertapenem

Monobactam Aztreonam

1.3 Enzym β -lactamase

1.3.1 Định nghĩa

Beta-lactamase là một enzym có khả năng thủy phân vòng β-lactam giúp cho

vi khuẩn đề kháng lại với kháng sinh này Các β-lactamase được mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể hoặc trên các plasmid Trong đó, plasmid được xem là nguyên nhân chính làm phát tán tính đề kháng ở vi khuẩn [9]

1.3.2 Phân loại

Ở vi khuẩn Gram dương, β-lactamase được tiết ra bên ngoài môi trường như một enzym ngoại bào Nhưng ở vi khuẩn Gram âm, chúng được giữ lại khoảng chu chất (periplasmic space), ở đó chúng có thể tấn công kháng sinh trước khi các kháng sinh này đến được các vị trí tác động (receptor) của nó [19],[29]

Cho đến nay đã có hơn 500 loại β-lactamase được biết đến, và con số này không ngừng gia tăng hàng năm [24] Về cơ bản, các enzym khác nhau ở khả năng thủy phân vòng β-lactam của kháng sinh Sự phân loại β-lactamase tùy thuộc đặc tính hóa lý, khả năng ức chế, vị trí gen (gen trên plasmid hay trên nhiễm sắc thể), ký chủ thường gặp, trình tự nucleotide hoặc thành phần amino acid, vị trí enzym ở vi khuẩn (phía ngoài tế bào hay khoảng không chu chất) và những cơ chất tương ứng

Có hai hệ thống phân loại của β-lactamase: hệ thống phân loại Ambler dựa vào cấu trúc phân tử của enzym, hệ thống phân loại của Bush-Jacoby-Medeiros dựa vào chức năng và đặc tính sinh hóa của enzym [19], [24], [29]

• Hệ thống phân loại Ambler chia β-lactamase thành 4 lớp chính (A-D)

− Beta-lactamase lớp A, C và D có cơ chế hoạt động phụ thuộc serin Những enzym này có hoạt tính chống lại các kháng sinh thuộc nhóm penicillins, monobactams, cephalosporins

− Beta-lactamase lớp B là các metalo β-lactamase có cơ chế hoạt động phụ thuộc kim loại Những enzym này sử dụng một ion kim loại hóa trị hai, thường là kẽm, liên kết với một gốc histidine hoặc cysteine hoặc cả hai, để

phản ứng với nhóm carbonyl của liên kết amide của hầu hết các penicillins, cephalosporins và carbapenems, nhưng không có tác động trên monobactams

• Hệ thống phân loại mới nhất của Bush-Jacoby-Medeiros (1995) chia lactamase thành 4 nhóm chính (1-4) và các phụ nhóm (a-f)

β-− Nhóm 1 là các cephalosporinase không bị ức chế bởi acid clavulanic (lớp C) Các gen mã hóa enzym này thường nằm trên NST hơn là trên plasmid Các enzym thường gặp là AmpC, CYM, FOX, MOX, …

− Nhóm 2 là các penicillinase hoặc cephalosporinase bị ức chế bởi acid clavulanic, tương ứng với lớp A và D gồm các enzym đầu tiên là TEM và SHV Với sự gia tăng các biến thể của TEM, SHV và sự xuất hiện các enzym mới, nhóm 2 được phân thành hai phụ nhóm 2a và 2b

Phụ nhóm 2a chỉ chứa penicillinase trong khi phụ nhóm 2b là các lactamase phổ rộng do chúng có khả năng bất hoạt cả penicillin và cephalosoprin

β-Phụ nhóm 2b lại bao gồm 2be và 2br Trong đó, 2be là các β-lactamase phổ

mở rộng hay ESBL (ký tự “e” trong 2be nghĩa là mở rộng – extended) gồm các biến thể của TEM và SHV, các β-lactamase mới xuất hiện như CTX-M, VEB, PER, GES, IBC,… Loại 2br là các biến thể khác của TEM hoặc SHV có khả năng đề kháng lại với chất ức chế β-lactamase như clavulanic acid và sulbactam, nhưng vẫn nhạy cảm với tazobactam

Phụ nhóm 2d là các oxacillinase (OXA) có khả năng bất hoạt cloxacillin mạnh hơn benzylpenicillin, một số khác thủy phân được carbenicillin; các enzym này thường ít bị ức chế bởi clavulanic acid, và một vài enzym trong phụ nhóm này là các ESBL

Phụ nhóm 2c là các enzym có khả năng bất hoạt carbenicillin hơn là benzylpenicillin Phụ nhóm 2e là các cephalosporinase có khả năng thủy

phân monobactam, bị ức chế bởi clavuclanic acid Phụ nhóm 2f được thêm vào vì chúng là các carbapenemase hoạt động phụ thuộc serin; nhưng các carbapenemase khác hoạt động phụ thuộc kim loại thì thuộc nhóm 3

− Nhóm 3 là các metalo-β-lactamase lớp B, hoạt động phụ thuộc kim loại hóa trị hai, các enzym này không bị ức chế bởi clavulanic acid nhưng bị ức chế bởi EDTA Chúng có khả năng thủy phân penicillin, cephalosporin và carbapenem Một số enzym thuộc nhóm này là IMP, VIM, NDM-1, …

− Nhóm 4 là các penicillinase không bị ức chế bởi acid clavulanic, các enzym nhóm này không thuộc lớp nào trong hệ thống phân loại Ambler

1.4 Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL)

1.4.1 Định nghĩa

ESBL là các β-lactamase có khả năng thủy phân các penicillin, cephalosporin từ thế hệ I đến thế hệ III và monobactam ngoại trừ carbapenem, làm cho vi khuẩn đề kháng lại với các kháng sinh này ESBL bị ức chế bởi các chất ức chế β-lactamase như clavulanic acid và sulbactam [29]

1.4.2 Phân loại

Các ESBL được xếp vào nhóm A và D theo Ambler hay nhóm 2be và 2d trong hệ thống phân loại Bush-Jacoby-Medeiros Thuật ngữ ESBL ban đầu đề cập đến các enzym thuộc nhóm 2be, có nguồn gốc từ TEM và SHV có khả năng thủy giải các oxyimino-cephalosporin Về sau, thuật ngữ này được mở rộng với enzym thuộc các nhóm sau: CTX-M và VEB có cùng hoạt phổ nhưng không bắt nguồn từ TEM và SHV; các thể đột biến của TEM và SHV có khả năng thủy giải oxyimino-cephalosporin (như ceftazidim); và các thể đột biến của OXA và AmpC tăng tính kháng với cefepime (cephalosporin thế hệ IV)[22]

Các loại ESBL khác nhau do đột biến di truyền Những thay đổi nhỏ về nucleotid dẫn đến sự thay thế acid amin này bằng acid amin kia trên vùng hoạt động của enzym ESBL, dẫn đến khả năng thủy phân khác nhau giữa các loại ESBL Các

gen mã hóa enzym nhóm này thường nằm trên plasmid, điều này làm cho các gen

có điều kiện lan truyền từ loài này qua loài khác hoặc giữa các cá thể khác nhau trong cùng loài Đề kháng thu được phát sinh trong quá trình phát triển của vi khuẩn, do một biến cố di truyền nào đó Hầu hết các đề kháng thu được thường đi kèm với các yếu tố di truyền di động như plasmid, transposon, yếu tố IS (insertion element), integron lớp 1 và integron chứa yếu tố ISCR1 Cơ chế đa dạng của sự truyền thông tin này góp phần phát tán các gen đề kháng một cách nhanh chóng [24], [36]

Ba loại chính của ESBL là TEM, SHV và CTX-M được xem là phổ biến và

có tầm ảnh hưởng rộng lớn nhất Các loại ESBL này vẫn không ngừng biến đổi; ngày càng tăng về số lượng và phức tạp hơn về đặc tính [27]

• ESBL loại TEM

TEM-1 được báo cáo đầu tiên vào năm 1965 trên vi khuẩn E coli từ một

bệnh nhân tên Temoneira ở Hy Lạp Các plasmid chứa TEM-1 được tìm thấy ở các

vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, P aeruginosa, Haemophilus influenza,

Neisseria gonorrhoeae, … TEM-1 có đặc tính thủy phân hiệu quả penicillin và

cephalosporin thế hệ I TEM-2 và TEM-13 là các biến thể của TEM-1 có cùng đặc tính đề kháng Do đó, TEM-1, TEM-2 và TEM-13 là các β-lactamase phổ rộng (Broad-spectrum β-lactamases) không phải là ESBL [24],[29]

Các ESBL loại TEM đều bắt nguồn từ TEM-1 và TEM-2 TEM-3, tên trước đây là CTX-1 vì có hoạt tính thủy phân cefotaxim, được xác định là β-lactamase

qua trung gian plasmid phân lập từ K pneumoniae tại Pháp (1984) TEM-3 khác với TEM-2 bởi sự thay thế 2 amino acid Tuy nhiên, TEM-12 phân lập từ vi khuẩn K

oxytoca tại Anh năm 1982 do gen mã hóa nằm trên plasmid mới là ESBL loại TEM

đầu tiên [29]

Ngày nay, hơn 170 thành viên của loại enzym này được mô tả và các dữ liệu

về β-lactamase vẫn được cập nhập thường xuyên Cấu trúc nguyên thủy của TEM-1 gồm 288 gốc amino acid Các dạng phát sinh của TEM đều là các biến thể của

TEM-1 và khác với dạng nguyên thủy bởi sự thay thế amino acid (từ 1 đến 7 amino acid) Các đột biến được tìm thấy ở 60 vị trí, nhưng tấn suất đột biến ở mỗi vị trí rất khác nhau [24]

Các đột biến thường xảy ra ở vị trí 21, 39, 69, 104, 164, 182, 238, 240, 244, 265, và

275 trên trình tự amino acid Trong đó, đột biến ở vị trí 104, 164, 238 và 240 là chìa khóa để các vi khuẩn mở rộng hoạt động đối với cơ chất [Hình 1.3]

• ESBL loại SHV

Βeta-lactamase loại SHV (Sulfhydryl reagent variable) xuất hiện sau loại

TEM SHV-2 là loại ESBL đầu tiên, được phát hiện trên vi khuẩn Klebsiella

ozaenae tại Đức (1983) Đây là thể đột biến của SHV-1, β-lactamase dạng SHV

chịu trách nhiệm cho sự đề kháng với ampicillin qua trung gian plasmid ở K

pneumoniae SHV-2 khác SHV-1 bởi thay thế một amino acid tại vị trí 238

(Gly238Ser), có khả năng thủy phân hiệu quả cefotaxim và kém hiệu quả với ceftazidim [29]

Hiện đã phát hiện 126 thể đột biến của SHV (nguồn http://www.lahey.org/studies/) (Hình 1.4) Tất cả đều bắt nguồn từ SHV-1 và khác nhau không chỉ ở sự hiện diện các đột biến điểm mà còn là các đột biến mất hay đột biến chèn Các vị trí thường xảy ra đột biến là 35, 238 và 240; và chúng được xem như điểm then chốt cho tính đặc hiệu đối với cơ chất [24]

Các β-lactamase loại SHV được tìm thấy chủ yếu ở các vi khuẩn

Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter spp [29]

• ESBL loại CTX-M

Các gen mã hóa enzym CTX-M được xác định có nguồn gốc từ nhiễm sắc

thể của một số loài thuộc giống Kluyvera, là các vi khuẩn phân lập từ môi trường và

hiếm khi gây bệnh trên người [18] CTX-M-1 là β-lactamase có khả năng thủy phân

hiệu quả cefotaxim, lần đầu tiên được phát hiện tại Munich (Đức) năm 1989 trên vi

khuẩn E coli Đó là ESBL không-TEM, không-SHV với ít hơn 40% tương đồng

với các TEM và SHV [33] Một chủng vi khuẩn có thể mang gen mã hóa đồng thời CTX-M và SHV hoặc CTX-M và AmpC, điều này có thể làm biến đổi kiểu hình đề kháng [29]

Các gen mã hóa cho CTX-M nằm trên plasmid loại IncF, loại có khả năng

tiếp hợp cao, có kích thước từ 50 kb đến 200 kb [9] Gen blaCTX-M được xác định nằm dưới vùng trình tự gắn chèn ISEcp1, trình tự giúp cho gen có khả năng chèn vào một đoạn DNA khác dễ dàng Điều này, giúp làm rõ hơn nguồn gốc của blaCTX-

M khi có thể chuyển từ nhiễm sắc thể của vi khuẩn Kluyvera sang E coli [18]

Ngày nay, người ta đã biết hơn 90 loại CTX-M, được phân vào 5 phân nhóm, mỗi phân nhóm chứa các enzym đặc trưng (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 và CTX-M-25) và mỗi thể đột biến khác nhau ở một hoặc vài đột biến (Hình 1.5) Các đột biến ở vị trí 167 và 240 là các đột biến then chốt, dẫn đến sự thay cấu hình đặc hiệu với cơ chất [24]

Hình 1.3 Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại TEM [24]

Hình 1.4 : Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại SHV [24]

Hình 1.5 : Sự phân nóm của CTX-M và vị trí các amino acid [24]

1.4.3 Phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL

Trên nguyên tắc, các phương pháp phát hiện ESBL bao gồm 2 bước sau:

• Thử nghiệm sàng lọc: bước này nhằm kiểm tra sự đề kháng hoặc giảm nhạy cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn bằng cách sử dụng một hay nhiều cephalosporins như cefpodoxime, ceftazidime, cefotaxime, hoặc ceftriaxone Thử nghiệm này có thể tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch hoặc pha loãng kháng sinh [29]

• Thử nghiệm xác nhận: các chủng nghi ngờ sinh ESBL trong thử nghiệm sàng lọc sẽ được kiểm tra sự hiệp lực giữa oxyimino-cephalosporin và clavulanate, nhằm phân biệt giữa các chủng sinh ESBL thật sự và các chủng

đề kháng không phải ESBL Thử nghiệm này được phát triển bởi nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp của Jarlier (1988), Jacoby và Han (1996) hoặc theo chỉ dẫn của CLSI (2009) [24], [29] Ngoài ra, còn có thể sử dụng các kit thương mại như E-test® (AB Biodisk, Thụy Điển), Vitek ESBL (Biomerieux, USA), BD Phoenix, Becton Dickinson Biosciences (Sparks, Md) [29]

Theo đề nghị của CLSI (2009), tác dụng hiệp lực giữa đĩa ceftazidim (30µg)

và ceftazidim/acid clavulanic (30/10µg) hoặc cefotaxim (30µg) và cefotaxim/acid clavulanic (30/10µg) được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Khi đường kính vòng kháng khuẩn của đĩa kháng sinh phối hợp với acid clavulanic ≥ 5

mm so với đĩa chỉ chứa ceftazidim hoặc cefotaxim thì chủng đó được xác nhận là mang kiểu hình ESBL [31]

Hạn chế của các phương pháp này là xảy ra các trường hợp dương tính giả và

âm tính giả Một số chủng K pneumoniae hoặc E coli không có ESBL nhưng lại

sản xuất quá mức các β-lactamase loại TEM và SHV kháng clavulanic acid có thể cho kết quả dương tính giả Trường hợp âm tính giả xảy ra khi một số chủng đồng thời mang cả gen mã hóa AmpC-β-lactamase và ESBL Sự kết hợp này làm chúng trở nên đề kháng với clavulanic acid bởi tác động của AmpC-β-lactamase [29]

1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen ESBL

Một số phương pháp thông dụng để xác định kiểu gen ESBL như phương pháp lai DNA, phương pháp khuếch đại DNA (PCR) hay phương pháp giải trình tự DNA

• Phương pháp lai DNA với các mẫu dò DNA đặc hiệu với gen mã hóa các enzym họ TEM, SHV hay CTX-M Các oligonucleotide được thiết kế để tìm các đột biến điểm của từng loại ESBL dưới điều kiện lai nghiêm ngặt Phương pháp này được sử dụng rất sớm từ cuối những năm 80 để phát hiện các enzym này Tuy nhiên, đây là một phương pháp công phu và tốn kém [30]

• Phương pháp PCR có khả năng phát hiện các gen ESBL nhờ khuếch đại đoạn gen mã hóa enzym này bằng các cặp mồi đặc hiệu Mồi được thiết kế trong các vùng bảo tồn (vùng gen ít bị đột biến) dựa trên trình tự sẵn có của các gen này được công bố trên các cơ sở dữ liệu như NCBI Đây là một phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi Mặc dù vậy, phương pháp này cũng không thể phân biệt được tất cả các biến thể trong từng họ enzym [30]

• PCR-RFLP (PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism) được áp

dụng để phát hiện có hiệu quả các biến thể ở mỗi loại ESBL Sản phẩm khuếch đại được cắt bởi enzym cắt giới hạn sau đó được tách ra bằng điện di trên gel agarose để phát hiện các đột biến Các kích thước khác nhau của sản phẩm cắt cho thấy các đột biến điểm bên trong cấu trúc gen mã hóa ESBL, từ

đó có thể phân biệt các biến thể enzym khác nhau [30]

• Giải trình tự DNA (DNA sequencing) hiện được coi là tiêu chuẩn vàng trong xác định gen mã hóa β-lactamase Phương pháp này có thể phát hiện được hầu hết các biến thể enzym khác nhau [30]

1.5 Plasmid

Plasmid là nhân tố di truyền nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng sao chép độc lập Plasmid được phân lập từ vi khuẩn chủ yếu là các DNA mạch đôi, dạng vòng siêu xoắn, đôi khi ở dạng mạch thẳng Plasmid có thể mang các gen có lợi cho sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn như các gen kháng kháng sinh, gen cần cho sự xâm nhiễm và gây độc của vi khuẩn vào tế bào chủ; hoặc các plasmid mang các gen mã hóa cho bacteriocin giúp vi khuẩn mang chúng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn cùng loài không mang plasmid hoặc với các vi khuẩn khác loài Ngoài ra plasmid còn có thể mang các gen giúp vi khuẩn tồn tại trong các môi trường khắc nghiệt như môi trường chứa kim loại nặng, thuốc tẩy rửa [9]

Các plasmid mang gen đề kháng kháng sinh của họ vi khuẩn

Enterobacteriaceae là loại có số bản sao thấp (1 đến 2 bản sao/ tế bào), kích thước

từ 50 đến 200 kb Đa số là các plasmid có thể tiếp hợp được nhờ mang nhiều locus

chuyển vị (transfer loci), đặc biệt là traD, traI và traX [10]

1.6 Tình hình dịch tễ học của các vi khuẩn sinh ESBL

Các chủng vi khuẩn sinh ESBL thuộc họ Enterobacteriaceae chiếm một tỉ lệ

rất cao lên đến 90% trong các vi khuẩn sinh ESBL [23], thường tập trung ở hai loài

là E coli và K pneumoniae [32] Bên cạnh đó, khả năng sinh ESBL còn tìm thấy ở một số loài Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., P mirabilis, và P

aeruginosa [29] Tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL rất khác nhau giữa các vùng trên thế

giới, giữa các nước trong cùng một vùng, và giữa các thành phố, bệnh viện trong cùng một nước [38] Đáng lưu ý là, tần số xuất hiện vi khuẩn sinh ESBL ngày một gia tăng theo thời gian [32]

1.6.1 Tình hình trên thế giới

Các chủng sinh ESBL được phân lập và phát hiện đầu tiên ở Châu Âu vào

giữa thập niên 1980 trên các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae, sau đó không lâu các

vi khuẩn này được tìm thấy ở Mỹ và một số nước châu Á [30] Nghiên cứu SMART (Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends) năm 2002-2004, cho thấy

các vi khuẩn (E coli và K pneumoniae) sinh ESBL ở khu vực châu Á cao hơn so

với châu Âu và Bắc Mỹ, nhưng lại thấp hơn ở các nước Nam Mỹ [38] Số liệu từ nghiên cứu SMART vùng châu Á – Thái Bình Dương 2007, cho thấy khuynh

hướng này đã thay đổi Tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL (chủ yếu là E coli và K

pneumoniae) ở vùng châu Á - Thái Bình Dương chiếm 40% trong tổng số các trực

khuẩn Gram âm, tỉ lệ này cao hơn so với châu Mỹ Latin (30%), các nước Trung Đông và châu Phi (17%), châu Âu (10%), và Bắc Mỹ (8%) Hơn nữa, tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL ở châu Á cũng đã gia tăng từ 15% (2003) đến 40% (2007) [36]

Nghiên cứu này cũng cho thấy tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL khác nhau ở các nước Vi khuẩn sinh ESBL hiện diện với tỉ lệ thấp ở Australia và New Zealand Các nước có tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL cao là Trung Quốc (55%), Thái Lan (50,8%), Việt Nam (34,4%), Singapore (33,3%) và đặc biệt ở Ấn Độ 79% [36] Báo cáo mới nhất (2011) thuộc dự án kiểm soát đề kháng kháng sinh vùng châu Á – Thái Bình Dương, cho thấy rằng các nước có tỉ lệ vi khuấn sinh ESBL trên 50% là Trung Quốc, Ấn Độ, Saudi Arabia và Việt Nam (Hình 1.6) [15] Điều đáng lo ngại là với tỉ

lệ vi khuẩn sinh ESBL rất cao tập trung ở các nước đông dân như Trung Quốc và

Ấn Độ, gần 2,5 tỉ người, thì đây là nguồn chứa vi khuẩn sinh ESBL lớn nhất thế giới [36] Nguy hiểm hơn, tỉ lệ tử vong do vi khuẩn sinh ESBL ở mức rất cao trên 50% [40], [16]

Ngoài ra, tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL trong nhiễm khuẩn bệnh viện cao hơn so với nhóm nhiễm khuẩn cộng đồng Tỉ lệ này cũng rất khác nhau ở từng quốc gia Trong một nghiên cứu ở Đài Loan (2010), tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL chênh lệch nhau

11 lần giữa nhóm nhiễm khuẩn bệnh viện (45,7%) và nhiễm khuẩn cộng đồng (4,1%) [40] Trong khi đó, một nghiên cứu ở Ấn Độ (2010) tỉ lệ này là 85,4% trong nhiễm khuẩn bệnh viện và 53% đối với nhiễm khuẩn cộng đồng [8]

Hình 1.6: Tỉ lệ các vi khuẩn sinh ESBL ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương [15]

1.6.2 Tình hình Việt Nam

Tại Việt Nam, tình hình nhiễm khuẩn sinh ESBL trong những năm qua ngày càng gia tăng Theo báo cáo tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997 trên 222 chủng vi

khuẩn Enterobacteriaceae tỉ lệ sinh ESBL là 6,3%, trong đó chưa phát hiện E coli

sinh ESBL [7] Tuy nhiên, vi khuẩn sinh ESBL bắt đầu gia tăng nhanh chóng, lên đến 33% (58/175 chủng) trong một nghiên cứu ở bệnh viện Nhiệt Đới năm 2002-

2004 trên các nhiễm khuẩn bệnh viện Trong đó các vi khuẩn chiếm đa số là E coli

và K pneumoniae [6] Gần đây, các nghiên cứu trên vi khuẩn Gram âm ở vùng

Châu Á- Thái Bình Dương cho thấy tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL ở Việt Nam tăng từ 34% năm 2007 [36] đến hơn 50% năm 2011 [15]

Các vi khuẩn sinh ESBL thường có kiểu hình đề kháng với nhiều loại kháng sinh Trong một nghiên cứu ở bệnh viện 108 (Hà Nội) năm 2007 – 2009 cho thấy các vi khuẩn sinh ESBL thường kháng đồng thời từ 6 đến 8 kháng sinh Chủng vi khuẩn đề kháng đồng thời đến 8 kháng sinh gia tăng từ 15,4% (2008) lên đến 25% (2009) [5] Các vi khuẩn sinh ESBL từ nhiễm khuẩn bệnh viện thường đề kháng với gentamicin và ciprofloxacin với tỉ lệ rất cao lần lượt là 70% và 72,5% [34]

1.7 Dịch tễ học phân tử và sự phát tán các loại ESBL

1.7.1 Tình hình trên thế giới

Sự phát tán các ESBL bắt nguồn từ châu Âu sau đó lan sang châu Mỹ và các nước châu Á [29] ESBL SHV là loại chủ yếu ở châu Á vào những năm 1990, đặc biệt là SHV-5 và SHV-12 rất phổ biến ở Nhật và Hàn Quốc cho đến nay [27] ESBL

loại CTX-M bắt đầu xuất hiện ở châu Âu trên các vi khuẩn Enterobacteriaceae từ

năm 1989 Với tốc độ lan truyền và gia tăng số lượng các biến thể một cách nhanh chóng, CTX-M đã thay đổi sự phân bố ESBL trên thế giới [24] Các ESBL loại

CTX-M ngày càng chiếm ưu thế trên các vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là trên E coli

và K pneumoniae phân lập ở các nước châu Âu, châu Mỹ Latin và châu Á – Thái

Bình Dương [13] (Hình 1.7) Ngoài ra, còn có các ESBL loại VEB, GES ⁄ IBC, PER, TLA, BES và SFO hiện diện với tỉ lệ thấp [18]

Các gen blaCTX-M chiếm đến 83% và 71% lần lượt ở vi khuẩn E coli và K

pneumoniae, trong khi blaSHV chỉ chiếm 28% (E coli) và 41% (K pneumoniae), và

blaTEM chiếm tỉ lệ không đáng kể trong một nghiên cứu đa quốc gia trên các vi

khuẩn E coli và K pneumoniae sinh ESBL năm 2008 Nghiên cứu này đã cho thấy

được khuynh hướng phân bố ESBL trên thế giới, nhất là sự phân bố rộng khắp của CTX-M-15[13]

Enzym CTX-M-15 lần đầu tiên phát hiện ở Ấn Độ năm 2001 [20], đến nay

đã trở thành enzym phổ biến ở các nước châu Á [27] và trên khắp thế giới [32] Enzym này nằm trên các plasmid thuộc nhóm IncFII trong hệ thống phân loại theo tính không tương hợp của plasmid (plasmid incompatibility) , có kích thước từ 85

đến 160 kb Hầu hết, các plasmid chứa blaCTX-M-15 cũng đồng thời mang gen bla

TEM-1, blaOXA-1 và aac(6′)-Ib-cr (aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase loại Ib-cr có vai

trò trong sự đề kháng với cả aminoglycosid và một số fluoroquinolon) Gen bla

CTX-M-15 nằm cạnh trình tự ISEcp1 - trình tự có khả năng gắn chèn - được cho là di chuyển từ nhiễm sắc thể của vi khuẩn Kluyvera [39]

Trong một nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2009 trên các vi khuẩn K

pneumonia mang cả AmpC và ESBL, lại cho thấy blaTEM và blaCTX-M có tần số xuất hiện cao nhất lần lượt là 77,8% và 50% Một vài chủng vi khuẩn có thể mang một lúc đến 6 gen mã hóa β-lactamase trong đó chủ yếu là TEM-1, TEM-11, SHV-13, SHV-28, CTX-M-9, CTX-M-22, CTX-M-55, OXA-1, LEN, OKP-6 and DHA-1 Nghiên cứu cũng cho thấy rằng, các gen mã hóa cho SHV-28, CTX-M-22, CTX-M-

55 dễ dàng được truyền từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác thông qua tiếp hợp Khi kiểm tra kiểu hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn cho và vi khuẩn nhận đã chứng minh được đề kháng các β-lactam và aminoglycoside luôn song hành cùng nhau Ngoài ra, sự hiện diện của nhiều gen mã hóa β-lactamase (nhiều ESBL hay cả AmpC và ESBL) trong cùng một chủng vi khuẩn sẽ làm thay đổi kiểu hình đề kháng gây khó khăn trong việc xác định kiểu hình ESBL[35]

Hình 1.7: Sự phân bố kiểu gen CTX-M trên thế giới, số liệu năm 2009[32]

1.7.2 Tình hình Việt Nam

Có rất ít các nghiên cứu tại Việt Nam về những gen chịu trách nhiệm sinh ESBL cũng như plasmid mang các gen này Một nghiên cứu năm 2001 tại các bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, cho thấy các gen mã hóa cho TEM, SHV, CTX-M

và VEB-1 chiếm tỉ lệ lần lượt là 76,3%, 38,1%, 25,5% và 25,5%; với sự hiện diện

độc lập hoặc kết hợp nhiều gen trong cùng một vi khuẩn sinh ESBL Trong đó, chủ yếu là các gen mã hóa TEM-1, SHV-1, SHV-2, CTX-M-14, CTX-M-17 và VEB-1

ở các vi khuẩn E coli, K pneumoniae và P mirabilis Nghiên cứu còn xác định được gen blaCTX-M nằm dưới vùng trình tự gắn chèn ISEcpl Các gen blaGES-1 và

blaPER-1 không được tìm thấy [41]

Một nghiên cứu tại bệnh viện Nhiệt Đới năm 2009 trên vi khuẩn Shigella

spp sinh ESBL đã xác định các CTX-M-24 và CTX-M-15 là loại lưu hành phổ biến, gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có kích thước lớn lần lượt là

70 và 100 kb Các plasmid này chứa các yếu tố cần thiết cho việc tiếp hợp (trình tự

tra) và khả năng gắn chèn – các gen mã hóa CTX-M nằm dưới vùng trình tự gắn

chèn ISEcp1 Ngoài ra, các chủng sinh ESBL còn đề kháng với nhiều loại kháng

sinh như ampicillin, trimethoprim – sulfamethoxazole, tetracycline và nalidixic acid [25]

Chương 2 VẬT LIỆU và PHƯƠNG PHÁP

2.1 Chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm ở hai bệnh viện tại

TP HCM (bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất) từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2010 theo quy trình xét nghiệm tại mỗi bệnh viện Các chủng vi khuẩn được phân lập, định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ Dựa trên kết quả kháng sinh đồ của bệnh viện, các chủng vi khuẩn có đường kính vòng kháng khuẩn < 22 mm trên ceftazidim 30 µg, cho thấy có sự giảm nhạy cảm với kháng sinh cephalosporin thế

hệ 3 Các chủng này nghi ngờ có khả năng sinh ESBL được thu thập lại Chúng tôi chỉ đưa vào nghiên cứu các chủng có kết quả định danh rõ ràng và thử nghiệm đĩa đôi dương tính với kiểu hình ESBL khi được thực hiện lại tại phòng thí nghiệm vi sinh của OUCRU

Nghiên cứu này thực hiện trên 32 chủng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL, trong

đó, 23 chủng E coli (21 chủng phân lập được tại bệnh viện Chợ Rẫy và 2 chủng tại bệnh viện Thống Nhất), 9 chủng K pneumoniae (3 chủng tại bệnh viện Chợ Rẫy và

6 chủng tại bệnh viện Thống Nhất)