Tổng hợp và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope kháng nguyên ha virus cúm a h5n1 được nhận diện bởi tế bào b

Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế bào T, tế bào B từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình dự đoán epitop

-oOo -

TRẦN THỊ NHƯ THÙY

TỔNG HỢP VÀ KIỂM CHỨNG HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH CỦA EPITOPE

KHÁNG NGUYÊN HA VIRUS CÚM A/H5N1

ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI TẾ BÀO B

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA VIRUS CÚM H5N1 3

1.1.1 Đặc điểm và cấu tạo virus cúm A/H5N1 3

1.1.2 Chu trình nhân bản 4

1.1.3 Cơ chế tiến hóa 5

1.2 CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG NGỪA VIRUS CÚM A/H5N1 6

1.2.1 Vaccine truyền thống 6

1.2.2 Vaccine thế hệ mới 6

1.2.3 Nghiên cứu, phát triển vaccine epitope tái tổ hợp trên thế giới 8

1.2.4 Tình hình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam 9

1.3 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG PROTEIN HEMAGGLUTININ (HA) 10

1.3.1 Cấu trúc 10

1.3.2 Chức năng 10

1.4 TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ 11

1.4.1 Tế bào lympho B 11

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 12

1.5 EPITOPE VÀ TÍNH CHẤT CỦA CÁC EPITOPE ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI TẾ BÀO B 13

1.5.1 Epitope 13

1.5.2 Tính chất của các epitope được nhận diện bởi tế bào B 13

1.6 DỰ ĐOÁN EPITOPE TRÊN CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG CÁC CÔNG CỤ TIN – SINH HỌC 14

1.7 TÁ DƯỢC VACCINE 16

1.7.1 Sơ lược về tá dược 16

1.7.2 Flagellin và triển vọng sử dụng làm tá dược 17

1.7.3 Freund’s adjuvant 18

1.8 HỆ THỐNG DUNG HỢP VỚI PROTEIN GLUTATHIONE S- TRANSFERASE 18

1.9 NGUYÊN TẮC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 19

1.9.1 Biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào E coli 19

1.9.2 Vector biểu hiện trong E coli 20

1.9.3 Phương pháp tinh chế sắc ký ái lực 21

1.9.4 Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên động vật để thu nhận kháng thể đa dòng…… 22

1.9.5 Phương pháp ELISA để kiểm chứng tính kháng nguyên của epitope HA tái tổ hợp 23

PHẦN 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 26

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 26

2.1.2 Vật liệu sinh học 26

2.1.3 Hóa chất – Môi trường 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP 33

2.2.1 Qui trình tạo dòng tế bào E coli DH5α/pVFT-fljB-hab có khả năng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 33

2.2.2 Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR và xử lý bằng enzyme EcoRI - SalI 34

2.2.3 Thu nhận và cắt mở vòng plasmid pVFT-hab chứa gen mã hóa epitope HAeB 36

2.2.4 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp PVFT-fljB-hab 37

2.2.5 Tạo dòng tế bào E coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab biểu hiện epitope dung hợp GST-H:1,2-HAeB 40

2.2.6 Cảm ứng, biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 41

2.2.7 Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện epitope tái tổ hợp

GST-H:1,2:HAeB trong chủng E coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 44

2.2.8 Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 46

2.2.9 Gây đáp ứng miễn dịch chuột với epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 48

2.2.10 Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB bằng phương pháp ELISA gián tiếp 49

2.2.11 Kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB và protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB 51

2.2.12 So sánh khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB với vaccine thương mại 52

PHẦN 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 TẠO DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP pVFT-fljB-hab 53

3.1.1 Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR 53

3.1.2 Thu nhận plasmid pVFT-hab/EcoRI, SalI 53

3.1.3 Tạo dòng E coli DH5α mang vector pVFT-fljB-hab 54

3.1.4 Sàng lọc và kiểm tra các dòng tế bào E coli DH5α/pVFT-fljB-hab 55

3.1.5 Giải trình tự đoạn gen fljB-hab đã tạo dòng 57

3.2 TẠO DÒNG E COLI BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab CÓ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB 57

3.2.1 Biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E coli BL21(DE3) 57

3.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pVFT-fljB-hab từ dòng tế bào E coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 58

3.2.3 Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 59

3.3 TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2- HAeB 61

3.3.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG 61

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp63 3.3.3 Ảnh hưởng của ôxi hòa tan lên sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp 64

3.3.4 Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong E coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab ở các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa 66

3.4 THU NHẬN VÀ TINH CHẾ EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB 66 3.4.1 Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2:HAeB 67 3.4.2 Xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp sau khi tinh chế 67 3.5 KIỂM CHỨNG HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU CỦA EPITOPE TÁI

TỔ HỢP 68 3.5.1 Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB tổng hợp hóa học 68 3.5.2 Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-

HAeB 69 3.5.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh đối với virus H5N1 72 3.6 SO SÁNH KHẢ NĂNG GẮN VIRUS H5N1 BẤT HOẠT CỦA KHÁNG HUYẾT THANH CHUỘT TIÊM EPITOPE HAeB, EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2- HAeB VÀ VACCINE THƯƠNG MẠI 74

PHẦN 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

1 KẾT LUẬN 77

2 ĐỀ NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

ANN artificial neural network

BSA bovine serum albumin

CEP conformational epitope prediction

CFA complete Freund adjuvant

DNA deoxyribose nucleic acid

dH2O distilled water (nước cất)

dNTP deoxynucleotide triphosphate

ĐHKHTN Đại học Khoa học Tự nhiên

ĐHQG-HCM Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

E coli Escherichia coli

EDTA ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

GST gluthathione-S-tranferase

HA hemagglutinin (heamagglutinin)

hab gen mã hóa cho epitope HAeB

HAeB epitope hemagglutinin H5N1 được nhận diện bởi tế bào B His polyhistidine

IFA incomplete Freund adjuvant

IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside

Kan r kanamycin resistance (kháng kanamycin)

LB môi trường Luria-Bertani

MBP protein gắn maltose

MCS multiple cloning site

MDP muramyl dipeptide

MHC major histocompatibility complex

NFDM non fat dry milk

OPD o-phenylene diamine

PBS phosphate buffered saline

PBST phosphate buffered saline tween

PCR polymerase chain reaction

PMSF phenyl methyl sulphonyl fluoride

PTN.CNSHPT Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử

RNA ribose nucleic acid

RNase ribonuclease (enzyme thuỷ giải RNA)

SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl-ethane-1,2-diamine

TLR Toll-like receptor

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A 3

Bảng 1.2 Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng phòng ngừa virus 8

Bảng 1.3 Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học bởi đề tài KC.04.18/06-10 15

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn 28

Bảng 2.2 Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 42

Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab 53

Bảng 3.2 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác nhau 61

Bảng 3.3 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB theo các nồng độ IPTG cảm ứng 62

Bảng 3.4 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau 63

Bảng 3.5 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 63

Bảng 3.6 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau 65

Bảng 3.7 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau 65

Bảng 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp thu quang phổ 68

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm 5

Hình 1.2 Qui trình thực hiện phương pháp Reverse Vaccinology 9

Hình 1.3 Cấu trúc vùng MCS của hệ thống biểu hiện pVFT 2S 21

Hình 2.1 Plasmid pVFT-hab 27

Hình 2.2 Các thang chuẩn DNA 29

Hình 2.3 Thang chuẩn protein 29

Hình 2.4 Quy trình tạo dòng E coli DH5α/pVFT-fljB-hab 34

Hình 3.1 Kết quả thu nhận gen bằng phản ứng PCR 53

Hình 3.2 Kết quả thu nhận pVFT-hab và plasmid pVFT-hab/EcoRI, SalI 54

Hình 3.3 Kết quả biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E coli DH5α 55

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng tế bào E coli DH5α/pVFT-fljB-hab 56

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid kiểm tra các dòng E coli DH5α/pVFT-fljB-hab 57

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự đoạn gen fljB- hab trong plasmid pVFT-fljB-hab 57

Hình 3.7 Kết quả biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E coli BL21(DE3) 58

Hình 3.8 Kết quả PCR kiểm tra plasmid các dòng tái tổ hợp E coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 59

Hình 3.9 Kết quả biểu hiện của protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB bằng SDS-PAGE (a), lai Western Blot với kháng thể anti-GST (b) và định lượng Quantity One (c) 60

Hình 3.10 Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau 62

Hình 3.11 Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau 64

Hình 3.12 Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau 65

Hình 3.13 Kết quả điện di SDS-PAGE (a), lai Western Blot với kháng thể anti-GST

(b) và định lượng Quantity One (c) của chủng E coli fljB-hab được nuôi cấy lắc đã kết hợp các điều kiện tối ưu 66

BL21(DE3)/pVFT-Hình 3.14 Phân tích kết quả tinh chế bằng SDS-PAGE(a) và lai Western Blot(b) 67 Hình 3.15 Kết quả xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp đã tinh chế bằng

SDS-PAGE 68

Hình 3.16 Kết quả ELISA của kháng huyết thanh kháng kháng nguyên epitope

HAeB với kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB 69

Hình 3.17 Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được tiêm kháng

nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB 70

Hình 3.18 Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được nhỏ mũi kháng

nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H;1,2-HAeB 71

Hình 3.19 Kết quả ELISA so sánh khả năng nhận diện kháng nguyên

GST-H:1,2-HAeB của các kháng huyết thanh khác nhau 71

Hình 3.20 Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của

kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB 72

Hình 3.21 Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của

kháng huyết thanh chuột tiêm protein dung hợp GST-H;1,2-HAeB 73

Hình 3.22 Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của

kháng huyết thanh chuột nhỏ mũi protein dung hợp GST-H;1,2-HAeB 73

Hình 3.23 Kết quả ELISA so sánh khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của các

kháng huyết thanh khác nhau 74

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vaccine phòng ngừa một số phân type cúm hiện nay tuy có hiệu quả tốt nhưng lại

bị giới hạn về chủng Do đó, nhiều phương pháp mới được nghiên cứu nhằm cải thiện các hạn chế của vaccine hiện có và chủ yếu tập trung vào hai hướng sau: i) Tạo vaccine

đa giá phòng được nhiều chủng virus; ii) Con đường tạo sự miễn dịch Trong đó, phương pháp nghiên cứu tạo vaccine dựa trên các epitope bảo tồn ở các chủng virus thuộc các phân type khác nhau của virus cúm A hiện đang được quan tâm rộng rãi Ưu điểm của loại vaccine này là khả năng gây đáp ứng miễn dịch chỉ với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu Vì vậy, nếu có đầy đủ các epitope cần thiết, vaccine sẽ kích thích phản ứng miễn dịch chuyên biệt mà không gây ra những ảnh hưởng không mong muốn

Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, nhóm nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Trường ĐHKHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm đến hướng nghiên cứu nêu trên Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vaccine và thuốc”, mã

số KC.04.18/06-10 Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế bào T, tế bào B từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope dự đoán Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài chưa đánh giá được hết tất cả các epitope đã được dự đoán từ kết quả của đề tài Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành tổng hợp bằng kỹ thuật gen một epitope liên tục nhận diện bởi tế bào

B đã được dự đoán từ kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 và tiến hành đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nhận diện kháng nguyên của epitope này

Để tổng hợp epitope bằng kỹ thuật gen, epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B (HAeB)

được thiết kế để tổng hợp thành protein tái tổ hợp trong tế bào chủ E coli ở dạng dung

hợp với GST (Glutathione S-transferase) và kháng nguyên roi (flagellin) H:1,2 của

Salmonella Typhimurium Do vector được sử dụng để biểu hiện protein trong E coli

được chọn thuộc hệ thống pVFT, được thiết kế để biểu hiện protein ngoại lai ở dạng dung hợp với GST, nên epitope tái tổ hợp cũng được tổng hợp ở dạng dung hợp với

GST Ngoài ra, do flagellin H:1,2 của S Typhimurium đã được chứng minh có hoạt tính

kích thích đáp ứng miễn dịch ở vật chủ, nên chúng tôi thiết kế epitope dung hợp với H:1,2 với mục đích tăng cường khả năng gây đáp ứng miễn dịch của epitope tổng hợp Epitope tái tổ hợp được tổng hợp bằng kỹ thuật gen sẽ dung hợp với GST và H:1,2 ở đầu N (GST-H:1,2-HAeB)

Nội dung thực nghiệm của luận văn gồm:

- Tạo dòng tế bào E coli biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB

- Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng tổng hợp epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB

- Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB

- Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch đặc hiệu của epitope tái tổ hợp HAeB với kháng nguyên HA của virus A/H5N1

GST-H:1,2-PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1 CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA VIRUS CÚM H5N1

1.1.1 Đặc điểm và cấu tạo virus cúm A H5N1 [5], [23]

H5N1 là một phân type của chi Influenza A virus, một chi thuộc nhóm IV, họ Orthomyxoviridae Họ này có các đặc tính như sau: bộ gen ssRNA mạch âm, vỏ bọc với nhiều hình dạng, bộ gen có từ 6 – 8 mạch với kích thước 10 – 15kb, gây bệnh ở các loài động vật có xương sống

Virion có dạng hình cầu hay đa hình, đường kính 80 – 120nm, chiều dài 200 – 300nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dalton Vỏ virus được tạo thành từ màng lipid của tế bào ký chủ, bề mặt được cấu thành bởi các protein hay glycoprotein của virus, chủ yếu là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Phần ngoài màng của các glycoprotein có chiều dài 10 -14nm và đường kính 4 – 6nm Các nucleocapside chứa các đoạn gen có cấu tạo xoắn ốc với chiều dài khác nhau, từ 50 – 130nm Các nucleocapside

có dạng thẳng và xoắn ở cuối Mặt trong của lớp vỏ được bao phủ bằng protein nền (protein M), gồm 2 loại là: M1 và M2 Bên trong là bộ gen virus cúm A, gồm 8 sợi âm RNA mạch đơn, riêng biệt, mã hóa cho 11 loại protein Các protein của virus cúm A và

chức năng của chúng được tổng hợp trên Bảng 1.1 Hai đầu của sợi RNA có gắn thêm

chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lý hay hóa học; các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 – 7,9

Bảng 1.1 Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A

4 HA 76 Gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ, dung

hợp màng virus với màng tế bào chủ để đưa nucleocapsid vào, dễ bị biến đổi hình thành nên chủng mới

5 NP 56,1 Là protein cấu trúc bao quanh các phân đoạn RNA

6 NA 32 Loại bỏ sialic acid ra khỏi glycoprotein, giúp virus

vượt qua lớp nhầy của ống hô hấp, tham gia vào việc lây truyền của virus

7 M1 và

M2

M1: 27,8 M2: 11

M1: thành phần cấu trúc chính, tham gia quá trình lắp ráp và nảy chồi

M2: là các kênh ion

NS2

NS1: 26,8 NS2: 14,2

NS1: ức chế vận chuyển mRNA NS2: đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân

1.1.2 Chu trình nhân bản [19], [31]

Chu trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm A trải qua 3 bước:

- Bước 1: Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ

Các virus cúm bám vào tế bào bằng cách gắn các protein bề mặt hemaglutinin với các phân tử đường của sialic acid trên bề mặt của tế bào biểu mô (ở mũi, cổ họng và phổi của động vật có vú và ruột của chim) Sự hình thành liên kết giữa sialic acid và đường galactose mang tính đặc trưng loài, quyết định giới hạn truyền bệnh của virus cúm Virus vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào, hình thành các endosome Nồng độ pH bên trong endosome thấp kết hợp với các protease đã làm thay đổi cấu hình của HA, để lộ ra phần

kỵ nước giúp đính trên màng lipid của endosome, dẫn đến sự dung hợp màng Đồng thời, các proton H+ đi vào bên trong virus thông qua kênh ion M2, phá vỡ mối tương tác giữa protein M1 với các ribonucleoprotein (RNP) và giải phóng chúng vào tế bào chất

- Bước 2: Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA

Sau khi vào trong bào tương tế bào, virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào chủ

để sinh tổng hợp protein và RNA của chúng Quá trình sao chép thông tin di truyền RNA này được thực hiện trong nhân tế bào chủ Các RNA của virus được đưa vào nhân nhờ protein NP Tại đây, xảy ra quá trình sao chép thành hai loại RNA: sợi dương mRNA và cRNA từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus

- Bước 3: Đóng gói và nảy chồi

Các protein HA, NA và M2 được biến đổi sau dịch mã tại thể Golgi và được đưa lên màng Protein N như một tín hiệu điều chỉnh giữa hai quá trình biểu hiện gen virus

và quá trình lắp ráp RNP mới, nếu protein này nhiều thì quá trình biểu hiện giảm xuống, quá trình lắp ráp sẽ tăng lên

Các protein M1 liên kết nhau tạo thành lớp vỏ phía dưới màng bao của virus Tại màng, các RNP cùng với các glycoprotein HA, NA, M2 và vùng nảy chồi tạo thành các chồi virus hoàn chỉnh gắn chặt vào màng tế bào chủ nhờ liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Protein NA còn giúp phân cắt các thụ thể sialic acid trên màng, giải phóng virus và có thể nhiễm vào các tế bào khác để tiếp tục chu kỳ xâm nhiễm mới

Hình 1.1 Quá trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm

1.1.3 Cơ chế tiến hóa [33], [26]

Các chủng virus cúm gia cầm mới xuất hiện là kết quả của sự tiến hóa dẫn đến sự thay đổi các kháng nguyên bề mặt của chúng, giúp virus tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ Có hai phương thức tiến hóa chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A

- Cơ chế làm lệch kháng nguyên:

Kháng nguyên bị biến đổi do các đột biến điểm trên RNA virus Do RNA replicase của virus không có cơ chế sửa sai và độ chính xác rất thấp nên khi nhân bản RNA sẽ tạo ra nhiều đột biến sai lệch nucleotide Tần suất đột biến điểm rất cao, khoảng 1/10.000 Như vậy, gần như mỗi virus mới sinh ra đều chứa một đột biến điểm trong hệ gen của nó Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ, làm xuất hiện một phân type mới có đặc tính kháng nguyên mới Hiện tượng này thường xảy ra ở các đoạn gen

mã hóa kháng nguyên NA và HA

- Cơ chế tái tổ hợp kháng nguyên:

Sự tái sắp xếp bộ gen từ nhiều chủng khác nhau cũng có khả năng tạo thành chủng virus mới nhanh chóng do sự tổ hợp các đoạn RNA từ các chủng khác nhau Điều này còn giúp cho virus có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực

Do bộ gen virus gồm 8 đoạn RNA khác nhau, việc tái tổ hợp giữa đoạn gen của các chủng virus khác nhau khi xâm nhiễm cùng một ký chủ rất dễ dàng xảy ra Đây là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm H5N1 hiện nay

1.2 CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG NGỪA VIRUS CÚM A/H5N1

Hiện nay, vaccine phòng bệnh virus cúm H5N1 đang rất được quan tâm nghiên cứu trên thế giới Đây được xem là biện pháp y học chính để bảo vệ con người khỏi đại dịch cúm

Vaccine nhược độc là dạng virus được làm yếu đi do tạo sự thích nghi với điều kiện lạnh (cold adapted influenza vaccine) Ưu điểm của loại vaccine này là kích thích

hệ miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào và tạo đáp ứng miễn dịch lâu dài

1.2.2 Vaccine thế hệ mới [12], [25]

Các loại vaccine truyền thống tuy có tính bảo vệ cao nhưng độ an toàn không cao,

vì vậy nhiều thử nghiệm đang được tiến hành nhằm tạo ra vaccine cúm mới vừa có hiệu quả bảo vệ tốt, vừa an toàn cho người Hai trong số các phương pháp phát triển vaccine mới có triển vọng cao là vaccine virus tái tổ hợp và vaccine epitope tái tổ hợp

- Vaccine virus tái tổ hợp

Hướng nghiên cứu đang được phát triển hiện nay là phương pháp di truyền ngược (reverse genetics), sử dụng vector là plasmid chứa gen và vùng promoter của virus cúm Vector tái tổ hợp được chuyển vào trong tế bào, tạo ra các đoạn RNA bộ gen của virus, tạo protein của virus và hình thành các phần tử virus mới Phương pháp này tạo ra một chủng virus mới không có độc lực để làm vaccine một cách nhanh chóng Ví dụ, người

ta có thể tạo ra một chủng virus tái tổ hợp chứa 6 đoạn RNA từ chủng virus yếu và đoạn RNA mã hóa HA và NA từ chủng virus đang lưu hành

- Vaccine epitope tái tổ hợp

Một phương pháp khác cũng đang được quan tâm nghiên cứu hiện nay là dựa trên các epitope được bảo tồn ở các chủng virus thuộc các type khác nhau của virus cúm A để phát triển vaccine phòng H5N1 và có thể phòng các phân type virus khác nhau Nhiều loại vaccine cúm hiện nay ở người và động vật đều có nhiều tác dụng phụ, phổ kháng hẹp, nên vaccine cần phải được sản xuất mới hàng năm Để tránh việc phải nghiên cứu thay đổi vaccine hàng năm, các nhà khoa học mong muốn tạo ra một loại vaccine có phổ kháng rộng, có khả năng kháng lại tất cả các phân type virus gây bệnh trên người và gia cầm Ưu điểm chính của vaccine dựa trên epitope là khả năng gây đáp ứng miễn dịch với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu, do vậy có thể tránh được những ảnh hưởng không mong muốn Tuy vậy, vaccine dựa trên epitope có thể có khả năng gây đáp ứng miễn dịch thấp hơn so với vaccine toàn phần Vì vậy, khi phát triển vaccine dựa trên epitope nên có sự hiện diện của cả epitope tế bào B và epitope tế bào T Các epitope phải chuyên biệt cho tác nhân gây bệnh Các epitope đang được tập trung nghiên cứu hiện nay là các epitope trên hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus cúm Đồng thời, các nhà khoa học còn nghiên cứu các tá dược và các chất mang kết hợp với các epitope bảo tồn nhằm làm tăng hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch

1.2.3 Nghiên cứu phát triển vaccine epitope tái tổ hợp trên thế giới [17], [27]

Hiện nay đã có một loại vaccine nhỏ mũi dựa trên epitope đã được cấp patent (patent số 7192595, 20/03/2007) có khả năng phòng ngừa một số chủng virus cúm Các epitope được lựa chọn bao gồm ít nhất bốn epitope virus cúm ở người gồm một epitope (HA) tế bào B; một epitope (HA hay NP) tế bào T trợ giúp có khả năng gắn với nhiều phân tử HLA và ít nhất hai epitope (NP hay M) tế bào CTL Cụ thể là các epitope HA91-

108 (epitope tế bào B: SKAFSNCYPYDVPDYASL), HA307-319, NP335-350 và NP380-393 Các epitope trên khi được dung hợp với tiên mao flagella của vi khuẩn

Salmonella đã cho đáp ứng miễn dịch và hiệu quả bảo vệ tốt đối với một số chủng cúm

Bảng 1.2 Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng phòng

NP380-393 ELRSRYWAIRTR

SG

B8, B27 H1N1, H1N2, H2N2, H5N1,

H5N2, H6N1, H6N2, H6N9, H7N7, H9N2, H11N1, H14N5 HA307-

319

PKYVKQNTLKL

AT

DR1, DR2, DR4, DR5, DR7, DR9, DR52A…

H1N1, H3N1, H3N2, H3N8

Nguồn dữ liệu bộ gene được giải mã ngày càng tăng cùng với sự phát triển của các công cụ Tin Sinh học đã mở ra một phương pháp mới để hỗ trợ nghiên cứu phát triển vaccine là phương pháp Vaccine học ngược (Reverse Vaccinology - RV) Khác với phương pháp nghiên cứu vaccine truyền thống, xuất phát điểm của RV là việc phân tích toàn bộ bộ gene của tác nhân gây bệnh để xác định tất cả kháng nguyên có khả năng là

vaccine dự tuyển (Hình 1.2) Đây là một bước nhằm tìm ra tất cả các protein kháng

nguyên tiềm năng chưa được quan tâm đến tính miễn dịch in vitro Phương pháp RV đã

được ứng dụng thành công trên nhiều trường hợp ở cả vi khuẩn và virus

Các protein kháng nguyên tiềm năng là đầu vào để dự đoán các epitope tế bào T

và tế bào B có thể có cho tác nhân gây bệnh Có nhiều thuật toán, phương pháp đã được phát triển để dự đoán epitope tế bào T và epitope tế bào B nhưng có thể được chia thành

hai nhóm chính là dự đoán dựa trên phân tích trình tự (phương pháp dùng các dữ liệu đầu vào là các trình tự acid amin) và dự đoán dựa trên phân tích cấu trúc (sử dụng thông tin về cấu trúc không gian ba chiều)

Hình 1.2 Qui trình thực hiện phương pháp Reverse Vaccinology

1.2.4 Tình hình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam [4], [13]

Ở nước ta, các nhà sản xuất trong nước hiện đang ở giai đoạn nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người ở qui mô phòng thí nghiệm với các phương pháp khác nhau

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ giữa năm 2004 đã phát triển kỹ thuật sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát Vaccine này sử dụng một chủng tái tổ hợp từ chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với một chủng tái tổ hợp từ chủng virus do Đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp Hiện nay, Viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 (nguồn gốc từ chủng A/Vietnam 1194/2004 và PR8 do Viện NIBSC – Vương quốc Anh cung cấp) Vaccine do Viện sản xuất đã được nghiệm thu dưới dạng đề tài cấp Nhà nước vào đầu năm 2007, đang nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng

- Viện Pasteur TP HCM nghiên cứu phát triển dạng vaccine nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14

- Viện Vaccine và Sinh phẩm y tế phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu sản xuất vaccine nuôi cấy trên trứng gà

có phôi, sử dụng chủng NIBRG-14

- Việc nhiều đơn vị trong nước nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 làm tăng khả năng nước ta có thể chủ động nguồn vaccine cúm cho người khi đại dịch xảy ra Đặc biệt việc sử dụng các chủng sản xuất có nguồn gốc từ các chủng virus phân lập tại Việt Nam làm cho vaccine có hiệu lực bảo vệ tốt nhờ tính tương đồng kháng nguyên

1.3 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG PROTEIN HEMAGGLUTININ (HA)

1.3.1 Cấu trúc [8]

HA là kháng nguyên bề mặt rất quan trọng của virus cúm A Ngày nay, các hiểu biết chính về HA chủ yếu dựa trên các nghiên cứu trên cúm gia cầm type A Đây là một trimer gồm 3 đơn phân HA0 kết hợp với nhau tạo thành dạng siêu xoắn, có khối lượng phân tử khoảng 220kDa Mỗi monomer là hạng HA0 chưa được cắt, sau đó được cắt bằng protease thành hai tiểu đơn vị là HA1 và HA2 Hai tiểu đơn vị này nối với nhau bằng cầu nối disulfide Dạng HA tồn tại trên bề mặt virus là dạng đã được cắt Khi được

xử lý với bromelain, HA sẽ bị cắt tại vùng sát màng và giải phóng vùng ectodomain của

HA, được gọi là cấu trúc BHA Vùng đáy của khối trụ này chứa các đoạn polypeptide từ các cấu phần HA1 và HA2, thành phần chính của nó là một tâm của các vùng xoắn α trên HA2 và tạo nên xương sống của protein Một vùng kỵ nước ở đầu N của mỗi đơn phân HA2 cũng rất quan trọng trong sự dung hợp màng và thường được đề cập đến với tên gọi vùng peptide dung hợp Phần xa màng nhất của cấu trúc BHA là một khối cầu lớn tạo nên chủ yếu từ HA1 Vùng này có cấu trúc cơ bản là các phiến β đối song 8 đoạn Khu vực này chứa vị trí gắn thụ thể và các vị trí nhận biết quan trọng của kháng thể trung hòa

1.3.2 Chức năng [9], [22]

- Dung hợp màng

Sau khi vào tế bào chủ, virus cúm A sẽ dung hợp màng virus với màng hạt nội bào, phóng thích các nucleocapsid vào tế bào chất HA0 được cắt thành hai tiểu phần HA1 và HA2 Môi trường acid bên trong hạt nội bào giúp HA thay đổi cấu hình, khởi

đầu sự dung hợp màng Cơ chế cụ thể của sự dung hợp hai lớp màng này vẫn chưa được làm sáng tỏ Một giả thuyết cho rằng có sự tham gia của nhiều phân tử HA cùng lúc Các

HA tụ lại với nhau sau đó ống xoắn duỗi ra và đẩy peptide dung hợp lên tương tác với màng tế bào Sự tái gấp cuộn vùng gần màng của chuỗi xoắn α dài của HA2 kéo hai màng lại gần nhau Khi tiếp xúc nhau, chúng nhập vào nhau và hình thành trạng thái bán dung hợp Trạng thái này mở rộng dần do tác dụng của HA và đến mức nào đó đủ sức căng để phá vỡ cấu trúc, tạo một lỗ trên màng dung hợp Từ đó, vật chất bên trong được giải phóng ra bên ngoài

- Gắn thụ thể

Hiện nay, kiến thức về cơ chế này đã sâu hơn rất nhiều Một cấu trúc nhỏ dạng túi

ở vùng đầu hình cầu của HA là vị trí gắn với thụ thể Các amino acid ở vùng này có tính bảo tồn rất cao so với các vùng xung quanh, đồng thời trình tự này sẽ qui định loại nối của thụ thể mà HA có thể gắn vào Hai vị trí quan trọng nhất qui định sự gắn vào thụ thể

là vị trí 226 và 228 trên HA1 Các chủng nhận biết thụ thể α(2,3) thường có glutamine ở

vị trí 226 và glycine ở vị trí 228 và các chủng nhận biết thụ thể α(2,6) có leucine và serine ở hai vị trí này

1.4 TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ [1]

1.4.1 Tế bào lympho B

Tế bào lympho B (tế bào B) là tế bào sản xuất kháng thể nhận diện và gắn lên kháng nguyên giúp hệ miễn dịch phá hủy kháng nguyên Tế bào này trưởng thành trong tủy xương, sau đó đi vào hệ tuần hoàn và tập trung ở các cơ quan lympho ngoại biên Chức năng của tế bào B là nhận diện kháng nguyên và tạo ra đáp ứng miễn dịch dịch thể

Tế bào nào không tiếp xúc với kháng nguyên thì sẽ chết theo phương thức apotosis Các globulin trên bề mặt tế bào B đóng vai trò là các thụ thể của kháng nguyên Có khoảng 1,5 x 105 phân tử thụ thể kháng nguyên trên bề mặt của một tế bào B

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Miễn dịch dịch thể do các kháng thể thực hiện là một trong hai nhánh của đáp ứng miễn dịch thích ứng có chức năng trung hoà, loại bỏ các vi sinh vật ngoại bào và độc tố của vi sinh vật Quá trình đáp ứng này có thể xảy ra ở bất cứ mô nào, thường xảy ra trong tỳ hoặc ở hạch bạch huyết Kháng nguyên sẽ gây đáp ứng miễn dịch dịch thể trong

đó kháng thể được tế bào B sản xuất để chống lại kháng nguyên Kháng nguyên gắn vào các thụ thể trên tế bào B và liên kết chéo với các thụ thể liền kề (các tế bào T có vai trò phối hợp trong quá trình này), qua đó hoạt hóa tế bào B Sự gắn của kháng nguyên xảy

ra khá nhanh, sau đó là quá trình nhập bào Hiện tượng hoạt hóa này gây ra sự chọn lọc dòng, kích thích tế bào B sinh trưởng và sinh sản để tạo thành một dòng tế bào hoàn toàn giống nó, có các thụ thể bề mặt của cùng một kháng nguyên đặc hiệu Hầu hết các tế bào này trở thành các tương bào, là tế bào tiết kháng thể trong đáp ứng miễn dịch dịch thể

Tế bào B bình thường tiết một lượng kháng thể rất giới hạn Ngược lại, các tương bào đã phát triển bộ máy có thể tiết các kháng thể với tốc độ khoảng 2.000 phân tử/giây Mỗi tương bào hoạt động trong 4 – 5 ngày rồi chết Kháng thể được tiết vào máu hoặc bạch huyết, gắn vào các kháng nguyên tự do để đánh dấu và huy động các cơ chế không đặc hiệu hoặc đặc hiệu của hệ thống miễn dịch nhận biết và phá hủy kháng nguyên Các tế bào của dòng không biệt hóa thành tương bào sẽ trở thành các tế bào nhớ, có khả năng tồn tại lâu dài, có vai trò giúp cơ thể có đáp ứng miễn dịch dịch thể nhanh chóng, hầu như tức thì khi tiếp xúc lại cùng một kháng nguyên

Đáp ứng miễn dịch dịch thể nguyên phát xảy ra khi hệ thống miễn dịch tiếp xúc lần đầu tiên với một kháng nguyên đặc biệt Đáp ứng này hình thành chậm khoảng 3 -6 ngày sau khi hệ thống bị nhiễm kháng nguyên Thời gian này cần thiết để một số ít tế bào B đặc hiệu đối với kháng nguyên được chọn lọc dòng, sinh sản và biệt hóa thành tương bào Sau thời kỳ này, lượng kháng thể trong huyết tương tăng lên, đạt đến đỉnh trong khoảng 10 ngày, rồi bắt đầu giảm xuống

Đáp ứng miễn dịch thứ phát xảy ra khi một người nào đó bị nhiễm lại bởi cùng một kháng nguyên Đáp ứng lúc này xảy ra nhanh hơn, kéo dài hơn và hiệu quả hơn vì

hệ miễn dịch đã sẵn sàng, các tế bào nhớ được kích thích và sản xuất tương bào nhanh hơn Các kháng thể được sản xuất lần này gắn chặt hơn, lượng kháng thể trong máu giữ

ở mức cao trong hàng tuần cho tới hàng tháng Ngay cả khi không có kháng nguyên, các

tế bào nhớ vẫn tồn tại trong thời gian dài và nhiều tế bào nhớ vẫn còn khả năng gây các đáp ứng miễn dịch dịch thể thứ phát trong cả cuộc đời

1.5 EPITOPE VÀ TÍNH CHẤT CỦA CÁC EPITOPE ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI

TẾ BÀO B [20]

1.5.1 Epitope

Các tế bào miễn dịch không nhận diện toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ nhận diện những vùng nhất định trên phân tử kháng nguyên, gọi là epitope Đây là những vùng có hoạt tính miễn dịch của một kháng nguyên, được nhận diện và gắn đặc hiệu bởi thụ thể tương ứng của nó trên bề mặt tế bào lympho hoặc bởi kháng thể do tế bào lympho tiết ra Sự tương tác này có thể xảy ra ở các mức độ cấu trúc khác nhau của kháng nguyên Có hai loại epitope: epitope liên tục (epitope bậc 1) và epitope không liên tục (epitope lập thể) Epitope liên tục được hình thành bởi chuỗi các acid amin kế tiếp nhau trên phân tử kháng nguyên Epitope không liên tục được hình thành bởi các acid amin nằm cách xa nhau trên phân tử kháng nguyên Epitope không liên tục chỉ hiện diện

ở phân tử kháng nguyên có cấu hình gấp cuộn tự nhiên và bị mất đi khi kháng nguyên bị biến tính hoặc bị phân hủy

1.5.2 Tính chất của các epitope được nhận diện bởi tế bào B

Kích thước của epitope được nhận diện bởi tế bào B được quyết định bởi kích thước, hình dạng và thứ tự acid amin của vị trí kết hợp (paratope) trên kháng thể Trong trường hợp kháng nguyên là một protein hình cầu thì epitope có thể lớn hơn

Các tế bào B nhận diện được kháng nguyên khi kháng nguyên gắn vào các thụ thể kháng nguyên trên bề mặt tế bào Vì vậy các epitope được tế bào B nhận diện thường có

vị trí dễ tiếp cận trên bề mặt của phân tử kháng nguyên Các epitope này thường gồm các

acid amin ưa nước và hiện diện tại các vị trí gấp cuộn trong chuỗi acid amin Các đoạn acid amin nằm bên trong phân tử protein kháng nguyên thì không thể là epitope nhận diện bởi tế bào B Nhìn chung các vùng có khuynh hướng lộ trên bề mặt của protein thường là những epitope vì các gốc acid amin này có thể tiếp cận được và ưa nước Bề mặt tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể có một số chỗ lồi lõm để bổ sung cho nhau Sự tiếp xúc này được tạo ra giữa 15 – 22 acid amin và có khoảng 75 – 120 cầu nối hydro, nhiều liên kết ion và tương tác kỵ nước tham gia

1.6 DỰ ĐOÁN EPITOPE TRÊN CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG CÁC CÔNG CỤ TIN SINH HỌC [2]

Năm 2008 – 2010, PTN CNSHPT Trường ĐHKHTN thuộc ĐHQG TP.HCM đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vaccine và thuốc”,

mã số KC.04.18/06-10 Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là tạo và ứng dụng các chương trình Tin Sinh học trong dự đoán epitope phục vụ việc nghiên cứu phát triển vaccine thế hệ mới đối với virus H5N1 và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope

dự đoán

Đối với epitope nhận diện bởi tế bào T, việc dự đoán epitope dựa trên trình tự bằng cách sử dụng một số phương pháp đã có như mạng nơron nhân tạo (artificial neural network), mô hình Markov ẩn (hiden Markov model), support vector machine Ngoài ra, việc xây dựng một hệ thống tự động dự đoán epitope dựa trên trình tự bằng cách tích hợp các phương pháp dự đoán, cho phép lựa chọn nhiều tham số bao gồm cách chia dữ liệu luyện mô hình dự đoán, các tham số ngưỡng ; có thể tự động tìm mô hình dự đoán tối

ưu khi muốn thay đổi hay cập nhật dữ liệu epitope thực nghiệm hay thay đổi nhóm MHC (major histocompatibility complex) Hệ thống này được thiết kế nhằm tạo ra tính linh động cao trong việc dự đoán những epitope của H5N1 Sau khi dự đoán được trình tự epitope tế bào T gắn MHC, tiến hành mô phỏng trên máy tính sự gắn của phân tử peptide với cấu trúc MHC tương ứng để kiểm tra ái lực gắn

Đối với việc dự đoán epitope tế bào B, nhóm nghiên cứu dựa trên cấu trúc của kháng nguyên và phân tử MHC, áp dụng phương pháp của DiscoTope và CEP (conformational epitope prediction) là hai phương pháp hiện đại cho độ chính xác cao nhất Kết quả dự đoán epitope bảo tồn gắn MHC lớp I và MHC lớp II trên H5N1 được

Chú thích: (*) các epitope đã được tổng hợp di truyền và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch trên động vật thí nghiệm

Trong số các epitope đã được dự đoán, một số epitope đã được tổng hợp và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch Một số epitope khác đang được tiếp tục tổng hợp và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch Mặt khác, các epitope của tế bào B của kháng nguyên HA và

NA đã được kiểm chứng hoạt tính miễn dịch trong đề tài KC.04.18/06 – 10 cho kết quả đáp ứng miễn dịch thấp đang được kiểm tra đánh giá lại bằng cách bổ sung các giải pháp làm tăng đáp ứng miễn dịch như: (i) Tạo nhiều bản sao của epitope tế bào B trên cùng một phân tử kháng nguyên sẽ cải thiện hiệu quả đáp ứng miễn dịch; (ii) Dung hợp epitope với một protein mang (carrier) có chức năng hoạt hóa các tế bào trình diện kháng nguyên hay làm gia tăng sự tiết các bổ thể như INF, IL2, IL4, .để làm tăng hiệu quả miễn dịch của epitope

Trong quá trình thực hiện đề tài KC.04.18/06-10, epitope tế bào B của kháng

nguyên HA và NA đã được thiết kế tổng hợp di truyền trong E coli bằng chiến lược dung hợp epitope với protein lông roi H:1,2 của vi khuẩn Salmonella Typhimurium Tuy

nhiên, đề tài đã không thu được protein mục tiêu đúng với trình tự peptide dự đoán do bị lệch khung đọc mở giữa trình tự nucleotide mã hóa epitope so với trình tự nucleotide mã hóa cho protein H:1,2 Do vậy, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi tiến hành tổng

hợp epitope [‘N’-FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG-‘C’] từ kháng nguyên

hemagglutinin virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp hóa học và bằng kĩ thuật di truyền

thông qua các hệ thống biểu hiện trong E coli để nghiên cứu tính đáp ứng miễn dịch của

kháng nguyên này cũng như khả năng gắn đặc hiệu với virus H5N1 bất hoạt

1.7 TÁ DƯỢC VACCINE

1.7.1 Sơ lược về tá dược [14]

Tá dược vaccine là những chất được dùng chung với kháng nguyên để gây được đáp ứng miễn dịch mạnh hơn so với khi chỉ dùng kháng nguyên đơn lẻ Năm 1925, khi

sử dụng tá dược cho vaccine nhược độc uốn ván và bạch hầu, Ramon đã công bố rằng việc sử dụng vaccine chung với agar, bột sắn, lecithin, dầu tinh bột, saponin hoặc vụn bánh mì đã làm tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch

Vai trò chung của các tá dược trong công thức vaccine là: làm giảm lượng kháng nguyên sử dụng trong vaccine, loại bỏ sự cạnh tranh kháng nguyên, tăng đáp ứng tế bào

T và lượng kháng thể, tăng phản ứng bảo vệ, kéo dài thời gian đáp ứng bằng cách kích hoạt tế bào B và T nhớ

Hiện nay, có hai thế hệ tá dược đã được nghiên cứu và ứng dụng Thế hệ thứ nhất bao gồm các muối nhôm không tan và tá dược dạng nhũ tương Một vài cấu trúc khác cũng được dùng để làm tá dược như các tiểu phần polymer và liposome do có cấu trúc phù hợp đối với việc hấp thụ kháng nguyên góp phần tăng hiệu quả vận chuyển kháng nguyên cũng như tăng sự ổn định kháng nguyên tại vùng được tiêm

Thế hệ tá dược thứ hai là sự kết hợp tá dược thế hệ thứ nhất và các thành phần tổng hợp có tác dụng hoạt hóa hệ miễn dịch như muramyl dipeptide (MDP) MDP là thành phần nhỏ nhất của vách tế bào vi khuẩn có hoạt tính tá dược Tuy nhiên, bản thân

nó không đủ hiệu quả đối với hệ miễn dịch, do đó chúng thường được kết hợp với thế hệ

tá dược thứ nhất

1.7.2 Flagellin và triển vọng sử dụng làm tá dược [3], [10]

Kháng nguyên flagelllin (H:1,2) của vi khuẩn Salmonella Typhimurium là thành

phần cấu tạo thành lông roi, một cấu trúc giúp vi khuẩn di động và là một protein có vai trò trong độc lực của vi khuẩn này Đây cũng là thành phần giúp hoạt hóa hệ miễn dịch của vật chủ Các nghiên cứu cho thấy flagellin tinh chế hay flagellin tái tổ hợp có thể gây

ra các đáp ứng viêm trên tế bào in vitro hoặc khi được đưa vào với lượng lớn in vivo

Hiệu quả này là do sự hoạt hóa thụ thể TLR-5 (Toll-like receptor 5) hiện diện trên các tế bào trình diện kháng nguyên

Flagellin liên kết với TLR-5, thông qua đó hoạt hóa quá trình sao mã các gen tham gia vào quá trình miễn dịch Ngoài ra, flagellin làm gia tăng đáp ứng TH1 chuyên biệt, dẫn đến việc tăng cường sản xuất INF-γ và IL-4 khi kích thích lại lần 2 Mặt khác,

sử dụng flagellin làm tá dược còn giúp hình thành đáp ứng tế bào TH2 CD4+ tạo IL-3, IL-13 Huleatt JW cùng cộng sự thấy rằng khi dung hợp flagellin với ovalbumin từ trứng

gà, hay p60 và listeriolysin từ Listeria monocytogenes sẽ cải thiện đáng kể thời gian và

chất lượng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Sự gia tăng này chỉ xảy ra trong trường hợp dung hợp các protein này với kháng nguyên, và đáp ứng miễn dịch rất yếu khi tiêm kháng nguyên trên với flagellin riêng lẻ Các đáp ứng miễn dịch này cũng nhanh và mạnh hơn so với sử dụng các tá dược khác là muối phèn hay CFA (complete Freud’s adjuvant)

Việc xác định tính an toàn và hiệu quả của tá dược rất quan trọng trong sản xuất, phát triển vaccine mới Các loại tá dược truyền thống được sử dụng là độc tố vi sinh (độc

tố cholera), các nhân tố gây kích thích bên trong nội bào (cytokine), thành phần vách tế

bào vi sinh vật,… Các nghiên cứu gần đây cho thấy flagellin của Salmonella có thể được

sử dụng như một tá dược đầy tiềm năng do khả năng gây đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu khi chúng cùng hiện diện trong cùng một phân tử protein dung

hợp Đây cũng là một hướng phát triển mới nhằm tạo ra các vaccine gây đáp ứng nhanh, mạnh và đặc hiệu với liều sử dụng thấp, có thể chỉ sử dụng một liều duy nhất trong phòng ngừa

1.7.3 Freund’s adjuvant [30]

Freund’s adjuvant trong dầu gồm có kháng nguyên trong dung dịch nước, dầu khoáng và một chất nhũ hóa (monooleate manite) Tá dược này giúp kháng nguyên được giải phóng chậm từ nơi tiêm vào cơ thể do sự bao bọc kháng nguyên bởi các giọt dầu nhỏ

Freund’s adjuvant hoàn chỉnh (complete Freund’s adjuvant) là Freund’s adjuvant

được bổ sung vi khuẩn Mycobacterium đã được gây chết bằng nhiệt, có tác dụng cao hơn

Freund’s adjuvant vì các thành phần muramyl dipeptide của vách tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa đại thực bào làm tăng hoạt động thực bào, tăng sự trình diện các phân tử MHC lớp II

và các phân tử B7 trên màng tế bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1 Phân tử B7 và các cytokine do đại thực bào tiết ra có vai trò là đồng kích thích tố giúp kích hoạt các tế bào TH Khi bổ sung thêm tá dược này, hoạt động trình diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào TH đều được tăng lên

S-TRANSFERASE [6]

Nhằm hỗ trợ cải thiện sản lượng, ngăn ngừa sự phân hủy, tăng tính tan và thuận lợi cho quá trình tinh chế các protein tái tổ hợp thường được dung hợp với một đuôi ái lực Các đuôi ái lực thường được sử dụng là glutathione S-transferase (GST), thioredoxin (Trx), protein gắn maltose (MBP), polyhistidine (His),…

GST được xem là một trong các loại đuôi ái lực được sử dụng nhiều nhất Đây là một protein có kích thước khoảng 26kDa, thuộc họ enzyme có khả năng vận chuyển lưu huỳnh từ glutathione sang các hợp chất khác như các hợp chất chứa halogen nhằm loại

bỏ tính độc của các hợp chất này đối với tế bào

Ưu điểm của đuôi dung hợp GST là khả năng gắn đặc hiệu với glutathione, được ứng dụng trong việc tinh chế protein tái tổ hợp Vị trí cắt của TEV cũng được thiết kế trong protein dung hợp để hỗ trợ cho việc loại bỏ GST một cách dễ dàng sau khi tinh chế Bên cạnh đó, các protein được biểu hiện dung hợp với GST thường được tăng khả

năng tan khi biểu hiện trong tế bào E coli; đây là một yếu tố thuận lợi cho việc thu nhận

các protein ở dạng tự nhiên, đúng cấu hình, có hoạt tính sinh học khi biểu hiện ở tế bào

E coli

1.9 NGUYÊN TẮC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

1.9.1 Biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào E coli [29]

Kỹ thuật gen ngày nay đã trở thành một giải pháp thích hợp cho việc thu nhận và tinh sạch protein có hoạt tính sinh học Một số hệ thống biểu hiện gen ngoại lai đang

được quan tâm và phát triển Trong số đó, E coli là một trong những chủng chủ lý tưởng

cho việc dòng hóa và biểu hiện protein mong muốn vì đây là một vi sinh vật dễ nuôi cấy,

có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, ổn định và dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector

Bên cạnh đó, đã có rất nhiều nghiên cứu trên E coli, các thông tin di truyền về vi khuẩn

này đã được biết rõ

E coli được xem là một trong các hệ thống tạo dòng đơn giản nhất, được sử dụng

nhiều; các quá trình biểu hiện gen, phiên mã và dịch mã xảy ra song song với nhau, không có hiện tượng sửa đổi sau phiên mã như đối với tế bào nhân chuẩn

Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế khi sử dụng tế bào E coli như việc biểu hiện

protein tái tổ hợp quá mức và tích tụ trong tế bào dẫn đến stress tế bào, các protein tồn tại ở dạng thể vùi dễ bị mất hoạt tính Do vậy, người ta thường phải tiến hành nhiều

phương pháp như tái gấp cuộn hoặc cải biên E coli

1.9.2 Vector biểu hiện trong E coli [24]

Vector biểu hiện được thiết kế nhằm kiểm soát sự phiên mã các gen được dòng hóa, giúp cho các gen này biểu hiện vào một giai đoạn nhất định trong chu kỳ tăng trưởng của tế bào chủ Một số vector phổ biến được sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện

ở tế bào E coli như plasmid, phage lamda,… Tuy nhiên, plasmid được sử dụng phổ biến

vì tính đơn giản, dễ thiết kế, thuận lợi cho việc biến nạp và tái tổ hợp Đồng thời nhiều vector biểu hiện đã được biến đổi một số đặc điểm di truyền trên vùng vector như vùng kiểm soát sự phiên mã, dịch mã, vùng điều hòa tín hiệu tiết,… nhằm thu nhận lượng lớn protein mục tiêu

Một vector biểu hiện tốt cần phải có trình tự ori để tạo nhiều bản sao, gen chỉ thị

để duy trì vector trong tế bào, một promoter mạnh dễ cảm ứng, và vùng khởi đầu dịch

mã tốt (trình tự gắn với ribosome phải nằm ở vị trí cách codon khởi đầu dịch mã một đoạn xác định hoặc cấu trúc bậc hai của mRNA không ngăn chặn sự tương tác với ribosome,…)

Có nhiều hệ thống vector biểu hiện protein dung hợp, trong đó vector pVFT

(Hình 1.3) tỏ ra có nhiều ưu điểm trong việc biểu hiện mạnh protein tái tổ hợp trong E

coli vì:

- Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promoter T7

- Gen lacI mã hóa cho repressor kiểm soát âm hoạt động của promoter T7, lac

repressor chỉ bị bất hoạt khi được cảm ứng bằng lactose hoặc IPTG Nhờ đó, ta có thể kiểm soát được biểu hiện của đoạn gen được chèn

- Vị trí gắn ribosome

- Chứa nhân tố chọn lọc là đoạn gen kháng kanamycin

- Trình tự gen mã hóa cho 6 histidine ở đầu 3’ của gen mục tiêu, cho phép tạo một đuôi oligonucleotide 6 His ở đầu C của protein mục tiêu, thuận lợi cho việc phát hiện và tinh sạch protein mục tiêu

- Vùng MCS (multi cloning site) chứa các trình tự duy nhất của các enzyme cắt giới hạn

- Trình tự kết thúc dịch mã

- Vùng trình tự mã hóa cho protein GST ngay trước vị trí nhận biết của protease TEV (Tobacco etch virus) giúp tăng khả năng thu nhận và tinh sạch protein ngoại lai Đồng thời, sau khi thu nhận protein dung hợp, đuôi GST sẽ được loại bỏ dễ dàng nhờ enzyme protease TEV để đảm bảo tính năng mong muốn của protein mục tiêu Đoạn gen được chèn vào vùng MCS, ngay sau vùng GST, tạo protein dung hợp với GST

Nco I His-tag

CC ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG

thrombin Nde I GST-Tag SpeI-NheI Kpn I

CGC GGC AGC CAT ATG TCC CCT……GGT TCA ACT AGC GGT ACC ACG GAA AAC

TEV recognition site BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I

CTG TAT TTT CAG GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA GCT TGC GGC CGC

Xho I His-tag Stop

ACT CGA GCA CCA CCA CCA CCA CCA CTG AGA TCC GGC TGC TAA

Hình 1.3 Cấu trúc vùng MCS của hệ thống biểu hiện pVFT 2S

1.9.3 Phương pháp tinh chế sắc ký ái lực [29], [34]

Phương pháp tinh chế này là một trong những phương pháp tinh chế quan trọng nhất hiện nay dựa trên khả năng gắn của các phân tử sinh học Các protein mục tiêu được kết hợp với các đuôi dung hợp Các đuôi này tương tác chuyên biệt với ligand được gắn trên các giá thể trơ, có thể là dạng hạt hay dạng cột Ligand phải bám tốt vào phân tử mục tiêu nhằm bắt giữ chúng trong các thể liên kết trong hỗn hợp Việc lựa chọn đuôi dung hợp tùy thuộc vào điều kiện tinh chế protein và cách thức cắt bỏ đuôi dung hợp ở

vị trí chuyên biệt Có khá nhiều loại đuôi dung hợp đã được phát triển như: galactosidase, glutathione-S-transferase, polyhistidine, protein A,… thông qua các ligand tương ứng như ρ-amionophenyl-β-thiogalactosidase, globulin miễn dịch IgG, glutathione

β-và amylose Tuy nhiên, đuôi dung hợp GST β-và polyhistidine được sử dụng phổ biến nhất

Thông thường các đuôi dung hợp thường được chèn thêm một vị trí cắt chuyên biệt của một protease nhằm giúp loại bỏ đuôi sau khi tinh chế

Phương pháp tinh chế dựa trên sắc ký ái lực này thường trải qua ba bước chính là gắn kết, rửa và dung ly phân tử protein mục tiêu ra khỏi chất nền

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh chế dựa vào đuôi dung hợp GST Đây là một họ enzyme có khả năng biến đổi các hợp chất độc (như nitơ và halogen) bằng cách gắn thêm sulfur từ glutathione Đa số các loại GST động vật được tinh chế nhờ sắc ký ái lực với cơ chất glutathione, được rửa bằng lượng thừa glutathione dạng khử Dựa trên tính chất này, Smith và John (1988) đã phát hiện hệ thống biểu hiện dung hợp gen với GST Sau khi dung hợp vào đầu C của GST, protein tái tổ hợp có thể được tinh chế hiệu quả nhờ phương pháp sắc ký ái lực glutathione

Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế vì GST là một protein có kích thước tương đối lớn, dễ bị protease phân cắt Đồng thời khả năng bám dính của nó lên glutathione chỉ xảy ra ở dạng cấu hình bình thường Do vậy, quá trình tinh chế phải diễn

ra trong điều kiện tự nhiên để GST có thể giữ nguyên cấu hình Không giống đuôi polyhistidine tương tác không đặc hiệu với nikel làm giảm tính chuyên biệt, ligand glutathione bám rất chuyên biệt lên GST, do đó tính chọn lọc của phương pháp tinh chế này rất cao

Sau khi tinh chế có thể dễ dàng loại bỏ GST nhờ vị trí cắt của TEV Bên cạnh đó, các protein dung hợp với đuôi GST được tăng khả năng tan

1.9.4 Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên động vật để thu nhận kháng thể đa

dòng [28], [32]

Kết quả gây đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố: thuộc tính kháng nguyên, các yếu tố ảnh hưởng đến tính gây đáp ứng miễn dịch của một chất, động vật gây đáp ứng, kinh nghiệm gây đáp ứng miễn dịch

Các bước cơ bản trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch thu kháng huyết thanh gồm có:

- Chuẩn bị kháng nguyên (miễn dịch nguyên): kháng nguyên cần phải có độ tinh sạch nhất định để có thể sử dụng gây đáp ứng miễn dịch Trường hợp kháng nguyên là một protein thì có thể ở dạng cấu hình tự nhiên hoặc ở dạng biến tính

- Phối trộn với tá dược: phổ biến hiện nay là tá dược Freund dạng nhũ tương Kháng nguyên được trộn với tá dược theo tỷ lệ bằng nhau cho đến khi tạo thành hệ nhũ tương không thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ phòng

- Gây đáp ứng miễn dịch gồm các giai đoạn: trước khi gây đáp ứng, trong thời gian gây đáp ứng, sau khi hình thành đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên Một số điều cần lưu ý trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch:

 Trước khi tiêm, phải thu máu để kiểm tra sự hiện diện (nếu có) của kháng thể trong huyết thanh

 Đáp ứng miễn dịch cần thời gian vài tuần

 Sau 4 tuần kể từ khi gây miễn dịch liều đầu tiên tiến hành nhắc liều lần 1 Từ liều nhắc này trở đi, cách 2 tuần tiêm nhắc lại lần 2, lần 3,… cho đến khi không cần thu kháng huyết thanh

 Kháng thể tạo thành sau những lần tiêm nhắc sẽ có ái lực chuyên biệt với kháng nguyên cao hơn lần đầu Lượng kháng thể được tạo ra nhiều nhất sau 5 – 10 ngày sau khi tiêm nhắc và giảm dần theo thời gian

Tùy vào loại động vật và trọng lượng của chúng mà lượng kháng thể được sử dụng sẽ khác nhau

1.9.5 Phương pháp ELISA để kiểm chứng tính kháng nguyên của epitope HA tái

tổ hợp [7], [21]

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Đây là một phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao để phát hiện hay định lượng kháng nguyên và kháng thể thay thế cho các phương pháp miễn dịch khác như: ngưng kết miễn dịch, sử dụng các đồng vị phóng xạ

Qui trình ELISA gồm các bước cơ bản sau:

- Cố định kháng nguyên hay kháng thể lên giếng: hầu hết các đĩa ELISA hiện nay làm từ polystyrene hoặc từ dẫn xuất của polystyrene, cho phép tạo ra các tương tác kỵ nước giữa protein với các chuỗi carbon chứa vòng benzene trên bề mặt giếng Để tăng hiệu quả gắn protein lên bề mặt giếng, bề mặt các đĩa ELISA đã được cải tiến bằng cách tăng lực tương tác kỵ nước như thêm các nhóm carboxyl, hydroxyl, nhóm amine, hydrazine và N-oxysuccinimide

- Khóa các vị trí không có kháng nguyên hoặc kháng thể: sau khi cố định kháng thể hoặc kháng nguyên lên bề mặt giếng thường còn để lại những vị trí trống có thể tạo

sự gắn không đặc hiệu dẫn đến làm tăng tín hiệu nền và giảm độ nhạy, độ đặc hiệu Các

vị trí này được khóa lại bằng một số hợp chất như albumin huyết thanh bò, sữa gầy, casein hoặc caseinate, huyết thanh, gelatin cá, phổ biến nhất là sữa gầy

- Hình thành phức hợp miễn dịch: kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện được bổ sung vào giếng Nếu kháng nguyên được cố định trên giếng thì kháng thể sơ cấp được bổ sung vào (trường hợp 1) Nếu kháng thể được cố định thì kháng nguyên được

bổ sung vào (trường hợp 2) Tiếp theo, kháng thể thứ cấp cộng hợp với enzyme kháng kháng thể sơ cấp được bổ sung (đối với trường hợp 1) hoặc kháng thể cộng hợp enzyme kháng kháng nguyên được bổ sung (đối với trường hợp 2)

- Đo hoạt tính enzyme: cơ chất của enzyme cộng hợp được bổ sung vào giếng và tạo sản phẩm có màu được hình thành Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu

ELISA được dùng để phát hiện và định lượng kháng nguyên hay kháng thể phụ thuộc vào kháng nguyên hay kháng thể được cố định trên pha rắn Mỗi ứng dụng này lại

có một số dạng ELISA khác nhau

- Các dạng ELISA cố định kháng nguyên: ELISA kháng nguyên trực tiếp, ELISA kháng nguyên / kháng thể gián tiếp, ELISA ức chế kháng nguyên, ELISA kháng thể cạnh tranh

- Các dạng ELISA cố định kháng thể: ELISA kháng thể trực tiếp, ELISA kháng nguyên cạnh tranh, ELISA sandwich

Với mục đích phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên và kháng thể hiện diện trong kháng huyết thanh, dạng ELISA kháng nguyên/kháng thể gián tiếp được chọn để

sử dụng trong luận văn này Điều này giúp thu được kết quả có độ nhạy cao hơn so với dạng trực tiếp, đồng thời thao tác cũng đơn giản hơn so với các dạng khác

PHẦN 2

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị

Ngoài các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm, còn có các thiết bị sau:

- Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific)

- Autoclave (SS325-TOMY)

- Máy PCR (Biorad)

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Máy đo pH (Orion, Anh)

- Tủ ấm Memmert (Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Mikro22R (Hettich Zentrifugen)

- Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technology)

- Hộp đèn soi tia tử ngoại Hoefer (UVTM - 19 - 230V)

- Máy đo quang phổ chuyên dụng (Amersham Biosciences)

- Máy đo quang phổ chuyên dụng Nanodrop®

- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)

- Thiết bị lai Hoefer miniVE

- Cột tinh chế protein GST (Amersham): GSTrapTMFF 5ml

- Dụng cụ cho phương pháp lai Western-blot: màng lai Hybond ECL, phim nhạy với nguồn ánh sáng yếu (Kodak), hộp hiện phim, hộp nhựa

- Đĩa ELISA 96 giếng

- Máy Wash BIO-TEK ELx50

- Máy đọc ELISA Thermo electron corporation

2.1.2 Vật liệu sinh học

a Enzyme

- Enzyme cắt hạn chế: EcoRI, SalI (Fermentas)

- Enzyme dùng trong phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, Pfu DNA

polymerase (Fermentas)

- Enzyme nối: T4 DNA ligase (Fermentas)

- Chủng E coli BL21(DE3) (F- dcm ompT hsdSB (r-B m-B) gal (DE3))

được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp

c Vector

Chúng tôi sử dụng plasmid pVFT-hab được cung cấp bởi PTN.CNSHPT

Trường ĐHKHTN, ĐHQG - HCM (Hình 2.1) Đây là hệ thống plasmid pVFT

được dùng để làm vector biểu hiện các gen mục tiêu, mang gen kháng kháng sinh

Kan r , có promoter tac điều hòa biểu hiện ở vùng MCS, và gen lacIq tham gia vào

sự điều hòa biểu hiện của promoter tac Ngoài ra vùng mang gen mã hóa cho GST nằm ngay sau promoter tac có thể được điều khiển bằng IPTG Vùng MCS nằm ngay sau đoạn gen GST và có chứa các enzyme cắt giới hạn phù hợp cho việc tạo

protein dung hợp Plasmid pVFT là một hệ thống dùng tạo dòng và biểu hiện

mạnh protein tái tổ hợp trong Escherichia coli Do đó, chúng tôi dùng hệ thống này để cấu trúc chèn đoạn gen fljB đồng khung dịch mã với trình tự nucleotide

mã hóa cho protein GST và HAeB

Hình 2.1 Plasmid pVFT-hab

d Epitope HAeB [2]

[‘N’-FGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG-‘C’] được tổng hợp hóa học bởi công ty

SBSbioscience Trung Quốc Đây là một trong số các epitope liên tục thuộc kháng nguyên HA được nhận diện bởi tế bào B đã được dự đoán phương pháp Tin Sinh học

thuộc đề tài KC.04.18/06-10 và nằm trong vùng bảo tồn của virus H5N1

e Virus H5N1 bất hoạt

Virus H5N1 bất hoạt được cung cấp bởi Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng thuộc Đại học Oxford tại Bệnh viện Bệnh nhiệt đới TP HCM Virus này thuộc chủng A/H5N1/Chicken13 Vietnam/LA/2006

- Mã lô: 2009020 - Ngày sản xuất: 30/ 09/2009 - Hạn sử dụng: 29/ 09/ 2010

- Hãng sản xuất: Harbin Weike Biotechnology Development Co – Harbin Veterinary Research Institute, CAAS

g Mồi

- Cặp mồi fljB-F và fljB-R được cung cấp bởi PTN CNSHPT dùng để thu

nhận gen fljB

- Các cặp mồi fljB-F, fljB-R và hab-F, hab-R dùng để kiểm tra plasmid mang

gen mục tiêu Trình tự nucleotide mồi được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn