Tạo và khảo sát hoạt tính sinh học in vitro của thụ thể interleukin 33 dạng tự do được biểu hiện từ tế bào người hek293

Mục tiêu của nghiên cứu: tạo ra protein lai msIL-33R:Fc hIgG1 thụ thể IL-33 dạng tự do của chuột gắn với vùng Fc IgG1 của người biểu hiện từ tế bào HEK293 Human Embryo Kidney có hoạt tí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU

TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO

CỦA THỤ THỂ INTERLEUKIN-33 DẠNG TỰ DO ĐƯỢC BIỂU HIỆN TỪ TẾ BÀO NGƯỜI HEK293

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN ĐĂNG QUÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời “CẢM ƠN THẦY!” chân thành đến

TS Nguyễn Đăng Quân, cảm ơn Thầy với những kiến thức chuyên ngành

mới, những phương pháp nghiên cứu hay và tinh thần đam mê trong công

việc … Không chỉ giới hạn trong luận văn này mà nó sẽ có ý nghĩa rất lớn đối

với em trong những bước đi tiếp theo

Cảm ơn những người bạn trong nhóm đề tài – anh Lê Gia Bảo và bạn

Nguyễn Thị Thanh Thảo, mỗi người một tính cách, mỗi hướng giải quyết vấn

đề, nhưng sự hợp tác đã giúp chúng tôi khắc phục khó khăn và lần lượt hoàn

thành từng thí nghiệm Rất vui khi được làm việc cùng mọi người

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị phòng CNSH Y Dược và

CNSH Thủy Sản – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM đã giúp đỡ em

trong thời gian qua

Luận văn này sẽ không thể thực hiện nếu không có nguồn kinh phí

nghiên cứu khoa học của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM Tôi xin

chân thành cám ơn quý Trung tâm cũng như Ban Giám đốc Trung tâm đã tạo

điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này

Con vẫn luôn cố gắng sống tốt để không phụ lòng mong mỏi của Ba –

Má Cảm ơn Ba – Má của con thật nhiều!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2012

Trương Thị Hoàng Diệu

ii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Vai trò của IL-33 trong sinh lý và bệnh lý 2

1.1.1 Vai trò của IL-33 trong sinh lý 2

1.1.2 Vai trò của IL-33 trong bệnh lý 3

1.2 Đặc điểm sinh học của IL-33 6

1.2.1 Cấu trúc của IL-33 6

1.2.2 Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33 7

1.2.3 IL-33 ngoại bào và nội bào 8

1.2.4 Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 9

1.3 Đặc điểm sinh học của IL-33R 10

1.3.1 Cấu trúc của IL-33R 10

1.3.2 Tương tác của IL-33 với IL-33R 11

1.3.3 IL-33R dạng tự do 12

1.4 Ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp tìềm năng điều trị các bệnh viêm – dị ứng 12

1.5 Sơ lược về các dược phẩm ức chế hoạt động cytokine dựa trên nguyên tắc

tương tác cạnh tranh 14

1.6 Hệ thống tế bào động vật biểu hiện protein tái tổ hợp 16

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Plasmid 18

iii

2.1.2 Hóa chất tạo dòng plasmid biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1 19

2.1.3 Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn E coli 19

2.1.4 Hóa chất nuôi cấy tế bào HEK293 và EL-4 19

2.1.5 Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào E.coli và HEK293 20

2.1.6 Hóa chất li giải tế bào, định lượng protein và thủy phân nhóm đường trên glycoprotein 20

2.1.7 Hóa chất dùng cho SDS-PAGE, Western Blot và đồng kết tủa miễn dịch 20

2.1.8 Hóa chất ELISA 21

2.2 Phương pháp 22

2.2.1 Tạo plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 22

2.2.1.1 Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho sIL-33R của chuột 22

2.2.1.2 Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose 23

2.2.1.3 Tinh sạch DNA 23

2.2.1.4 Cắt hạn chế DNA bằng NotI và HindIII 24

2.2.1.5 Phản ứng nối DNA bằng ligase 25

2.2.1.6 Biến nạp plasmid vào E coli DH5α khả nạp 25

2.2.1.7 Tách chiết plasmid từ E coli 26

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 27

2.2.2.1 Nuôi cấy E coli DH5α 27

2.2.2.2 Bảo quản E coli DH5α mang plasmid 27

2.2.2.3 Tạo tế bào khả nạp E coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp 27

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào HEK293 28

2.2.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào EL-4 29

2.2.5 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào HEK293 29

2.2.6 Phương pháp phân giải tế bào 30

2.2.7 Phương pháp Bradford định lượng protein 30

iv

2.2.8 Phương pháp thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1từ dịch nuôi cấy

tế bào HEK293 31

2.2.9 Phương pháp thủy phân nhóm đường trên glycoprotein msIL-33R:Fc hIgG1 bằng PNGase F 32

2.2.10 Phương pháp tạo IL-33 chuột đánh dấu biotin 32

2.2.11 Phương pháp SDS-PAGE, Western Blotting 33

2.2.11.1 Điện di SDS-PAGE 33

2.2.11.2 Western Blotting 35

2.2.12 Phương pháp đồng kết tủa miễn dịch (co-immunoprecipitation) 36

2.2.12.1 Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và msIL-33R:Fc hIgG1 36

2.2.12.2 Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và FLAG-IL33R 36

2.2.13 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào nuôi cấy 37

2.2.14 Phương pháp ELISA định lượng mIL-2 38

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 39

3.1.1 Khuếch đại, thu nhận đoạn gen mã hóa thụ thể IL-33 dạng tự do của chuột và chuẩn bị vector Signal pIgplus cho tạo dòng 39

3.1.2 Tạo plasmid Signal pIgplus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein msIL-33R:Fc hIgG1 40

3.2 Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293 42

3.3 Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 44

3.3.1 Sự đường hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 tái tổ hợp biểu hiện từ HEK293 44

3.3.2 Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện và tiết ra môi trường ngoại bào ở dạng dimer 46

3.4 Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin từ vi khuẩn E.coli 48

v

3.5 Sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện

in vitro 50

3.6 Sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 52

3.7 Khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro 55

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 71

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APC Antigen Presenting Cells

BMMC Bone marrow–derived mast cell

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Fc Fragment crystallizable region

FCS Fetal calf serum

HEK293 Human Embryonic Kidney 293

hIgG1 Human immunoglobulin G1

vii

LFA-3 Lymphocyte function-associated antigen 3

MAP kinase Mitogen-activated protein kinase

mIL-2 Mouse interleukin-2

mIL-33 Mouse interleukin-33

mRNA Messenger ribonucleic acid

msIL-33R Mouse soluble interleukin-33 receptor MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88

NCBI National Center for Biotechnology Information

NF-HEV Nuclear factor – high endothelial venule

NFκB Nuclear factor kappa B

OD Optical density

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis

TAB TAK1 binding protein

TAK1 TGF-β-activated kinase 1

Th T helper cell

TIR Toll-like Interleukin-1 Receptor

TNF Tumor Necrosis Factor α

TPO Thrombopoietin

TRAF-6 TNF Receptor Associated Factor 6

WB Western Blot

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các biệt dược có bản chất là protein lai mang vùng Fc IgG1 15 Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide dùng trong SDS-PAGE 20 Bảng 2.2 Các kháng thể được sử dụng trong thí nghiệm Western Blot 21 Bảng 3.1 Đáp ứng tiết mIL-2 do tác động của mIL-33 từ tế bào EL-4 khi được xử

lý với msIL-33R:Fc hIgG1 ở nhiều nồng độ khác nhau 57

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc không gian IL-33 của người 6

Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 10

Hình 1.3 Cấu trúc không gian vùng ngoại bào của IL-33R và tương tác giữa IL-33R với IL-33 11

Hình 1.4 sIL-33R (ST2) có cấu trúc tương đồng với vùng ngoại bào của IL-33R (ST2L) và ngăn cản con đường truyền tín hiệu của IL-33 12

Hình 1.5 Mô hình ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 14

Hình 2.1 Sơ đồ của các plasmid được sử dụng trong đề tài 18

Hình 3.1 Thu nhận đoạn gen mã hóa msIL-33R và vector Signal pIgplus 40

Hình 3.2 Kết quả sàng lọc các dòng plasmid tái tổ hợp 41

Hình 3.3 Biểu hiện và tinh sạch sơ bộ protein msIL-33R:Fc hIgG1 từ hệ thống tế bào người HEK293 44

Hình 3.4 Sự glycosyl hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện từ tế bào người HEK293 46

Hình 3.5 Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện ở dạng dimer 48

Hình 3.6 Biểu hiện IL33 chuột đánh dấu biotin 50

Hình 3.7 Protein msIL-33R:Fc hIgG1 biểu hiện từ HEK293 tương tác với bio-mIL33 ở điều kiện in vitro 52

Hình 3.8 msIL33R:Fc hIgG1cạnh tranh với FLAG-IL33R biểu hiện trên bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 54

Hình 3.9 msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế hoạt động của IL-33 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy 57

1

LỜI MỞ ĐẦU

Interleukin(IL)-33 là thành viên mới nhất của họ cytokine tiền viêm IL-1 có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch bảo vệ cơ thể Tuy nhiên, hoạt động bất thường của IL-33 được chứng minh là có liên quan đến các bệnh dị ứng và viêm như hen suyễn, viêm da dị ứng, viêm thấp khớp Do đó, ức chế hoạt động của IL-33 có thể là một giải pháp mới để góp phần điều trị các bệnh nêu trên

Mục tiêu của nghiên cứu: tạo ra protein lai msIL-33R:Fc hIgG1 (thụ thể IL-33

dạng tự do của chuột gắn với vùng Fc IgG1 của người) biểu hiện từ tế bào HEK293 (Human Embryo Kidney) có hoạt tính sinh học ức chế hoạt động của IL-33 msIL-33R:Fc hIgG1 ức chế IL-33 bằng cách bắt lấy IL-33 tự do qua đó hạn chế sự tác động của cytokine này lên tế bào đích thông qua thụ thể của nó trên bề mặt tế bào

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein 33R:Fc hIgG1

msIL-2 Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293

3 Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1

4 Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin (bio-mIL33) từ vi khuẩn

E.coli

5 Khảo sát sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong

điều kiện in vitro

6 Khảo sát sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện

ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33

7 Đánh giá khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1

trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro

Phần tổng quan tài liệu sẽ tóm tắt các hiểu biết hiện nay về hệ IL-33/IL-33R

và một số vấn đề có liên quan đến đề tài nghiên cứu

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vai trò của IL-33 trong sinh lý và bệnh lý

1.1.1 Vai trò của IL-33 trong sinh lý

Interleukin-1 (IL-1) là một họ cytokine tiền viêm gồm các thành viên IL-1α, IL-1β, IL-18 và IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist) đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phòng vệ của cơ thể, trong điều hòa miễn dịch và phản ứng viêm Năm 2005, Schmitz và cs phát hiện một thành viên mới của họ IL-1 là IL-33 [64]

IL-33 đầu tiên được tìm thấy trong tế bào thành mạch nội mô, có chức năng điều hòa biểu hiện gen và được đặt tên là NF-HEV (nuclear factor – high endothelial venule) [7] Protein này được xác định có trình tự amino acid tương đồng cao với IL-18 và cấu trúc phiến β giống với các thành viên trong họ IL-1 [64]

IL-33 có vai trò quan trọng trong hệ thống phòng vệ của cơ thể, nó có thể hoạt hóa các tế bào trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng IL-

33 có thể hoạt hóa trực tiếp tế bào Th2 và qua đó kích thích các tế bào B giải phóng các cytokine tiền viêm IL-4, IL-5, IL-13 và kháng thể IgM (immunoglobulin M) [30], [64] Phát hiện gần đây trên mô hình chuột cho thấy tế bào tua (dendritic cell) khi bị kích thích bởi IL-33 có thể biệt hóa tế bào T thành tế bào Th2 [60] IL-33 tác động lên tế bào bạch cầu hạt ưa acid (eosinophil) làm cho các tế bào này sản xuất IL-8, giải phóng hạt và giúp cho sự tồn tại của tế bào [15], [64] Đối với tương bào (mast cell) và bạch cầu hạt ưa kiềm (basophil), IL-33 cảm ứng sự trưởng thành, sự giải phóng hạt, sự tồn tại và sản xuất một số cytokine tiền viêm như IL-8, IL-13, IL-

4, IL-6 và histamin [5], [26], [65] IL-33 làm giảm tình trạng nhiễm trùng do tăng cường bạch cầu hạt trung tính (neutrophil) tới vị trí mô bị xâm nhiễm do kích thích tính hóa hướng động của loại tế bào này [6] IL-33 còn tăng cường sự biệt hóa đại thực bào (macrophage) theo hướng đáp ứng miễn dịch tế bào Th2 và tăng sự sản xuất TNFα (Tumor Necrosis Factor α) từ các đại thực bào được cảm ứng bởi LPS (lipopolysaccharide) [19], [35]

3

Ngoài ra, hoạt động của IL-33 còn đóng vai trò bảo vệ hệ thống tim mạch chống lại các bệnh như cao huyết áp [63] và xơ vữa động mạch [44] Gần đây, có công bố cho rằng IL-33 liên quan đến quá trình tạo mô xương khi nó có khả năng biệt hóa bạch cầu đơn nhân (monocyte) thành tế bào xương (osteoblast) và kích thích các tế bào khác tăng cường sự biểu hiện các tác nhân hoạt hóa tế bào xương [49] Tuy nhiên cũng có một số báo cáo phủ nhận kết luận này [62], [66]

1.1.2 Vai trò của IL-33 trong bệnh lý

Như đã thấy ở trên, IL-33 cùng với các cytokine trong họ IL-1 có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ miễn dịch Thông thường các cytokine này được kiểm soát chặt chẽ trong viêm cấp tính để tránh sự hủy hoại mô do tăng cường các hoạt động dị hóa

Tuy nhiên, sự biểu hiện quá mức của IL-33 có thể gây ra nhiều bệnh lý viêm

và dị ứng Hen suyễn là một bệnh viêm mãn tính được xác định do các đáp ứng quá mức ở phổi, viêm dị ứng, tăng nồng độ IgE (immunoglobulin E) trong huyết thanh

và tăng cường sản xuất các cytokine liên quan đến Th2 Do vậy, IL-33 là nhân tố quan trọng trong bệnh hen suyễn qua con đường đáp ứng miễn dịch Th2 [39] IL-33 được biểu hiện tăng cao ở tế bào biểu mô phế quản của bệnh nhân hen suyễn (asthma) và đặc biệt cao ở các bệnh nhân hen nặng [58] Một số nghiên cứu trên mô hình động vật cho thấy vai trò quan trọng của con đường IL-33/ST2L trong hen suyễn và viêm khí quản dị ứng Tiêm IL-33 vào chuột bị gây viêm khí quản làm tăng nặng tình trạng của bệnh [34] IL-33 kích thích các đáp ứng quá mức, kích thích sự tăng sinh tế bào hình trụ, cảm ứng bạch cầu hạt ưa acid và đại thực bào, tích tụ các cytokine IL-4, IL-5 và IL-13 trong phổi [31], [35], [71]

Tác động của IL-33 như một yếu tố tiền viêm cũng được xác định trong bệnh viêm khớp do sự hoạt hóa quá mức nguyên bào sợi và tương bào trong các khớp IL-33 được tìm thấy trong tế bào nội mô và nguyên bào sợi màng hoạt dịch ở các bệnh nhân viêm thấp khớp, viêm khớp xương và viêm khớp vảy nến [74] IL-33 cũng biểu hiện trong nguyên bào sợi màng hoạt dịch từ bệnh nhân bị viêm khớp được

nuôi cấy trong điều kiện in vitro [80] IL-33 cũng có mặt trong huyết thanh những

4

bệnh nhân viêm thấp khớp và nhiều hơn so với trường hợp bị viêm khớp xương [48], [74] Tác động của IL-33 trong viêm khớp cũng được chứng minh ở mô hình bệnh lý trên chuột Sự biểu hiện mRNA của IL-33 tăng lên trong mô khớp của chuột viêm khớp được cảm ứng bởi collagen và tăng mạnh trong thời kỳ đầu của bệnh [80] Khi gây viêm khớp trên chuột không biểu hiện ST2 (thụ thể của IL-33), kết quả cho thấy có

sự giảm sản xuất các cytokine tiền viêm (IL-17, TNFα và IFNγ- Interferon γ) và kháng thể so với khi gây viêm khớp ở chuột hoang dại Ngược lại, tiêm IL-33 vào chuột bị gây viêm khớp sẽ làm gia tăng hiện tượng viêm [53], [80] Hoạt động của IL-33 gây viêm khớp được chứng minh có liên quan đến tương bào (mast cell) vì khi xử lý IL-33 trên chuột thiếu tương bào thì không thấy tăng tình trạng bệnh viêm khớp [79]

IL-33 cũng được thấy là có liên quan đến bệnh viêm da IL-33 được biểu hiện nhiều hơn ở mô da của những bệnh nhân viêm da so với người bình thường [59] Nồng độ IL-33 cũng tăng lên trong huyết thanh của các bệnh nhân bị xơ hóa

da [83] Hơn nữa, xử lý IL-33 làm tăng mức độ xơ hóa da ở mô hình bệnh lý viêm

da trên chuột [61] Ngược lại, khi gây cảm ứng viêm da ở chuột không biểu hiện protein ST2 cho thấy mức độ bệnh lý nhẹ hơn so với khi gây viêm da ở chuột hoang dại có biểu hiện ST2 [25]

Hoạt động đáp ứng miễn dịch quá mức trong hệ thống đường ruột cũng gây

ra các triệu chứng viêm ruột như viêm loét đại tràng và bệnh Crohn Một số báo cáo cho thấy có sự liên quan giữa IL-33 và các dạng bệnh viêm ruột IL-33 biểu hiện nhiều ở nguyên bào sợi và tế bào biểu mô ruột của các bệnh nhân bị viêm loét đại tràng và bệnh Crohn, đồng thời IL-33 và sST2 (thụ thể IL-33 dạng tự do) cũng được tìm thấy trong huyết thanh [9], [11], [54] Chuột được xử lý IL-33 có biểu hiện tăng sinh biểu mô ruột, gia tăng số lượng bạch cầu hạt ưa acid và bạch cầu hạt trung tính

di chuyển từ máu vào niêm mạc ruột [64] IL-33 làm tăng tình trạng bệnh trong mô hình chuột bị viêm ruột liên quan đến Th1/Th2 và cảm ứng sản xuất IL-17 từ các tế bào hạch bạch huyết (lymph node cell) [54]

Hiện nay, vai trò của IL-33 bước đầu cũng được nghiên cứu trên một số bệnh như thần kinh, tim mạch, béo phì và ung thư Có sự giảm biểu hiện IL-33 trong não

5

của bệnh nhân Alzheimer, điều này cho thấy IL-33 có thể có vai trò trong hoạt động bảo vệ hệ thống tế bào thần kinh [13] IL-33 làm giảm tình trạng phình đại và xơ hóa tim, giảm chứng nhồi máu cơ tim và cải thiện chức năng tâm thất [67] IL-33 làm giảm sự tiến triển của chứng xơ vữa động mạch do hoạt hóa con đường sản xuất các cytokine Th2, ức chế con đường miễn dịch Th1 nên giảm hàm lượng IFNγ trong huyết thanh và các tế bào hạch bạch huyết [44] IL-33 hiện diện trong các tế bào mỡ và được chứng minh là làm giảm tình trạng tích lũy mỡ của các tế bào này

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, khi bị kích thích bởi IL-33 tế bào mô mỡ tăng

biểu hiện các cytokine Th2 (IL-5, IL-13, IL-10) và giảm biểu hiện các protein của con đường sinh tổng hợp và tích lũy lipid Hơn nữa, mức độ béo phì của mô hình chuột sẽ giảm xuống khi chúng được tiêm IL-33 Ngược lại, với chế độ ăn nhiều chất béo, chuột không biểu hiện ST2 có mức độ béo phì cao hơn so với chuột hoang dại Như vậy, IL-33 có thể có hoạt tính chống lại sự béo phì [43] IL-33 còn được cho là có vai trò trong bệnh ung thư Kết quả thực nghiệm cho thấy đáp ứng miễn dịch tế bào chống khối u tăng lên ở mô hình chuột ung thư không biểu hiện gen ST2

so với chuột ung thư có biểu hiện ST2 [27] Điều này có thể được giải thích là do con đường tín hiệu IL-33/ST2 hoạt hóa đáp ứng miễn dịch thể dịch Th2 và ức chế đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua Th1, nên khi con đường IL-33/ST2 bị ức chế thì đáp ứng Th1 sẽ tăng mạnh lên dẫn đến kết quả là khả năng kháng khối u cao hơn Bên cạnh đó, IL-33 nội bào được thấy biểu hiện nhiều trong các tế bào nội mô

ở trạng thái nghỉ nhưng protein này không được biểu hiện ở tế bào ung thư [33] Điều này cho thấy IL-33 nội bào có thể có chức năng kiểm soát sự phân chia của tế bào và ngăn chặn sự biến đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu hơn cần được thực hiện để làm rõ giả thiết này

Các kết quả nghiên cứu nêu trên cho thấy IL-33 có liên quan đến cơ chế sinh bệnh của nhiều bệnh khác nhau đặc biệt là các bệnh viêm tự miễn và dị ứng Do vậy, IL-33 có thể là phân tử đích được hướng tới trong các liệu pháp điều trị mới cho những bệnh này

6

1.2 Đặc điểm sinh học của IL-33

1.2.1 Cấu trúc của IL-33

Tiền IL-33 (preIL-33) ở người gồm 270 amino acid (aa) có kích thước 30 kD, đầu N (aa 1-111) của protein này có tín hiệu định vị nhân và đầu C (aa 112-270) có cấu trúc tương đồng với họ IL-1 IL-33 của chuột gồm 266 aa, có trình tự aa tương

đồng cao với IL-33 người (55%) Trong điều kiện in vitro, IL-33 người có thể bị

caspase-1 phân cắt ở vị trí aa 111 để tạo thành IL-33 trưởng thành (matIL-33) kích thước 18kD, IL-33 chuột bị caspase-1 phân cắt ở vị trí aa 108 tạo matIL-33 từ aa 109-

266 preIL-33 và matIL-33 đều có hoạt tính cytokine kích thích tế bào đích thông qua tương tác với thụ thể của nó là ST2L hay còn gọi là IL-33R [3], [5], [8], [11], [64] Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây chứng minh rằng preIL-33 có thể bị phân cắt bởi caspase-3 và caspase-7 ở vị trí aa 178 trên người và vị trí aa 175 trên chuột tạo nên sản phẩm cắt không có hoạt tính sinh học [3], [41], [73]

Cấu hình không gian của IL-33 gồm 12 chuỗi xoắn β sắp xếp thành cấu trúc trefoil và hai chuỗi xoắn α nằm trước β8 và β12 Vùng lõi β-trefoil được bảo tồn cao

β-so với các cấu trúc trung gian nối giữa các chuỗi β, đặc biệt là đoạn nối giữa β4- β5 gồm 10 aa rất linh động và không có cấu trúc ổn định Ngoài ra, một số vùng trong cấu trúc protein có khả năng làm tăng động lực của phân tử trong quá trình tương tác như đầu N từ gốc aa 1 đến 9, đoạn nối β3- β4 từ gốc aa 40 đến 46, đoạn nối β11- β12 từ gốc aa 143 đến 150 và đầu C từ gốc aa 159 đến 160 [37]

Hình 1.1 Cấu trúc không gian IL-33 của người [37]

7

1.2.2 Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33

Đầu tiên, IL-33 được gọi là yếu tố nhân của tế bào thành mạch nội mô (Nuclear Factor – High Endothelial Venule: NF-HEV) vì nó được tìm thấy trong nhân của các tế bào này [7], [11] Tế bào thành mạch nội mô là những tế bào được biệt hóa từ các mô bạch huyết thứ cấp, chúng biểu hiện các phân tử bám dính cho phép các tế bào bạch cầu di chuyển từ máu vào mô bạch huyết Gần đây, IL-33 cũng được tìm thấy trong nhân của các tế bào biểu mô, đặc biệt là ở da, thành ruột

và phổi [47]

IL-33 sau khi được sản xuất ở các tế bào nội mô và biểu mô, được tiết ra ngoài

tế bào và biến đổi thành dạng có hoạt tính sinh học như một cytokine hoặc có thể vào nhân để thực hiện chức năng như một yếu tố điều hòa phiên mã [11], [64] Tuy nhiên, cơ chế tiết của IL-33 hiện nay vẫn chưa rõ Vì trong cấu trúc của IL-33 không chứa trình tự tiết nên IL-33 không thể tiết theo cơ chế thông thường là qua hệ thống nội chất nhám và thể Golgi Vì vậy, có nhiều khả năng là IL-33 được tiết theo

cơ chế hoại tử của tế bào dưới dạng tiền phân tử, sau đó được biến đổi và tác động lên các tế bào đích qua phức hợp thụ thể của nó [41]

IL-33 kích thích tế bào đích thông qua thụ thể đặc hiệu IL-33R và đồng thụ thể

là IL-1RAcP (IL-1 Receptor Accessory Protein) hiện diện trên màng một số tế bào đích của nó như bạch cầu hạt ưa kiềm, bạch cầu hạt ưa acid, tương bào, tế bào giết tự nhiên và lympho bào Th2 [2], [12], [64] Trong đó, lympho bào Th2 và tương bào là những tế bào biểu hiện thụ thể IL-33 nhiều nhất IL-33 cảm ứng lympho bào Th2 tiết IL-5 và IL-13, cảm ứng tương bào tiết một số cytokine và chemokine như IL-1β, IL-

6, IL-13, TNF và MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) [24], [46], [64] Bạch cầu hạt ưa kiềm biểu hiện IL-33R ít hơn so với lympho bào Th2 và tương bào, ngoài

ra sự biểu hiện thụ thể IL-33 ở đây được kích thích bởi IL-3 Do đó IL-33 cũng có thể tác động trực tiếp lên bạch cầu hạt ưa kiềm kích thích tế bào này tạo các cytokine Th2, nhưng vai trò quan trọng hơn là nó phối hợp với IL-3 và IgE trong tăng cường đáp ứng miễn dịch của bạch cầu hạt ưa kiềm [55], [72] IL-33 tác động trực tiếp bạch cầu hạt ưa acid kích thích sản xuất IL-8 và các chất oxid hóa, đồng thời phối hợp với

8

GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor)làm tăng cường hoạt động tiết IL-3, IL-5 và IL-8 của bạch cầu hạt ưa acid [15], [55] IL-33 hoạt hóa tế bào giết tự nhiên làm tăng biểu hiện và tiết IFN-γ [10] Ngoài ra, IL-33 còn tác động lên

tế bào tua làm tăng cường tiết IL-6, kích thích sự biểu hiện IL-8 ở tế bào biểu mô và nội mô thông qua phức hợp thụ thể của nó trên bề mặt tế bào [60], [82]

Như vậy, IL-33 được tạo ra chủ yếu từ các tế bào nội mô, biểu mô và kích thích nhiều loại tế bào bạch huyết tạo ra các cytokine đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch bẩm sinh và thích ứng

1.2.3 IL-33 ngoại bào và nội bào

Dựa vào chức năng mà IL-33 được chia thành hai dạng là IL-33 ngoại bào và IL-33 nội bào

IL-33 ngoại bào là IL-33 được phóng thích ra ngoài tế bào và thực hiện chức năng như một cytokine tiền viêm bằng cách tác động lên các tế bào đích thông qua phức hợp thụ thể IL-33R đặc hiệu của nó hiện diện trên bề mặt tế bào Đầu C từ vị trí aa 112-270 chứa cấu trúc β-trefoil là vùng quyết định đặc tính cytokine ngoại bào của IL-33 Do vậy, cả IL-33 trưởng thành do sự phân cắt của caspase-1 và tiền IL-

33 đều có hoạt tính cytokine [41], [64] Vai trò như một cytokine tiền viêm ngoại bào của IL-33 đã được làm rõ trong nhiều nghiên cứu cho thấy IL-33 có vai trò quan trọng trong sinh lý cơ thể, cũng như trong nhiều dạng bệnh lý liên quan đến viêm và dị ứng do kích hoạt hệ thống cytokine của tế bào Th2

Tuy nhiên, chức năng nội bào của IL-33 là vấn đề mới được tìm hiểu trong thời gian gần đây IL-33 nội bào được cho là yếu tố trong nhân có vai trò điều hòa phiên mã vì nó có mang cấu trúc helix-turn-helix giúp IL-33 gắn vào DNA trong nhân tế bào Helix-turn-helix nằm ở đầu N của tiền IL-33 từ vị trí aa 1-65 và có tính bảo tồn cao giữa các loài Do vậy, cả đầu N và toàn bộ phân tử IL-33 đều có khả năng liên kết với DNA để ức chế phiên mã [11] Tuy nhiên, cơ chế ức chế phiên mã của IL-33 nội bào gần đây được chứng minh là do protein này tương tác với nhân tố phiên mã NFκB và ngăn không cho NFκB tương tác với trình tự đặc hiệu trên vùng promotor của các gene do NFκB điều hòa [4]

9

1.2.4 Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R

IL-33 tương tác với thụ thể đặc hiệu IL-33R và đồng thụ thể là IL-1RAcP biểu hiện trên bề mặt tế bào đích, tạo thành phức hợp khởi đầu sự truyền tín hiệu thông qua con đường NFκB và MAP kinase [2], [64] Vùng TIR (Tool Interleukin 1 Receptor) của IL-33R và IL-1RAcP thu hút protein MyD88 và qua đó huy động IRAK-4 và IRAK-1 (IL-1 Receptor Associated Kinase) vào phức hợp Trong phức hợp trên, IRAK-4 tự phosphoryl hóa trở nên hoạt động và hoạt hóa IRAK-1 IRAK-

1 được hoạt hóa sẽ tự phosphoryl hóa chính nó và tách ra khỏi phức hợp thụ thể

IL-33 Trước khi tách khỏi phức hợp protein, IRAK-1 tương tác với TRAF-6 (TNF Receptor Associated Factor 6) và phosphoryl hóa để hoạt hóa TRAF-6 Tới lượt mình, TRAF6 phosphoryl hóa và hoạt hóa TAK1 (TGF-β-activated kinase 1) trong phức hợp với hai protein TAB2 và TAB3 (TAK1 binding protein) TAK1 tiếp tục hoạt hóa các MAP kinase JNK và p38, từ đó dẫn đến sự hoạt động của một số yếu

tố phiên mã Đồng thời, TRAF-6 cũng tương tác với IκB để giải phóng NFκB khỏi trạng thái ức chế trong tế bào chất Các nhân tố phiên mã được hoạt hóa như MAP kinase JNK, p38 và NFκB di chuyển vào nhân để khởi động sự phiên mã của các gen biểu hiện một số cytokine tiền viêm [50]

10

Hình 1.2 Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R [50]

1.3 Đặc điểm sinh học của IL-33R

1.3.1 Cấu trúc của IL-33R

IL-33R là một glycoprotein xuyên màng thuộc họ IL-1R, do gen ST2 mã hóa IL-33 có tỷ lệ tương đồng với IL-1R1 là 28% và nếu xét riêng vùng nội bào thì tỷ lệ này là 38% IL-33R của chuột có kích thước 567 aa gồm ba vùng cấu trúc: vùng ngoại bào có 328 aa (1-328), vùng xuyên màng và cận màng có 38 aa (329-366) và vùng nội bào có 201 aa (367-567) Vùng ngoại bào hình thành ba cầu nối disulfide tại 6 gốc cysteine là các vị trí xảy ra tương tác với IL-33 và quyết định tính chất immunoglobulin của phân tử Đồng thời, vùng ngoại bào cũng chứa 9 vị trí asparagine có khả năng bị glycosyl hóa [77], [84] Cấu trúc không gian vùng ngoại bào của IL-33R gồm ba vùng immunoglobulin D1, D2 và D3 D1 và D2 liên kết chặt bằng cầu nối disulfide và tách biệt với D3 bằng một liên kết mở rộng với 8 gốc

aa Nhờ đặc điểm này mà D3 có thể xoay để giúp cố định IL-33 vào vùng lõm của

11

phức hợp D1-D2 [37] Vùng nội bào của IL-33R mang vùng TIR với cấu trúc 5 chuỗi xoắn α bao quanh 5 phiến β, vùng TIR này là cấu trúc quan trọng khởi đầu con đường truyền tín hiệu thông qua tương tác với vùng TIR trên đồng thụ thể IL-1RAcP và trên adaptor MyD88 [2], [81]

1.3.2 Tương tác của IL-33 với IL-33R

IL-33 tương tác với IL-33R ở vùng ngoại bào của IL-33R liên quan đến sự thay đổi hóa học và điện tích của các gốc aa Trên IL-33 hình thành hai vùng tương tác do sự thay đổi hóa học mạnh của các nhóm aa Vùng thứ nhất mang điện tích

âm, có sự tham gia của cấu trúc kẹp tóc β2-β3, các đoạn nối β10-β11 và β3-β4 Vùng thứ hai mang điện dương, được tạo thành bởi các gốc đầu N của β1 và β5, đoạn nối β8-β9 và đầu C của β12 Trên IL-33R, vùng D1-D2 tạo thành bề mặt lõm mang điện tích dương và vùng D3 có một phần kỵ nước mang điện tích âm Do vậy, IL-33 và IL-33R hình thành hai vùng tương tác đặc hiệu tương ứng, vùng thứ nhất của IL-33 với vùng D1-D2 của IL-33R và vùng thứ hai của IL-33 với vùng D3 của IL-33R [37]

Hình 1.3 Cấu trúc không gian vùng ngoại bào của IL-33R và tương tác giữa

IL-33R với IL-33 [37]

A Cấu trúc không gian của IL-33

B Cấu trúc không gian của vùng ngoại bào IL-33R

C Mô hình tương tác giữa IL-33 với vùng ngoại bào IL-33R

C

A

B

12

1.3.3 IL-33R dạng tự do

IL-33R dạng tự do (soluble IL-33R: sIL-33R) có cấu trúc giống hệt vùng ngoại bào của IL-33R sIL-33R và IL-33R cùng được mã hóa từ gen ST2 và hình thành do quá trình biến đổi sau phiên mã sIL-33R có kích thước 337 aa, có cả 3 vùng immunoglobulin và 9 vị trí asparagine có khả năng bị glycosyl hóa như vùng ngoại bào của IL-33R, thiếu vùng xuyên màng và nội bào [77], [84] sIL-33R tồn tại tự do trong môi trường ngoại bào và thực hiện vai trò ức chế con đường truyền tín hiệu của IL-33 bằng cách cạnh tranh với IL-33R trong tương tác với IL-33 [22]

Hình 1.4 sIL-33R (ST2) có cấu trúc tương đồng với vùng ngoại bào của IL-33R

(ST2L) và ngăn cản con đường truyền tín hiệu của IL-33 [36], [84]

1.4 Ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp tìềm năng điều trị các bệnh viêm – dị ứng

IL-33 tác động lên tế bào đích bằng cách gắn vào thụ thể của nó là IL-33R trên

bề mặt tế bào, sau đó huy động đồng thụ thể là IL-1RAcP để tạo thành phức hợp thụ thể truyền tín hiệu hoạt hóa tế bào đích [2] Hiện tại, phương thức ức chế hoạt động của IL-33 được tiếp cận phổ biến đó là ngăn chặn sự tương tác giữa IL-33 với IL-33R Để thực hiện điều này, kháng thể kháng IL-33R và kháng thể kháng IL-33

Hướng thứ hai là dùng kháng thể kháng IL-33 cũng mang lại nhiều kết quả khả quan Kháng thể kháng IL-33 làm giảm các triệu chứng hen suyễn dị ứng trên mô hình chuột vì làm giảm một số tác nhân như IgE trong huyết thanh, bạch cầu hạt ưa acid, lympho bào và các cytokine IL-4, IL-5 và IL-13 trong dịch nhầy phế quản [38] Như đã trình bày ở mục 1.3.3, ngoài dạng biểu hiện trên bề mặt tế bào thì IL-33R còn tồn tại ở dạng tự do (sIL-33R) sIL-33R có thể có vai trò tự nhiên là điều hòa

âm hoạt động của IL-33 bằng cách cạnh tranh với thụ thể trên bề mặt tế bào trong việc tương tác với IL-33 [22], [52] Dựa trên phát hiện này, sIL-33R nhân tạo đã được tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính ức chế IL-33 Kết quả cho thấy tiêm sIL-33R vào chuột bị cảm ứng hen suyễn làm ức chế con đường hoạt hóa Th2 của IL-33, làm giảm

sự tạo thành các cytokine như IL-4, IL-5, IL-13 trong máu và giảm triệu chứng bệnh hen suyễn dị ứng ở chuột [22] Ngoài ra, khi gây hen suyễn dị ứng trên chuột chuyển gen biểu hiện sIL-33R, lượng IL-4, IL-5 và bạch cầu hạt ưa acid được tạo ra thấp hơn

so với mô hình hen suyễn trên chuột hoang dại [51] Hơn nữa,xử lý sIL-33R:Fc còn làm giảm triệu chứng của bệnh viêm khớp trên mô hình chuột [53]

Các kết quả bước đầu nêu trên cho thấy ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp mới nhiều tiềm năng trong điều trị các bệnh hen suyễn, viêm thấp khớp Cho tới nay, các nghiên cứu phát triển các phân tử ức chế hoạt động của IL-33 đang được thực hiện ở giai đoạn đầu và còn nhiều vấn đề cần phải được làm rõ trước khi

có một dược phẩm kháng IL-33 được công nhận và đưa vào sử dụng lâm sàng Nhằm tiếp cận với hướng nghiên cứu trên, mục tiêu của đề tài là bước đầu tạo

ra và xác định hoạt tính protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 sử dụng hệ thống

14

biểu hiện tế bào HEK293 (Human Embryo Kidney) Bản chất của protein tái tổ hợp này là vùng ngoại bào của thụ thể IL-33 chuột có mang vùng Fc của IgG1 người ở đầu C Nếu được biểu hiện thành công protein này sẽ tồn tại ở dạng dimer gồm 2 phân tử liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide ở vùng Fc IgG1 Cấu trúc dimer này giúp msIL-33R:Fc hIgG1 tương tác tốt và bắt các phân tử IL-33 tự do ở dịch ngoại bào, từ đó hạn chế sự tác động của cytokine này lên tế bào đích thông qua thụ thể của nó trên bề mặt tế bào Kết quả là giảm sự sản xuất các cytokine gây viêm từ các tế bào đích của IL-33 như bạch cầu hạt ưa kiềm, bạch cầu hạt ưa acid, tương bào,

tế bào giết tự nhiên và lympho bào Th2 Bằng cách này, msIL-33R:Fc hIgG1 có thể làm giảm tác động có hại của IL-33 giúp cải thiện tình trạng các bệnh viêm tự miễn

và dị ứng Mô hình hoạt động của msIL-33R:Fc hIgG1 được tóm tắt ở Hình 1.5

Hình 1.5 Mô hình ức chế IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1

1.5 Sơ lược về các dược phẩm ức chế hoạt động cytokine dựa trên nguyên tắc tương tác cạnh tranh

Tới nay, đã có 5 loại biệt dược có bản chất là một vùng protein có hoạt tính gắn với vùng Fc IgG1 được sử dụng điều trị bệnh trên người Các biệt dược này

được trình bày ở Bảng 1.1

msIL-33R: Fc hIgG1

15

Bảng 1.1 Các biệt dược có bản chất là protein lai mang vùng Fc IgG1

TT Tên biệt dược –

T, ngăn không cho tế bào

T bị hoạt hóa do tiếp xúc với tế bào trình diện kháng nguyên (APC) biểu hiện LFA-3 trên bề mặt [32]

sIL1RAcP-Hội chứng tự viêm do nhiệt độ thấp có tính gia đình, hội chứng Muckle-Wells và bệnh viêm đa hệ thống khởi phát ở trẻ

sơ sinh

sIL1RAcP-sIL1R:Fc IgG1 bắt lấy IL-1β tự do, vốn được sản xuất quá mức ở các bệnh được đề cập, qua đó ngăn không cho cytokine này tác động lên tế bào đích nên hạn chế được tác động gây viêm của IL-1β [70]

Viêm thấp khớp, vảy nến và xơ cứng cột sống

sTNFR:Fc IgG1 bắt lấy TNF-α/β tự do, vốn được sản xuất quá mức ở các bệnh được đề cập, qua đó ngăn không cho cytokine này tác động lên tế bào đích nên hạn chế được tác động gây viêm của TNF-α/β [78]

Xuất huyết do thiếu tiểu cầu

TPO:Fc IgG1 tạo phức hợp với thụ thể TPO (thrombopoietin) trên màng tế bào

megakaryocyte ở tủy xương làm gia tăng lượng tiểu cầu lưu thông trong máu giúp cải thiện tình trạng xuất huyết [56]

Viêm thấp khớp ít đáp ứng với thuốc kháng TNF-α

sCTLA-4:Fc IgG1 gắn lên protein B7 trên tế bào APC ngăn không cho B7 tương tác với CD28 trên

tế bào T từ đó hạn chế sự hoạt hóa tế bào T bởi APC [14]

16

Cách tiếp cận được sử dụng để phát triển protein thụ thể IL-33 dạng tự do gắn vùng Fc IgG1 (sIL33R:Fc hIgG1) nhằm ức chế IL-33 của nghiên cứu này tương tự như cơ chế hoạt động ức chế IL-1β và TNF-α của biệt dược Arcalyst và Enbrel

1.6 Hệ thống tế bào động vật biểu hiện protein tái tổ hợp

Như đã trình bày, vùng ngoại bào của IL-33R có 3 cầu nối disulfide và 9 vị trí glycosyl hóa cùng với vùng Fc IgG1 sẽ tạo thành một protein có cấu trúc phức tạp và cần được biến đổi sau dịch mã Hiện nay có nhiều hệ thống biểu hiện protein được sử dụng phổ biến như vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào côn trùng và tế bào động vật hữu nhũ Mỗi hệ thống có ưu nhược điểm khác nhau về chất lượng sản phẩm protein tái tổ hợp, khả năng tăng qui mô trong sản xuất công nghiệp và giá thành [18] Trong

đó, hệ thống tế bào động vật có năng suất biểu hiện protein tái tổ hợp thấp nhất, với điều kiện nuôi cấy phức tạp và tốn kém nhất so với các hệ thống biểu hiện protein tái

tổ hợp khác Nhưng hệ thống này có ưu điểm là tạo ra protein tái tổ hợp có chất lượng cao nhất thích hợp sử dụng làm dược phẩm ở người Do đặc điểm này nên hệ thống tế bào động vật với bộ máy biến đổi sau dịch mã đầy đủ, là thích hợp nhất để biểu hiện sIL33R- Fc IgG1 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học Trong luận văn này dòng tế bào HEK293, tế bào được dùng phổ biến để tạo protein tái tổ hợp trong nghiên cứu công nghệ sinh học được sử dụng làm hệ thống biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG

Dòng tế bào người HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) được tạo ra từ sự biến nạp tế bào thận phôi người với DNA của adenovirus loại 5 [21] DNA 4,5 kb của adenovirus loại 5 tạo liên kết với bộ gen tế bào người ở vị trí gen PSG 4 (pregnancy-specific β-1-glycoprotein) trên nhiễm sắc thể số 19 (19q13.2) [40]

HEK293 có thể bị xâm nhiễm mạnh bởi adenovirus so với dòng tế bào HEK sơ cấp HEK293 có khả năng cảm ứng tạo khối u sau khi tiêm vào chuột 3-6 tuần với tỷ

lệ 90-100% [21] Có nhiều bằng chứng cho thấy tế bào HEK293 biểu hiện tính chất của tế bào biểu mô như có sự biểu hiện của các nhân tố đặc hiệu cho quá trình biệt hóa tế bào biểu mô giai đoạn sớm: vimentin, keratin 8 và keratin 18 Hơn nữa, sự biểu hiện của nhiều receptor tyrosine kinase trên bề mặt tế bào cho phép tế bào đáp

17

ứng với một số kích thích như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng biểu mô, insulin, yếu tố tăng trưởng giống insulin, ephrin [69] Ngoài ra, tế bào HEK293 thể hiện đặc tính của tế bào thần kinh rất rõ khi biểu hiện ba trong bốn nhân

tố đặc hiệu cho tế bào thần kinh là NF-M (Neuroflament- Medium subunit), NF-L (Neuroflament- Light subunit), α-internexin [69] hay biểu hiện tính chất của tế bào tạo máu [57] Trong tế bào HEK293, nhân tố tiền viêm IL-8 được sản xuất theo con đường NF-κB nhờ sự hoạt hóa TLR4 (Toll-like receptor 4) trên bề mặt tế bào [16], [42] hay nhờ sự cảm ứng của IL-33 thông qua thụ thể IL-33R và đồng thụ thể IL-1RAcP được biểu hiện nhân tạo trên bề mặt tế bào [1]

Hệ thống tế bào HEK293 đã được ứng dụng thành công trong phòng thí nghiệm và

cả quy mô sản xuất lớn với rất nhiều sản phẩm như các protein tiết, protein tái tổ hợp, protein màng, các vector virus như adenovirus, retrovirus và lentivirus, các kháng thể đơn dòng và vaccine ứng dụng trên người như interferon α, influenza; trong nghiên cứu đặc tính sinh lý và cơ chế điều hòa của nhiều phân tử bám dính, các cytokine và receptor Dòng tế bào HEK293 là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp được sử dụng rộng rãi, nhờ bộ máy sinh hóa có khả năng tiến hành các quá trình dịch mã và biến đổi sau dịch mã một cách chính xác để tạo protein trưởng thành có chức năng sinh học Ngoài ra,

tế bào HEK293 còn mang những thuộc tính quan trọng khác như phát triển nhanh, bảo quản dễ dàng, có thể biến nạp gen bằng nhiều phương pháp, hiệu suất biến nạp cao [76]

18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Plasmid

Plasmid Protein được

Pro18 – Phe567

3X FLAG ở đầu N

Signal pIgplus (Novagen)

GS Michael Martin – ĐH Giessen – Đức pmsIL1R

Fc IgG1 người ở đầu C

Signal pIgplus (Novagen)

GS Michael Martin – ĐH Giessen – Đức pmIL33-

Bio

Mat IL33

chuột & BirA

Ile266 _

Ser109-pET-Duet (Novagen)

GS Michael Martin – ĐH Giessen – Đức

Phương pháp

Hình 2.1 Sơ đồ của các plasmid được sử dụng trong đề tài

19

2.1.2 Hóa chất tạo dòng plasmid biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1

 Bộ kít tách chiết plasmid từ vi khuẩn (#27106, Qiagen)

 Bộ kít tinh sạch DNA từ sản phẩm PCR và gel agarose (#28106, Qiagen)

 Các enzyme cắt giới hạn: NotI, AvrII, HindIII và buffer phản ứng (New England Biolabs)

 Phản ứng nối: Buffer DNA T4 ligase 10x, DNA T4 ligase (#M0202S, New England Biolabs)

 Phản ứng PCR: Pfu polymerase, Pfu buffer + MgSO4 10x, dNTP (Fermentas)

 Điện di DNA: Agarose (Bio-Rad), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck), thang DNA (GeneRuler 1kb plus, Fermentas)

2.1.3 Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn E.coli

 Chủng E.coli DH5α

 Môi trường LB: 1% trypton (Bio-Rad), 0,5% yeast extract (Bio-Rad), 1% NaCl, nước cất; pH7, hấp vô trùng

 Môi trường LB agar: 1,5% bacto- agar (Bio-Rad) trong môi trường LB

 Ampicillin (Mekophar) 1000x: 50mg/ml ampicillin trong nước, lọc vô trùng

2.1.4 Hóa chất nuôi cấy tế bào HEK293 và EL-4

 Tế bào HEK293 do Đại học Korea – Seoul – Hàn Quốc cung cấp

 Tế bào EL-4 được cung cấp bởi ATCC – Mỹ

 Môi trường nuôi cấy tế bào HEK293: DMEM (#G0001-3010- PAA) bổ sung 10% FCS (#A15-151, PAA), 3,7g/l NaHCO3 và 1x penicillin/streptomycin (#P11-010, PAA)

 Môi trường nuôi cấy tế bào EL-4: RPMI1640 (#G0029-3010, PAA) bổ sung 5% FCS, 2g/l NaHCO3 và 1x penicillin/streptomycin

 Trypsin EDTA (#L11-003, PAA)

 PBS: 8g/l NaCl; 0,2g/l KCl; 1,44g/l Na2HPO4; 0,24g/l KH2PO4; pH 7,4; hấp

vô trùng

20

2.1.5 Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào E.coli và HEK293

 E.coli: glycerol 10%, CaCl2 1M trong nước cất, hấp vô trùng

 HEK293: Polyethylenimine (PEI) (#40,872-7, Aldrich) 1mg/ml trong nước,

 Dung dịch Bradford: Bio-Rad protein assay (#500-0006, Bio-Rad)

 BSA (#500-0007, Bio-Rad)

 Hóa chất thủy phân nhóm đường: buffer biến tính glycoprotein 10X, buffer phản ứng G7 10X, NP-40 10% và PNGase F (#P0704, New England Biolabs),

2.1.7 Hóa chất dùng cho SDS-PAGE, Western Blot và đồng kết tủa miễn dịch

 Protein A-sepharose (GE Healthcare) bắt đặc hiệu vùng Fc của IgG1 người

 Anti FLAG bead (Sigma) bắt đặc hiệu vùng FLAG trên FL-mIL33R

 Gel SDS-PAGE mini (7x9cm): Tris HCl (Merck), SDS (Promega),

polyacrylamide và bis polyacrylamide (Merck), TEMED (Merck), APS (Merck)

Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide dùng trong SDS-PAGE

- 0,55ml 1,37ml 8µl 8µl

1,74ml 1,38ml

- 0,55ml 1,83ml 8µl 8µl

1,28ml 1,38ml

- 0,55ml 2,29ml 8µl 8µl

0,82ml 1,38ml

- 0,55ml 2,75ml 8µl 8µl

1,22ml

- 0,25ml 0,2ml 0,33ml 5µl 5µl

 Laemmli buffer 3X: 5,2ml Tris 1M pH 6,8; 6g SDS; 11,9ml glycerol, 15ml Mercaptoethanol, 24mg bromphenol blue, nước cất đủ 100ml

 TBS/T: 20mM Tris, 137mM NaCl - pH 7,6 , 0,1% Tween-20 (Merck)

 Thang protein: prestained protein ladder (#SM0671– Fermentas), unstained protein ladder (#SM0661– Fermentas)

 Màng nitrocellulose (#162-0115, Bio-Rad)

 Chất hiện màu DAB (#D5905, Sigma)

 Streptavidin – HRP (RPN.1231)

Bảng 2.2 Các kháng thể được sử dụng trong thí nghiệm Western Blot

 Kit ELISA mIL-2 của BD biosciences (#555148)

 Dung dịch đệm phủ giếng sodium carbonate 0,1M: 8,4g NaHCO3, 3,56g

Na2CO3/lít H2O, pH 9,5

 Dung dịch rửa giếng: 0,05% tween 20 trong PBS

 Dung dịch khóa giếng: 10% fetal bovine serum (FBS) trong PBS

 Dung dịch đệm cơ chất ELISA: 0,1M sodium acetat, 0,1M citric acid - pH 4,9

 Dung dịch cơ chất ELISA: 9ml dung dịch đệm cơ chất + 1ml TMB (1mg/ml trong DMSO) + 15l H2O2 3%

 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) (#T2885, Sigma)

 Dung dịch ngừng phản ứng: H2SO4 1M

22

2.2 Phương pháp

2.2.1 Tạo plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1

2.2.1.1 Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho sIL-33R của chuột

Đoạn gen mã hóa sIL33R (Pro18 – Arg332) của chuột được khuếch đại bằng phản ứng PCR dựa trên khuôn mẫu là plasmid pFL-mIL-33R với mồi xuôi mIL33R-P18s-HindIII (5’ GCGGAAGCTTCCCATGTATTTGACAG TTACGGAG-3’) và mồi ngược mIL33R-R332as-NotI (5’-AAAGCGGCCG CTCGGTGATCAATTGGTTGTTTC-3’)

72o 10 phút Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

23

2.2.1.2 Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose

10µl sản phẩm PCR được hòa với 1µl dung dịch nạp mẫu 10X (5mM Tris-HCl - pH 8, 0,0025% Bromphenolblue, 0,0025% Xylen Cyanol, 5% Glycerol) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong buffer TAE 0,5X (20mM Tris, 0,5mM EDTA, 10mM acetic acid) với hiệu điện thế 100V trong

30 phút Gel được nhuộm với ethidium bromide (0,05%) trong 15 phút và đọc kết quả bằng thiết bị Geldoc (Bio-Rad)

2.2.1.3 Tinh sạch DNA

Trước khi thực hiện bước tiếp theo, DNA được tinh sạch từ phản ứng PCR hoặc từ gel agarose bằng bộ kit của hãng Qiagen

Quy trình tinh sạch DNA từ sản phẩm PCR:

 Cộng 5 lần thể tích PBI vào 1 thể tích mẫu PCR và trộn đều

 Cho hỗn hợp trên vào cột tinh sạch

 Ly tâm cột với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch sau ly tâm

 Rửa cột bằng 750 µl PE và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch sau ly tâm

 Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô cột và chuyển cột sang eppendorf 1,5ml mới

 Cho 30-50 µl EB hoặc nước vô trùng vào giữa màng trong cột và giữ yên trong 1 phút

 Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút và thu nhận dịch sau ly tâm trong eppendorf

Quy trình tinh sạch DNA từ gel agarose:

 Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mục tiêu

 Cho gel vào eppendorf và cân Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG vào mẫu gel (~300 µl QG cho 100mg gel)

 Ủ hỗn hợp ở 50oC trong 10 phút để gel tan hoàn toàn

 Thêm 1 lần thể tích isopropanol vào hỗn hợp và trộn đều

24

 Cho hỗn hợp trên vào cột tinh sạch

 Ly tâm cột với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch sau ly tâm

 Rửa cột bằng 750 µl PE, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch sau ly tâm

 Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô cột và chuyển cột sang eppendorf 1,5ml mới

 Cho 30-50 µl EB hoặc nước vô trùng vào giữa màng trong cột và giữ yên trong 1 phút

 Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút và thu nhận dịch sau ly tâm trong eppendorf

2.2.1.4 Cắt hạn chế DNA bằng NotI và HindIII:

Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa msIL-33R (Pro18 – Arg332) sau khi tinh sạch và plasmid pmsIL1RAcP-Fc được cắt bằng hai enzyme cắt

hạn chế NotI và HindIII để tạo nguyên liệu cho phản ứng nối tiếp theo

Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR msIL-33R và plasmid pmsIL1RAcP-Fc:

Thành phần

Phản ứng cắt hạn chế

(V=50 µl)

25

2.2.1.5 Phản ứng nối DNA bằng ligase

Sản phẩm cắt của đoạn gen msIL-33R sau khi tinh sạch được chèn vào Sản phẩm cắt của đoạn gen msIL-33R sau khi tinh sạch được chèn vào plasmid pmsIL1RAcP-Fc (đã được cắt bỏ vùng sIL1RAcP) ở vị trí ngay trước đoạn gen Fc IgG1 để tạo plasmid tái tổ hợp mã hóa protein lai msIL-33R:Fc hIgG1

Thành phần phản ứng nối giữa sản phẩm PCR msIL-33R và plasmid pmsIL1RAcP-Fc đã cắt bằng hai enzyme cắt hạn chế HindIII và NotI:

Phản ứng nối được tiến hành ở 22oC trong 2 giờ Sản phẩm nối được

hóa biến nạp vào E.coli DH5α

2.2.1.6 Biến nạp plasmid vào E.coli DH5α khả nạp

Một trong những phương pháp đơn giản và hiệu quả để chuyển

plasmid vào tế bào E.coli là sốc nhiệt Quá trình tạo tế bào E coli khả nạp

làm cho cấu trúc màng của tế bào bị yếu đi, nên khi bị sốc nhiệt sẽ hình thành những lỗ nhỏ trên màng tế bào tạo điều kiện cho các phân tử DNA đã kết dính trên màng đi vào bên trong tế bào chất một cách dễ dàng

Các bước được tiến hành để chuyển plasmid vào tế bào E.coli DH5α:

 Trộn đều, nhẹ nhàng 5 µl sản phẩm phản ứng nối (Mục 2.2.1.5) vào 100 μl

tế bào E coli khả nạp Giữ trong đá 10 phút

 Chuyển eppendorf chứa dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 42oC trong 45 giây

 Chuyển nhanh eppendorf chứa dịch tế bào trên vào lại bể đá trong 1 – 2 phút

26

 Thêm vào eppendorf 900 μl môi trường LB Lắc vi khuẩn ở 37oC trong 1 giờ

 Ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút Hút bỏ 700 μl dịch nổi, huyền phù phần còn lại và hút 100 μl trải trên môi trường đĩa LB có chứa ampicillin nồng độ 50μg/ml

Ủ ở 37oC qua đêm, các tế bào E.coli mang plasmid sẽ mọc được trên

môi trường chọn lọc

2.2.1.7 Tách chiết plasmid từ E.coli

Plasmid được tách chiết từ E coli bằng bộ kit Miniprep của hãng

Qiagen theo quy trình của nhà sản xuất, tóm tắt như sau:

 Tăng sinh một khuẩn lạc đơn E.coli trong 5ml môi trường LB có bổ sung

ampicillin với nồng độ 50µg/ml ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC trong 16 giờ

 Thu sinh khối bằng cách ly tâm 8000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng

 Huyền phù sinh khối trong 250 µl buffer P1

 Thêm 250 µl buffer P2 và đảo ngược khoảng 4-6 lần

 Thêm 350 µl buffer N3 và đảo ngược khoảng 4-6 lần

 Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, chuyển toàn bộ dịch nổi vào cột

 Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch sau ly tâm

 Rửa cột bằng 750 µl buffer PE, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch sau ly tâm

 Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô cột và chuyển cột sang eppendorf 1,5ml mới

 Cho 30-50 µl EB hoặc nước vô trùng vào giữa màng trong cột và giữ yên trong 1 phút

 Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút và thu nhận dịch sau ly tâm trong eppendorf

27

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

2.2.2.1 Nuôi cấy E.coli DH5α

E coli DH5α mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB hoặc

LB agar có bổ sung ampicillin để duy trì plasmid Môi trường lỏng được ủ ở

37oC và lắc với tốc độ 250 vòng/phút qua đêm Đĩa môi trường agar được ủ ở

37oC qua đêm

2.2.2.2 Bảo quản E.coli DH5α mang plasmid

750µl canh trường vi khuẩn nuôi cấy qua đêm được trộn với 750µl glycerol 86% vô trùng và bảo quản lạnh ở -80oC

2.2.2.3 Tạo tế bào khả nạp E coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp

Tế bào E coli có khả năng hấp thụ DNA ngoại bào ở giai đoạn pha log

Bề mặt tế bào mang điện tích âm do có sự hiện diện của các phân tử phospholipids và lipopolysaccharides Ở điều kiện thường, các phân tử DNA mang điện tích âm rất khó liên kết với bề mặt tế bào, nhưng khi tế bào được

xử lý với Ca2+ thì các phân tử DNA ngoại bào sẽ dễ dàng dính vào bề mặt tế bào qua trung gian Ca2+ Từ đó, các phân tử DNA có thể được hấp thụ vào trong tế bào chất nhờ cơ chế sốc nhiệt hay thực bào

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp:

 Cấy 1 khuẩn lạc E coli DH5α vào 5ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy qua

đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC

 Cấy chuyền 1ml dịch nuôi cấy vào 100ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy lắc

250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,3-0,4

 Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50ml lạnh và ủ trong đá 5 – 10 phút

Các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh

 Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 2500 vòng/phút, 7 phút, 4oC Bỏ dịch nổi

 Huyền phù sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh Ly tâm

2500 vòng/phút, 5 phút, 4oC Bỏ dịch nổi

 Chia lượng nhỏ 100 μl vào eppendorf 1,5ml và trữ ở -80oC

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào HEK293

Tế bào HEK293 được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS: fetal calf serum), penicillin/streptomycin và ủ trong

tủ ấm ở 37oC với 10% CO2 Tế bào được cấy vào bình nuôi tế bào 75 cm2 chứa 20ml môi trường ở mật độ 2x106 /bình và được cấy truyền sau 3-4 ngày nuôi cấy

Để cấy truyền, tế bào được rửa 2 lần với PBS vô trùng và xử lý với 2ml dung dịch trypsin/EDTA 1x trong 2-5 phút ở 37oC 8ml môi trường nuôi cấy có huyết thanh được bổ sung vào bình để ngưng hạt động của trypsin Tế bào được huyền phù bằng pipet 20µl dịch huyền phù được nhuộm bằng 20µl trypan blue 0,4% Tế bào sống bắt màu xanh sẽ được đếm bằng buồng đếm hồng cầu 2x106

tế bào được cấy vào bình nuôi cấy mới

Để bảo quản tế bào, dịch huyền phù tế bào được ly tâm 500xg trong 5 phút để loại bỏ môi trường Cặn tế bào được huyền phù ở mật độ 2x106/ml trong FCS bổ sung 10% DMSO 1ml (2x106 tế bào) dịch bảo quản tế bào được cho vào tuýp bảo quản và được đông lạnh chậm ở -80oC qua đêm và sau đó được chuyển vào bảo quản ở bình nitơ lỏng

Để giải đông tế bào, tuýp tế bào từ nitơ lỏng được giải đông lập tức ở

37oC Dịch bảo quản tế bào được hòa vào 9ml môi trường nuôi cấy có FCS và ly tâm ở 500xg trong 5 phút để loại bỏ dịch nổi Cặn tế bào được huyền phù vào 20ml môi trường và nuôi cấy như mô tả ở trên

29

2.2.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào EL-4

Tế bào EL-4 được nuôi cấy trong môi trường RPMI1640 bổ sung 5% FCS, penicillin/streptomycin và ủ trong tủ ấm ở 37oC với 5% CO2 Tế bào được cấy vào bình nuôi tế bào 25 cm2 chứa 10ml môi trường ở mật độ 5x104 /ml và được cấy truyền sau 3-4 ngày nuôi cấy

Để cấy truyền, dùng pipet trộn đều dịch tế bào, sau đó lấy 20µl để đếm nồng độ như đã thực hiện ở tế bào HEK293 Chuyển lượng dịch tế bào tương đương 5x104 tế bào/ml vào bình nuôi cấy mới

Thao tác bảo quản và giải đông tế bào EL-4 được thực hiện tương tự như thực hiện ở tế bào HEK293

2.2.5 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào HEK293

Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào dùng polyethylenimine (PEI) được áp dụng trong nghiên cứu này [2]

PEI đóng gói phân tử DNA tạo thành các hạt mang điện tích dương, các hạt này liên kết với các gốc mang điện tích âm trên bề mặt tế bào và được đưa vào tế bào thông qua cơ chế nhập nội bào Các bóng màng chứa phức hợp PEI-DNA bị phá vỡ do tác động của áp suất thẩm thấu hoặc lysosome giải phóng DNA tự do vào tế bào chất và sau đó DNA được khuếch tán vào nhân

Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào:

 Chuẩn bị đĩa petri (100mm) đã nuôi cấy 3,6x106 tế bào trong 10ml môi trường trước đó 1 ngày

 Chuẩn bị 360 µl hỗn hợp gồm 6µg plasmid mã hóa cho protein cần biểu hiện, 12µl PEI 1mg/ml và môi trường DMEM Hút bỏ 7ml môi trường trong đĩa tế bào trên và chuyển 360µl hỗn hợp vào đĩa

 Ủ đĩa trong tủ CO2 ở 37oC, 10% CO2 trong 4 giờ Sau đó, bổ sung 7ml môi trường nuôi cấy tế bào vào đĩa và ủ lại trong tủ CO2

30

2.2.6 Phương pháp phân giải tế bào

Tế bào HEK293 nhận plasmid biểu hiện protein FLAG-mIL33R được phân giải như sau:

 Tế bào trong đĩa 100mm được rửa 2 lần bằng PBS lạnh

 1ml dung dịch li giải tế bào (Mục 2.1.6) được cho vào đĩa và tế bào được

thu nhận bằng tác động cơ học và cho vào 1 eppendorf

 Dịch tế bào được ủ 1 giờ trên đá để phân giải hoàn toàn

 Ly tâm dịch phân giải tế bào ở tốc độ 13000 vòng/phút, 4oC trong 10 phút thu dịch nổi

2.2.7 Phương pháp Bradford định lượng protein

Bradford là phương pháp định lượng protein dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm coomassie brilliant blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch có tính acid, khi chưa liên kết với protein thì thuốc nhuộm

có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại là 595 nm Do đó, độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên

hệ trực tiếp tới nồng độ protein

Phương pháp Bradford được thực hiện trong đĩa 96 giếng với các bước như sau:

 Dựng đường chuẩn với BSA (bovine serum albumin) dãy nồng độ : 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200µg/ml Tổng thể tích mẫu trong mỗi giếng là

100 µl, lặp lại hai dãy đường chuẩn

 Cho vào mỗi giếng 100 µl các mẫu cần đo nồng độ protein, mỗi mẫu lặp lại hai lần Có thể pha loãng mẫu bằng nước để nồng độ nằm trong đường chuẩn

 Pha thuốc nhuộm Bradford với tỷ lệ thể tích H2O:Bradford reagent là 3:2

 Cho 100 µl thuốc nhuộm trên vào mỗi giếng đã được chuẩn bị mẫu sẵn

Kết quả được đọc bằng máy Elisa ở bước sóng 595nm