Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn campylobacter gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột ở trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố hồ chí minh từ năm 2009 đến năm 2010

Bên cạnh tình hình nhiễm Campylobacter ngày càng gia tăng ở cả các nước phát triển và đang phát triển thì tỉ lệ các chủng kháng thuốc cũng không ngừng tăng lên đặc biệt là với fluoroqu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

–R—

TRẦN THỊ NGỌC DUNG

TÌM HIỂU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CAMPYLOBACTER

SPP GÂY BỆNH NHIỄM TRÙNG DẠ DẦY RUỘT Ở TRẺ EM DƯỚI 5 TUỔI Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TỪ NĂM 2009 ĐẾN NĂM 2010

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS STEPHEN BAKER

TP HỒ CHÍ MINH – 2010

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử phát hiện Campylobacter 3

1.2 Tình hình nhiễm Campylobacter trên thế giới và Việt Nam 4

1.2.1 Tình hình nhiễm Campylobacter trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình nhiễm Campylobacter ở Việt nam 6

1.3 Các nguồn chứa và các con đường lan truyền Campylobacter 8

1.3.1 Người 8

1.3.2 Động vật 8

1.3.3 Thực phẩm 9

1.3.4 Các nguồn khác 9

1.4 Hình thái, cấu trúc và một số đặc điểm sinh hóa 10

1.5 Phân loại 11

1.6 Đặc điểm gây bệnh 12

1.6.1 Campylobacteriosis 12

1.6.2 Các biểu hiện lâm sàng 13

1.7 Chẩn đoán và điều trị 16

1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 16

1.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 16

1.7.3 Điều trị 17

1.8Tình hình kháng các loại thuốc dùng để chữa bệnh nhiễm Campylobacter 18

1.8.1 Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter ở thế giới 18

1.8.2 Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter ở Việt Nam 19

1.9 Kháng sinh Fluoroquinolone 20

1.9.1 Lịch sử ra đời và những thay đổi về cấu trúc của các kháng sinh

họ quinolones 20

1.9.2 Phân loại 22

1.9.3 Cơ chế hoạt động 23

1.9.4 Cơ chế kháng quinolone 23

1.10 Các phương pháp phân loại Campylobacter 27

1.11 Phương pháp Multilocus sequence typing – MLST 30

1.11.1 Phương pháp MLST cho Campylobacter 30

1.11.2 Ưu điểm và khuyết điểm của phương pháp MLST so với các phương pháp genotyping khác 32

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 VẬT LIỆU 33

2.1.1 Bộ sưu tập chủng 33

2.1.2 Thiết bị 34

2.1.3 Hóa chất 34

2.1.4 Môi trường 36

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Phân lập và định danh Campylobacter 38

2.2.2 Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tổi thiểu (MIC) của Campylobacter với một số kháng sinh 42

2.2.3 Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn 44

2.2.4 Xác định ở mức độ loài, phân biệt Campylobacter jejuni và Campylobacter coli 45

2.2.5 Xác định những đột biến trên gen gyrA và đột biến kết hợp với bơm CmeABC 48

3 KẾT QUẢ 58

3.1 Đặc điểm lâm sàng của 64 chủng Campylobacter phân lập từ trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh 58

3.2 Kết quả phân biệt C jejuni và C coli bằng PCR của 40 chủng nghiên cứu 59

3.2.1 Kết quả khuếch đại khi sử dụng mồi chuyên biệt cho C jejuni và

C coli 59

3.2.2 So sánh kết quả phân biệt C jejuni và C coli giữa phương pháp vi sinh truyền thống và phương pháp PCR 61

3.3 Kết quả kháng sinh đồ của 40 chủng Campylobacter 61

3.4 Kết quả điều trị kháng sinh các bệnh nhân nhiễm Campylobacter 63

3.5 Cơ chế kháng fluoroquinolone 64

3.5.1 Kết quả khuếch đại vùng kháng quinolone của gen gyrA 64

3.5.2 Kết quả xác định trình tự vùng kháng quinolone của gen gyrA 65

3.5.3 Mức độ phổ biến của đột biến gyrA 67

3.5.4 Kết quả khuếch đại vùng gắn với cmeR trên promoter của operon cmeABC 67

3.5.5 Xác định trình tự vùng giữa cmeR và cmeABC và phân tích trình tự vùng lặp lại 68

3.6 So sánh kết quả kiểu gen của gen gyrA và bơm đẩy thuốc CmeABC với dữ liệu vi sinh 70

3.6.1 So sánh kết quả kiểu gen của gen gyrA với dữ liệu vi sinh 70

3.6.2 Khảo sát tương quan MIC đối với kháng sinh họ FQ giữa chủng đột biến và chủng không đột biến ở vùng trình tự 16 bp của bơm CmeABC 72

3.7 Kết quả MLST 76

3.7.1 Kết quả khuếch đại các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà 76

3.7.2 Kết quả phân tích dữ liệu MLST 77

4 BIỆN LUẬN 87

4.1 Đặc điểm lâm sàng của các chủng Campylobacter phân lập ở trẻ em ở thành phố Hồ Chí Minh 87

4.2 Đặc điểm kháng kháng sinh ở Campylobacter phân lập trên trẻ em dưới 5 tuổi ở Tp Hồ Chí Minh hiện nay 89

4.2.1 Đặc điểm kháng một số kháng sinh dùng để chữa bệnh nhiễm Campylobacter 90

4.2.2 Đặc điểm kháng fluoroquinolone ở Campylobacter phân lập trên

trẻ em dưới 5 tuổi ở Tp Hồ Chí Minh hiện nay 90

4.3 Đặc điểm kiểu gen và cơ chế phân tử của sự kháng fluoroquinolone 92

4.4 Đặc điểm di truyền quần thể Campylobacter phân lập ở thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp MLST 94

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 98

5.1 KẾT LUẬN 98

5.2 KIẾN NGHỊ 98

MỞ ĐẦU

Campylobacter là một trong những tác nhân vi khuẩn hàng đầu gây bệnh

tiêu chảy trên thế giới Ở những nước đang phát triển, đối tượng chủ yếu bị

nhiễm Campylobacter là trẻ em dưới 5 tuổi Bên cạnh tình hình nhiễm

Campylobacter ngày càng gia tăng ở cả các nước phát triển và đang phát triển

thì tỉ lệ các chủng kháng thuốc cũng không ngừng tăng lên đặc biệt là với fluoroquinolone (FQ), họ kháng sinh thường được dùng để điều trị tiêu chảy do

nhiễm Campylobacter [64]

Ở Việt Nam, Campylobacter đang là một trong những tác nhân vi khuẩn

chính gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi tại thành phố Hồ Chí Minh Vi khuẩn này chiếm 17,63% trên tổng số 363 trường hợp do tác nhân vi khuẩn trong

1420 bệnh nhi tiêu chảy từ 06/2009 – 05/2010 (số liệu chưa công bố của Đơn

Vị Nghiên Cứu Lâm Sàng Đại Học Oxford – OUCRU) Trong khi đó, hầu hết

các nghiên cứu Campylobacter ở Việt Nam đều dừng lại ở miêu tả sự nhiễm và tình hình kháng kháng sinh ở Campylobacter phân lập trên thịt gà Cho đến nay

chỉ mới có một nghiên cứu duy nhất của DW Isenbarger [45] cho thấy tỉ lệ

Campylobacter phân lập từ trẻ em dưới 5 tuổi ở Việt Nam kháng với nalidixic

acid và ciprofloxacin là 7%

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tìm hiểu một số

đặc điểm của vi khuẩn Campylobacter gây bệnh nhiễm trùng dạ dày-ruột ở

trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh từ năm 2009 đến năm 2010”

với mục tiêu, ý nghĩa và nội dung như sau:

Ø Mục tiêu: Khảo sát đặc điểm lâm sàng của các bệnh nhi nhiễm

Campylobacter ở thành phố Hồ Chí Minh, tìm hiểu tình hình kháng kháng sinh

ở các chủng Campylobacter phân lập được, đặc biệt là sự kháng

fluoroquinolone, từ đó nghiên cứu cơ chế kháng fluoroquinolone, cuối cùng

xác định kiểu di truyền của các chủng Campylobacter

Ø Ý nghĩa: Cung cấp những kiến thức cơ bản về Campylobacter phân lập

ở Việt Nam để mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo Bên cạnh đó chúng tôi

hi vọng nghiên cứu này sẽ hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị kháng sinh

bệnh viêm dạ dày-ruột do Campylobacter ở Việt Nam hiện nay

Ø Nội dung:

- Phân lập và định danh Campylobacter từ các mẫu phân của trẻ em dưới

5 tuổi bị tiêu chảy

- Xác định kháng sinh đồ và nồng độ ức chế tối thiểu của một số kháng

sinh

- Tìm hiểu cơ chế phân tử của sự kháng fluoroquinolone

- Phân loại di truyền Campylobacter phân lập được bằng phương pháp Multilocus sequence typing (MLST)

1 TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát hiện Campylobacter

Campylobacter được miêu tả lần đầu tiên vào năm 1886 bởi Theodor

Escherich Vào thời gian đó, Escherich đã miêu tả một loại vi khuẩn hình que

có trong ruột kết của các trẻ em chết bởi căn bệnh “cholera infantum” [26]

Năm 1909, hai nhà bác sĩ thú y là McFadyean và Stockman đã miêu tả

sự kết hợp của một vi sinh vật chưa biết với bệnh dịch sảy thai ở cừu cái, vi khuẩn này giống với một phẩy khuẩn – vibrio [69] Và vào năm 1919, trong khi điều tra những trường hợp sảy thai truyền nhiễm ở bò ở Mỹ, Smith đã phân lập được một vi khuẩn và ông miêu tả đó là một xoắn khuẩn – spirillum [93] Sau

đó Smith cho rằng mình và nhóm McFadyean và Stockman đang nghiên cứu cùng một vi khuẩn Và cùng với Taylor, Smith đã khẳng định được điều này và

đề xuất tên của vi khuẩn đó là ‘Vibirio fetus’

Cho đến tháng 5 năm 1938, một sự kiện lớn đã xảy ra ở Illinos (Mỹ), bây giờ nó được xem là một trường hợp có đầy đủ tài liệu dẫn chứng đầu tiên

về sự nhiễm Campylobacter ở người Sự kiện này liên quan đến trận dịch tiêu chảy do sữa nhiễm Campylobacter, ảnh hưởng đến 355 người [58] Sau đó vào năm 1947, Vinzent đã phân lập được V fetus từ máu của ba người phụ nữ

mang thai nhập viện vì sốt mà không rõ nguyên nhân Bệnh kéo dài trong 4 tuần và hai trong ba người phụ nữ này bị sảy thai Vào năm 1957, Elizabeth King đã miêu tả một phẩy khuẩn với rất nhiều đặc điểm chung với các tác nhân được miêu tả bởi Vinzent nhưng khác về đặc đểm sinh hóa và tính kháng

nguyên [54] Mãi đến năm 1963 thì giống Campylobacter (nghĩa là “vi khuẩn

hình que có dạng cong”) được đề xuất bởi Sebald và Veron khi nhận ra rằng vi

sinh vật này không sử dụng đường và có hàm lượng G+C khác với Vibrio spp

Tuy nhiên vì chưa có phương pháp nuôi cấy, phân lập Campylobacter thích hợp cho nên có rất ít trường hợp nhiễm Campylobacter trên người được báo cáo Mãi cho đến năm 1972, phương pháp phân lập các loài Campylobacter

chịu nhiệt mới được phát triển bởi Dekeyser và Butzler [22] Phương pháp này

liên quan đến việc lọc các mẫu phân qua màng lọc 0,64 µm và dịch lọc được đem nuôi cấy Phương pháp này khá tốn công và mất thời gian do đó vào năm

1977, Martin Skirrow từ phòng thí nghiệm sức khỏe cộng đồng Worcester, đã miêu tả một kĩ thuật trực tiếp và đơn giản hơn đó là nuôi cấy trực tiếp mẫu phân lên đĩa môi trường thạch máu có chứa vancomycin, polymyxin, trimethoprim [91] Các đĩa sau đó được ủ ở 42oC trong môi trường vi hiếu khí chứa 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Từ đó trở đi có rất nhiều sự thay đổi về phương pháp, điều này đã cho phép các phòng thí nghiệm vi sinh chẩn đoán

lâm sàng có thể phân lập Campylobacter từ các mẫu phân bệnh nhân.

Các phương pháp phân lập được cải tiến dẫn đến sự ra đời của những báo

cáo đầu tiên về tình thường xuyên của Campylobacter gây bệnh ở người, từ đó dẫn đến một loạt các nghiên cứu về dịch tễ của Campylobacter và nhận ra rằng hiện nay Campylobacter đang là một vấn đề báo động cho sức khỏe cộng đồng

ở cả các nước phát triển và đang phát triển

1.2 Tỉ lệ nhiễm Campylobacter trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nhiễm Campylobacter trên thế giới

Ở cả các nước phát triển [75] và đang phát triển [16], Campylobacter

đang là một trong những tác nhân vi khuẩn phổ biến nhất gây tiêu chảy

v Ở các nước phát triển

Ở các nước phát triển, Campylobacter là nguyên nhân gây bệnh viêm dạ dày-ruột (Campylobacteriosis) nhưng thường ít gây nên các trận dịch lớn Trẻ

em dưới 1 tuổi và người trưởng thành từ 20-29 tuổi là hai nhóm tuổi chiếm tỉ lệ

nhiễm Campylobacter cao nhất ở những nước phát triển [75] Các trận dịch tiêu chảy do Campylobacter thường xảy ra vào mùa hè và mùa thu ở những nước

này [16]

Hằng năm số trường hợp nhiễm Campylobacter có khuynh huớng giảm ở

những quốc gia có cải thiện trong các qui trình công nghiệp chế biến thịt gia cầm

Ở Mỹ tỉ lệ mắc bệnh ước tính là 880 khai báo/100.000 dân, đại diện cho

2,4 tỉ trường hợp nhiễm Campylobacter xảy ra mỗi năm [29] Tuy nhiên từ năm 1996-2004, theo CDC thì các trường hợp nhiễm Campylobacter có khuynh

hướng giảm xuống (giảm 28%) [15] Và từ năm 2005-2008 thì tỉ lệ nhiễm

Campylobacter ước tính là không thay đổi đáng kể[108]

Ở các nước thuộc liên minh Châu Âu (gồm 25 thành viên), có 183.961

trường hợp nhiễm Campylobacter được báo cáo vào năm 2004 với tỉ lệ nhiễm

là 47,6/100.000 dân Và đến năm 2007 thì có tới 200.507 trường hợp được báo cáo với tỉ lệ nhiễm là 45/100.000 dân Tỉ lệ nhiễm này thay đổi theo độ tuổi, trẻ

em dưới 5 tuổi thì nhạy cảm cao với bệnh Campylobacteriosis (120 trường

hợp/100.000 người) trong khi các độ tuổi khác thì thay đổi giữa 32 và 53 trường hợp trên 100.000 người Hầu hết các nước thành viên đều được báo cáo

là tăng tỉ lệ nhiễm Campylobacter vào năm 2007, đặc biệt là nước Đức tăng

56%[95]

v Ở các nước đang phát triển [16]

Ở các nước nhiệt đới đang phát triển, bệnh do Campylobacter không

phải là vấn đề nghiêm trọng ở người lớn nhưng lại là bệnh dịch của trẻ em, đặc

biệt là trẻ nhỏ hơn hai tuổi [5] Tuy nhiên, tình trạng nhiễm Campylobacter

không triệu chứng bệnh xảy ra phổ biến ở cả người lớn và trẻ em [5], [16]

Bệnh viêm dạ dày-ruột do Campylobacter ở các nước đang phát triển không xảy ra theo mùa, tỉ lệ nhiễm Campylobacter không có sự khác biệt đáng kể

giữa các mùa trong năm

Nói chung ở các nước đang phát triển vì không có các chương trình điều

tra quốc gia về Campylobacteriosis nên không có các số liệu về tỉ lệ nhiễm

bệnh ở dạng số trường hợp trên toàn bộ dân số Tuy nhiên nhờ có các chương trình điều tra quốc gia ở các nước phát triển đã tạo điều kiện cho các nước đang phát triển có thể kiểm soát được các trường hợp bệnh xảy ra rải rác cũng như

các trận dịch bệnh Campylobacteriosis ở người Tỉ lệ phân lập Campylobacter

ở các nước đang phát triển là từ 5 đến 20% [74] (bảng 1.1) Mặc dù thiếu các

dữ liệu về tỉ lệ nhiễm bệnh từ các cuộc điều tra trong nước nhưng những nghiên cứu bệnh-chứng dựa trên cộng đồng ở các nước đang phát triển đã ước tính tỉ lệ

nhiễm Campylobacter ở trẻ em dưới 5 tuổi là từ 40.000 đến 60.000 khai

báo/100.000 dân

Bảng 1.1 Tỉ lệ phân lập Campylobacter ở các nước đang phát triển

từ những nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi [74]

Quốc gia Tỉ lệ phân lập (%) Châu phi

Algeria Cameroon Ethiopia Nigeria Tanzania Zimbabwe

Châu Mỹ

Brazil Guatemala

Phía đông Địa Trung

Hải

Ai cập Jordan

Nam Á

Bangladesh

Đông Nam Á

Thái Lan Lào

17,7 7,7 13,8 16,5

18 9,3

9,9 12,1

9,0 5,5 17,4

13,0 12,1

1.2.2 Tình hình nhiễm Campylobacter ở Việt nam

Vào năm 1996 – 1999, nghiên cứu về Campylobacteriosis ở Việt Nam

của DW Isenbarger [45] cho thấy Campylobacter là một trong những nguyên

nhân chính gây tiêu chảy, đặc biệt là ở trẻ em dưới 5 tuổi Những trẻ lớn hơn 5

tuổi nhiễm Campylobacter có thể bị tiêu chảy nhưng cũng có thể mang trùng

mà không có triệu chứng gì [45], việc này rất hiếm gặp ở những nước phương tây

Theo một nghiên cứu của Viện nghiên cứu thú y quốc gia và Viện vệ

dinh dịch tể trung ương về tình hình nhiễm Campylobacter spp trên thịt gà ở

Hà Nội từ năm 2003-2005, trong 100 mẫu ức gà được thu nhận từ 5 chợ lẻ ở

Hà Nội thì có 31 mẫu (31%) dương tính với Campylobacter Trong đó

Campylobacter jejuni (C jejuni) được phân lập thường xuyên nhất chiếm

45,2% và tiếp đến là Campylobacter coli (C coli) chiếm 25,8% [42]

Vào khoảng thời gian từ năm 2003-2004, kết quả nghiên cứu của Hà Thị Thanh Đào và Phạm Thanh Yến [20] về tình hình nhiễm khuẩn đường ruột trong các thực phẩm thô ở căn tin của các trường học, bệnh viện ở Hà Nội cho

thấy có khoảng 28,3% thịt gà chứa C jejuni

Theo Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy ở trẻ em ban hành ngày 28/10/2009 của bộ y tế [1], trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở Việt Nam từ

năm 2000-2004 thì vi khuẩn Campylobacter chiếm tỉ lệ 4%

Theo kết quả nghiên cứu chưa công bố của Đơn Vị Nghiên Cứu Lâm

Sàng Đại Học Oxford (OUCRU) từ năm 2009-2010, Campylobacter đang là

một trong những tác nhân vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi phân

lập tại tp Hồ Chí Minh từ năm 2009 – 2010 (n =1420)

Chú thích: Kết quả trong bảng chưa tính tới tác nhân gây bệnh là E coli

Các tác nhân vi khuẩn gây

tiêu chảy Số trường hợp Phần trăm (%)

Tuy nhiên, cho đến nay vì có rất ít những nghiên cứu về Campylobacter

ở Việt Nam cho nên những thông tin về tình hình nhiễm vi khuẩn

Campylobacter ở Việt Nam còn rất sơ sài, thiếu dữ liệu

1.3 Các nguồn chứa và các con đường lan truyền Campylobacter

1.3.1 Con người

Campylobacter không phải là một trong những vi sinh vật thường được

tìm thấy trong ruột người Tỉ lệ lây truyền giữa người và người thường thấp [18]

Tuy nhiên, những trẻ sơ sinh được sinh ra từ những bà mẹ mà đang bài

tiết Campylobacter có nguy cơ nhiễm bệnh đường ruột kết hợp với tiêu chảy ra

máu nhưng bệnh này thường tự giới hạn [89]

1.3.2 Động vật

Campylobacter thường được tìm thấy trong bao tử và ruột của các động

vật, các loài chim hoang dã và nuôi trong nhà

· Gia cầm: Hầu hết các gia cầm nuôi công nghiệp đều có Campylobacter

trong hệ đường ruột Nhiệt độ cơ thể cao 420C của các loài chim có thể

giải thích cho việc nhiệt độ phát triển tối ưu của Campylobacter jejuni (C jejuni) cũng cao [92]

· Gia súc: Campylobacter spp tồn tại phổ biến trong phân của gia súc, với

tỉ lệ phân lập từ 5-100% [31], [43] C jejuni thường được cho là nguồn

gây sảy thai cho gia súc ở miền tây Canada [97] Những nghiên cứu ở

Mỹ và Phần Lan cho thấy rằng có hơn một nửa số lượng heo nuôi công

nghiệp bài tiết Campylobacter [12] Ngoài ra Campylobacter cũng là

một tác nhân quan trọng gây nên bệnh dịch ở cừu Trong một bài báo gần đây xuất bản năm 2004 bởi Zweifel [106], từ 653 cừu bị mổ thịt, đã

phân lập được 114 chủng Campylobacter trong đó có 64% là C jejuni.

· Các thú cưng: Các thú cưng trong nhà cũng là một yếu tố nguy cơ của

bệnh Campylobacteriosis trong các nghiên cứu về kiểm soát bệnh [51]

· Côn trùng: Ruồi và các côn trùng khác [38] cũng là những sinh vật

truyền bệnh Campylobacteriosis

Sự lây truyền trực tiếp từ động vật sang người chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn ở người, thường xảy ra ở trẻ em tiếp xúc gần với chó con hay mèo con đang bị tiêu chảy [49]

1.3.3 Thực phẩm [14], [50], [51], [87], [92]

Có nhiều yếu tố nguy cơ của sự lây truyền Campylobacter đã được xác

định có liên quan đến các thực phẩm thô, thực phẩm nhiễm bẩn bao gồm sữa chưa được tiệt trùng, thịt gia cầm, thịt heo, thịt bò thô và nước chưa được xử lý đúng cách Trong đó,thịt gà hay các sản phẩm thịt gà chưa nấu chín được tin là

nguồn chứa Campylobacter quan trọng gây nên hầu hết các trường hợp bệnh rải rác ở người do Campylobacter Các điều tra về dịch tễ học đã chứng minh

được là có một mối tương quan quan trọng giữa việc tiếp xúc và tiêu thụ thịt gà

với các trường hợp bệnh đường ruột do Campylobacter [14]

Tuy nhiên các trận dịch lớn do Campylobacter thường là do sữa không tiệt

trùng và nước chưa được xử lý

1.3.4 Các nguồn khác

Bao gồm các yếu tố thuộc môi trường:

· Nguồn nước tự nhiên bị nhiễm bẩn [53]

· Đất [46]

Bên cạnh những nguồn chứa và các con đường lan truyền nêu ở trên, bệnh

Campylobacteriosis cũng có thể phát tán qua con đường du lịch Do đó du lịch

đến các nước đang phát triển và sinh sống ở các nước mà Campylobacter phổ

biến là một trong các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh tiêu chảy do

Campylobacter

Hình 1.1 Các nguồn chứa và các con đường lan truyền Campylobacter

quan trọng [21]

1.4 Hình thái, cấu trúc và một số đặc điểm sinh hóa

Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử Tế bào của tất cả

các thành viên thuộc giống Campylobacter đều nhỏ, có dạng cong, có hình chữ

S hay có dạng xoắn (dài 0,5-5 µm và rộng 0,2-0,8 µm) Chúng di động với một tiêm mao phân cực nằm ở một đầu hay hai đầu của tế bào tạo nên một kiểu di

động như hình xoắn ốc Campylobacter là vi khuẩn hiếu khí nhưng đôi khi là

hiếu khí tùy ý Chúng sử dụng sản phẩm của chu trình Kreb và các amino acid

để phát triển vì không lên men hay oxi hóa carbohydrate Campylobacter spp

có bộ gen nhỏ chỉ 1,6 – 1,7 Mbp, điều này có thể giải thích một phần vì sao khi nuôi cấy ở phòng thí nghiệm chúng lại đòi hỏi điều kiện dinh dưỡng phức tạp Các phản ứng sinh hóa đặc trưng bao gồm phản ứng khử fumarate thành succinate, methyl red âm tính, tạo acetoin và indole Hầu hết các loài đều khử nitrate và oxidase dương tính

Campylobacter thay đổi hình thái từ dạng xoắn sang dạng hình cầu khi

chịu stress từ môi trường bên ngoài hay trong các mẻ nuôi cấy thời gian dài Dạng vi khuẩn hình cầu có khuynh hướng khó nuôi cấy và mất tính di động [73] Trạng thái “còn sống nhưng không nuôi cấy được” (viable but non

culturable-VBNC) có lẽ cho phép Campylobacter tồn tại ở các môi trường khắc

nghiệt

C jejuni và C coli là những sinh vật vi hiếu khí và ưa nhiệt Nhiệt độ phát

triển tốt nhất là 420 C và đòi hỏi nồng độ oxy từ 3-15% và nồng độ CO2 là 5% Ưa nhiệt được cho là đặc điểm giúp chúng thích nghi với môi trường trong

3-ruột của động vật và chim Đặc điểm sinh lý học của C jejuni và C coli có độ tương đồng cao, sự khác nhau duy nhất về kiểu hình là C jejuni cho phản ứng thủy phân hippurate mặc dù có khoảng 5% C jejuni không thực hiện phản ứng

này

Hình 1.2 Hình dáng của Campylobacter quan sát dưới kính hiển vi điện tử

truyền suốt (A) [105] và sau khi nhuộm Gram (B)

1.5 Phân loại

Từ khi giống Campylobacter được đề xuất vào năm 1963 bởi Sebald và

Veron và khi có sự ra đời của các quy trình phân lập thích hợp, ngày càng có

nhiều vi sinh vật giống Campylobacter (Campylobacter-like organisms -

CLOs) được phân lập từ rất nhiều nguồn như con người, động vật, môi trường

Sau đó dần dần các vi sinh vật giống Campylobacter này được xác định là các loài Campylobacter mới Từ năm 1974 đến 1988 có tất cả 14 loài và dưới loài

Campyloacter được phát hiện trong các môi trường sống khác nhau và gây các

bệnh khác nhau (tổng kết bởi Vandamme và Goosens năm 1992) [99]

Hiện nay giống Campylobacter gồm có 18 loài và 6 dưới loài: [107]

C fetus subsp venerealis), C gracilis, C helveticus, C

hyoilei, C hyointestinalis (C hyointestinalis subsp hyointestinalis;

C hyointestinalis subsp lawsonii), C insulaenigrae, C

jejuni (C jejuni subsp jejuni; C jejuni subsp doylei), C lanienae,

C lari, C mucosalis, C rectus, C showae, C sputorum

C upsaliensis, C hominis

1.6 Đặc điểm gây bệnh [70]

1.6.1 Campylobacteriosis

Campylobacteriosis là một bệnh truyền nhiễm lây từ động vật sang người

– zoonosis, do vi khuẩn thuộc giống Campylobacter gây ra Bệnh này thường

được biết đến là bệnh đường ruột hay bệnh viêm dạ dày-ruột xảy ra ở người do

tiêu thụ thức ăn hay nước bị nhiễm khuẩn Dạng bệnh Campylobacteriosis gây

ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến sức khỏe cộng đồng là bệnh viêm dạ-dày

ruột do hai loài C coli và C jejuni gây ra

Liều nhiễm gây bệnh thấp, khoảng 10 - 500 tế bào, nhưng cũng thể cao hơn tùy theo sự nhạy cảm với vi khuẩn này ở mỗi người Thời gian ủ bệnh thường từ 24 đến 72 giờ và có thể lâu hơn khi số lượng vi khuẩn ban đầu thấp

1.6.2 Các biểu hiện lâm sàng

1.6.2.1 Nhiễm trùng dạ dày- ruột

Campylobacter chịu nhiệt (C coli và C jejuni) là hai tác nhân gây

nhiễm trùng đường ruột chủ yếu trên toàn thế giới [70] C jejuni gây ra 85% số trường hợp viêm dạy dày-ruột do nhiễm Campyobacter và 10-15% trường hợp là do C coli [70] Triệu chứng chính được quan sát là tiêu chảy

80-Bệnh nhân đi tiêu ra nước, máu và có thể có các tế bào máu màu trắng hay màng nhầy Các triệu chứng thường gặp khác là đau bụng, có thể kèm theo nôn mửa Ngoài ra sốt, đau đầu, suy nhược và chán ăn là những triệu chứng có thể xảy ra trước khi bị tiêu chảy

Thông thường bệnh nhiễm trùng đường ruột phát triển trong vòng 2 đến

3 ngày sau khi tiêu thụ thức ăn nhiễm bẩn và các triệu chứng sẽ tự hết trong vòng một tuần Liệu pháp dùng thuốc ít khi được sử dụng trừ khi diễn biến bệnh trở nên nghiêm trọng hay đối với các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Bệnh có tỉ lệ tái phát cao, có thể lên đến 20% bệnh nhân nhưng các triệu chứng bệnh thường nhẹ hơn so với lần đầu [104]

1.6.2.2 Nhiễm trùng hệ thống

Campylobacter là những vi khuẩn xâm lấn, và có thể gây ra nhiễm trùng

hệ thống Tuy vậy, tần số nhiễm trùng máu gây nên bởi Campylobacter vẫn còn rất thấp (0,1%) đặc biệt là khi so sánh với Salmonella

Tỉ lệ C fetus gây nhiễm trùng hệ thống cao hơn là các loài

Campylobacter chịu nhiệt như C jejuni và C coli và đây là loài Campylobacter hầu như chỉ phân lập được ở các trường hợp nhiễm trùng hệ

thống mà không thấy ở các trường hợp nhiễm trùng ruột

Biểu hiện của bệnh là sốt và có hiện tượng di căn một số mô như màng trong mạch máu (gây phình mạch máu, viêm tĩnh mạch, viêm màng trong tim),

xương, khớp xương, màng não…Bệnh nhiễm trùng hệ thống nếu không được điều trị sẽ rất nguy hiểm vì có tới 15% trường hợp dẫn đến tử vong[70]

1.6.2.3 Những biểu hiện sau nhiễm trùng

Cũng như các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác, C jejuni có thể gây

ra những biểu hiện sau nhiễm trùng hay còn gọi là di chứng Mặc dù các di

chứng hiếm xảy ra sau khi nhiễm Campylobacter nhưng nghiêm trọng và có

thể gây chết

Di chứng quan trọng nhất là hội chứng Guillian – Barre (GBS), với tỷ

lệ 1 trên 1000 – 3000 trường hợp nhiễm Campylobacter, chủ yếu là do C jejuni

(41%) Hội chứng này là một bệnh lí viêm đa dây thần kinh cấp tính, khi sợi thần kinh bị mất bao myelin, gây mất cảm giác, yếu cơ, và mất phản xạ dây chằng GBS xảy ra khi hệ miễn dịch của cơ thể tiết ra kháng thể tấn công bao

myelin do nó có thành phần tương tự như các kháng nguyên do Campylobacter

tạo ra [6]

1.6.2.4 Các yếu tố gây bệnh [98]

Cơ chế gây bệnh của Campylobacter chưa được biết chính xác vì gặp

những khó khăn trong quá trình thao tác trên gen, thiếu mô hình động vật có thể mô phỏng hiệu quả bệnh nhiễm trùng đường ruột ở người và sự hay thay đổi độc lực ở những chủng khác nhau Tuy nhiên vào năm 2000 sau khi bộ gen

của C jejuni NCTC 11168 được giải trình tự hoàn tất đã cho phép xác định một

số yếu tố gây độc đường ruột giả định ở Campylobacter như sau:

a) Tiêm mao

Tính di động cần thiết để vi khuẩn di chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ các tế bào đường ruột Nhờ các tiêm mao phân cực và hình dáng xoắn lại

đã cho phép Campylobacter di động, thâm nhập một cách hiệu quả qua lớp rào

cản màng nhầy này Vai trò của sự di động như là một yếu tố gây bệnh đã được

chứng minh bằng những đột biến không tiêm mao làm cho Campylobacter

không thể khu trú được trong đường ruột của các động vật thí nghiệm [36]

Ngoài vai trò giúp cho Campylobacter di động, tiêm mao còn là một kháng

nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh trong suốt quá trình gây nhiễm [10], [72]

và quá trình tạo ra các kháng thể chống lại tiêm mao có liên quan tới quá trình bảo vệ cơ thể chống lại bệnh [68] Cấu trúc của tiêm mao có chứa cả những vùng bảo tồn khá cao và những vùng hay thay đổi [62], [80], ngoài ra còn được biến đổi glycosyl hóa sau dịch mã Việc sử dụng thành công một tiêm mao tái

tổ hợp bao gồm những vùng bảo tồn nhất như là một vắc xin chống lại

Campylobacter trong hai mô hình chuột cho thấy tầm quan trọng của tiêm mao

trong cơ chế gây bệnh của C jejuni [57].

b) Tính hóa hướng động

Tính hóa hướng động là khả năng nhận biết các thang nồng độ hóa chất

và có thể di chuyển qua thang nồng độ này Cả tính di động và hóa hướng động

đều cần thiết cho sự khu trú của C jejuni vì những đột biến mất tính hóa hướng động làm cho C jejuni không thể sống được trong đường ruột của các mô hình

động vật

c) Sự bám dính và xâm lấn

Một đặc điểm quan trọng trong cơ chế gây bệnh của C jejuni là khả

năng bám và thâm nhập vào các tế bào chủ [104] Trong quá trình gây nhiễm,

Campylobacter di chuyển qua lớp màng nhầy bao phủ các tế bào biểu mô, bám

chặt vào các tế bào này, sau đó xâm lấn các tế bào biểu mô Sự xâm lấn sẽ dẫn đến sự phá hủy lớp màng nhầy và gây hiện tượng viêm mà thường được quan

sát thấy ở các trường hợp nhiễm Campylobacter Nguyên nhân là do quá trình xâm lấn của C jejuni cảm ứng rất nhiều yếu tố kích hoạt quá trình viêm như cytokine interleukine 8 [7], [40] Tiêm mao lần nữa là yếu tố đầu tiên của C

jejuni được xác định là liên quan đến sự bám dính và xâm lấn vì những đột biến

mất đi tiêm mao làm cho C jejuni giảm tính di động đồng thời giảm tính bám

dính và mất khả năng xâm nhập [34], [102] Một số yếu tố khác giúp cho

Campylobacter bám vào các tế bào biểu mô là protein gắn vào khoảng gian bào

PEP1 [78], protein nằm ở màng ngoài gắn vào fibronectin CadF [55] và một số yếu tố khác

d) Sản sinh độc tố

Sự sản sinh ra các độc tố góp phần vào quá trình gây bệnh của

Campylobacter bên trong các tế bào chủ Mặc dầu có rất nhiều nghiên cứu cho

rằng có sự sản sinh hoặc cytotoxin hoặc độc tố đường ruột – enterotoxin hay cả

hai ở Campylobacter nhưng cơ chế hoạt động và vai trò gây bệnh của chúng

vẫn chưa được rõ ràng Cho đến bây giờ chỉ có độc tố CDT (cytolethal

distending toxin) là độc tố duy nhất của Campylobacter được xác nhận vì trong trình tự bộ gen của C jejuni NCTC 11168 chỉ có chứa các gen gây độc là cdt Độc tố CDT của C jejuni được mã hóa bởi một operon gồm 3 gen (cdtABC) và những thể đột biến cdt gồm 2 gen sẽ làm mất hoạt tính của CDT Độc tố CDT

khiến cho phần lớn các loại tế bào trong cơ thể người trở nên sưng phồng lên từ

từ và cuối cùng dẫn đến tiêu hủy tế bào Hầu hết các chủng C jejuni đều có hoạt tính CDT khá cao còn các chủng C coli thường cho thấy hoạt tính độc tố

này khá thấp Nguyên nhân của sự khác nhau này vẫn chưa được giải thích

1.7 Chẩn đoán và điều trị

1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Triệu chứng của sự nhiễm Campylobacter là tiêu chảy, đau bụng, sốt, đau

đầu, suy nhược Tuy nhiên các triệu chứng này khó phân biệt với bệnh đường

ruột do những vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella và E.coli 0157:H7

1.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm [104]

Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống luôn là tiêu chuẩn vàng trong

chẩn đoán bệnh C jejuni và C coli có thể được nuôi cấy từ mẫu phân còn các loài Campylobacter khác gồm cả C fetus có thể được nuôi cấy từ mẫu máu

Phân lập C jejuni và C coli từ mẫu phân đòi hỏi môi trường chọn lọc có

chứa kháng sinh (môi trường mCCDA có chứa cefoperazone, amphotericin B), điều kiện vi hiếu khí và nhiệt độ ủ là 420

C Kháng sinh sẽ ức chế các vi sinh vật

khác có trong đường ruột Nuôi cấy ở 420

C kìm hãm sự phát triển của một số

loài Campylobacter spp không chịu nhiệt Nếu muốn phát hiện các loài

Campylobacter khác, các phòng thí nghiệm có thể sử dụng kĩ thuật phân lập

không chọn lọc như phương pháp lọc vì C upsaliensis, C hyointestinalis và C

fetus nhạy với một số kháng sinh có trong môi trường chọn lọc và nếu sử dụng

môi trường không có kháng sinh thì các loài Campylobacter sẽ gặp sự cạnh

tranh với các vi sinh vật khác trong hệ đường ruột

Các kỹ thuật nhanh và nhạy để phát hiện Campylobacter như phương

pháp PCR hay ELISA đang được phát triển

1.7.3 Điều trị [13]

Ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch tốt thì bệnh nhiễm trùng đường ruột

do Campylobacter thường tự khỏi Nếu bệnh chỉ biểu hiện những triệu chứng

nhẹ đến trung bình thì bệnh nhân không cần uống kháng sinh chỉ cần bù nước đặc biệt là đối với trẻ em

Đối với những trường hợp bệnh nặng kéo dài, sốt dai dẳng, tiêu máu, tiêu chảy trên 7 ngày hay những người bị suy giảm miễn dịch như những bệnh nhân bị AIDS thì cần được chữa trị bằng kháng sinh

Để điều trị bệnh tiêu chảy do Campylobacter bằng liệu pháp kháng sinh,

theo khuyến cáo của tổ chứa y tế thế giới WHO, họ kháng sinh macrolide (gồm erythromycin, azithromycin) và fluoroquinolone là hai họ kháng sinh ưu tiên được lựa chọn

Erythromycin và azithromycin giúp rút ngắn thời gian bị bệnh, giảm bài tiết các vi khuẩn và ngăn chặn tái phát khi được dùng vào giai đoạn đầu nhiễm bệnh Erythromycin giúp giảm thời gian nhiễm bệnh từ 16,8 thành 2 ngày [76]

và azithromycin giúp loại bỏ sự bài tiết Campylobacter trong vòng 24 giờ [56]

Fluoroquinolone như ciprofloxacin cũng thường được sử dụng để điều

trị nhiễm Campylobacter Việc dùng fluoroquinolone phổ biến để điều trị nhiễm Campylobacter là do triệu chứng bệnh giống với triệu chứng của bệnh

viêm dạ dày-ruột do các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella Những

trường hợp bệnh viêm dạ dày-ruột nghiêm trọng, fluoroquinolone được sử dụng ngay mà không cần chờ kết quả phân lập [5]

Tuy nhiên ở Việt Nam, bác sĩ ở các bệnh viện đều chỉ sử dụng

fluoroquinolone để điều trị bệnh tiêu chảy do Campylobacter cũng như các vi

khuẩn đường ruột khác, ít khi sử dụng đến kháng sinh họ macrolide

Kháng sinh sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng máu do

Campylobacter được lựa chọn dựa vào kết quả kiểm tra kháng sinh đồ C fetus

thường nhạy với aminoglycosides, cephalosporins phổ rộng, meropenem, imipenem và ampicillin

1.8 Tình hình kháng các loại thuốc dùng để chữa bệnh nhiễm

Campylobacter

1.8.1 Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter ở thế giới

Tình hình kháng kháng sinh đã trở thành mối quan tâm về sức khỏe cộng đồng ở các nước phát triển và đang phát triển trong những năm gần đây

[45], [72] Campylobacter kháng ciprofloxacin hay các fluoroquinolone (FQ)

khác và erythromycin, chloramphenicol, gentamicin và tetracycline đã được

báo cáo [75] Trong thập kỉ qua, tình hình kháng FQ ở Campylobacter tăng

nhanh cùng với tỉ lệ phân lập được chúng trên khắp thế giới Ở các nước Châu

Âu có khoảng 17% - 99% các chủng Campylobacter phân lập từ người và động vật kháng với FQ [4], [64] Campylobacter kháng FQ cũng trở nên phổ biến ở

cả Châu Phi và Châu Á Ở cả hai châu lục này, các mẫu phân lập lâm sàng

Campylobacter kháng FQ đã không được phát hiện vào trước năm 1991 nhưng

từ năm 1993 thì tần số các chủng Campylobacter kháng FQ đã tăng một cách

đáng kể, cụ thể là tỉ lệ kháng đã lên đến trên 80% ở Thái Lan và Hồng Kông

[64] Tuy vậy tỉ lệ kháng FQ ở các mẫu Campylobacter phân lập ở Úc và

Newzealand vẫn còn thấp một cách đáng kể so với các vùng khác [33], [88]

Có rất nhiều nghiên cứu đã liên kết việc sử dụng FQ trong nông nghiệp

và trong thuốc thú y với sự xuất hiện và gia tăng sự kháng FQ của các chủng

Campylobacter phân lập từ các thực phẩm động vật và từ người Từ khi bắt đầu

sử dụng họ FQ (chủ yếu là enrofloxacin) vào thức ăn của động vật vào đầu những năm 1990 ở những nước Châu Á và Châu Âu như Thụy điển, Hà lan và

Tây ban nha thì Campylobacter kháng FQ đầu tiên ở người cũng được phân lập

ở những nước này [24] Tương tự ở Mỹ, việc đưa sarafloxacin và enrofloxacin vào sử dụng như là các chất kích thích tăng trưởng ở các đàn gia cầm vào giữa

những năm 1990 cũng đã góp phần làm tăng tỉ lệ kháng của các mẫu

Campylobacter phân lập từ người từ 1,3% năm 1992 đến 10,2% năm 1998

[72]

Tỉ lệ các chủng Campylobacter kháng FQ phân lập từ thực phẩm động

vật còn cao hơn phân lập từ người Vào năm 2001, ở Đức, tỉ lệ các chủng

Campylobacter phân lập từ người kháng với ciprofloxacin là 41 - 46%, trong

khi có tới 42% và 71% các chủng C jejuni và C coli phân lập từ thịt gà là

kháng với ciprofloxacin [65]

Hiện nay Macrolide được xem như là kháng sinh tối ưu để chữa trị bệnh

do nhiễm Campylobacter Mặc dù erythromycin đã được sử dụng từ rất lâu nhưng khuynh hướng kháng kháng sinh này ở Campylobacter phân lập được từ

người vẫn rất thấp và ổn định theo thời gian ở Nhật, Canada và Phần Lan Nhưng gần đây có sự gia tăng kháng ở Thái Lan và Thụy Điển [41], [90]

Dữ liệu về tình hình kháng erythromycin ở C jejuni và C coli khác

nhau giữa các quốc gia, tuy vậy các nghiên cứu đều báo cáo tần suất kháng

erythromycin ở C coli cao hơn ở C jejuni (0 -11% ở C jejuni và 0 - 68,4% ở

C coli ) [25]

1.8.2 Tình hình kháng kháng sinh của Campylobacter ở Việt Nam

Trong khoảng thời gian 1996 – 1999, chỉ có 7% mẫu Campylobacter

phân lập được từ trẻ em dưới 5 tuổi ở Việt Nam kháng với nalidixic acid và ciprofloxacin theo kết quả nghiên cứu của DW Isenbarger [45]

Theo một nghiên cứu mới nhất vào năm 2010 của trường Đại học Thụy

Điển ở Cần Thơ Việt Nam, tỉ lệ Campylobacter phân lập từ thịt gà ở Cần Thơ

kháng với nalidixic acid và ciprofloxacin đã tăng lên đến 64% đối với C jejuni

và lên đến 100% đối với C coli [86]

Hình 1.3 Nhân quinolone (A) và nhân naphthyridone (B) [82]

Nalidixic acid (NA) là kháng sinh thuộc họ quinolones, nhân naphthyridone, được khám phá đầu tiên vào những năm đầu thập niên 1960, chỉ

có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram âm ở mức vừa phải

Trong suốt thập niên 1980, nhiều dẫn xuất quinolones hoạt tính mạnh hơn được tổng hợp Những kháng sinh ra đời sau NA được cải tiến nhiều về mặt cấu trúc nên chúng thể hiện khả năng kháng khuẩn Gram âm cao hơn, thời gian bán hủy dài và khả năng được cơ thể hấp thu cao hơn Norfloxacin ra đời với cấu trúc được cải tiến gồm có một gốc fluoro ở C6, một vòng piperazin ở C7 làm gia tăng phổ tác động đối với vi khuẩn Norfloxacin được xem là bước chuyển tiếp giữa các kháng sinh quinolones cũ và các kháng sinh quinolones mới hay còn được gọi là fluoroquinolone

Ciprofloxacin, Ofloxacin ra đời tiếp đó hoàn thiện hơn tác động kháng khuẩn cũng như thời gian bán hủy của thuốc Ofloxacin cũng với cấu trúc ba vòng như norfloxacin, nhưng thay thế vòng flumequin bằng vòng morpholine

Ciprofloxacin là kháng sinh có tác động mạnh nhất đối với vi khuẩn gram âm nhờ được cải tiến bằng một nhóm cyclopropyl ở vị trí thứ nhất

Gatifloxacin ra đời với nhóm methoxyl ở vị trí C8 tăng cường khả năng diệt khuẩn, và chống lại tính đề kháng của các vi khuẩn gram âm, phổ tác động của chúng bao trùm cả vi khuẩn gram âm, gram dương và vi khuẩn kị khí

Hình 1.4 Cấu trúc của một số kháng sinh quinolones điển hình [106]

Ciprofloxacin

Ofloxacin

1.9.2 Phân loại [109]

Họ quinolones được phân thành nhiều thế hệ dựa trên phổ hoạt động kháng khuẩn của chúng Những thế hệ quinolones đầu tiên chỉ tác động trên vi khuẩn Gram âm và sau này phổ tác động mở rộng lên cả vi khuẩn Gram dương với những thế hệ quinolones mới

Bảng 1.3 Một số đại diện của họ quinolones [109]

· Các tác nhân gây bệnh không điển hình

· Pseudomonas aeruginosa (Ciprofloxacin)

Thế hệ thứ ba

· Levofloxacin

· Sparfloxacin

· Tosufloxacin

· Vi khuẩn Gram âm, Gram dương

· Các tác nhân gây bệnh không điển hình như

Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae

· S pneumoniae nhạy và kháng với penicillin

Thế hệ thứ tư

· Clinafloxacin

· Gemifloxacin

· Moxifloxacin

· Vi khuẩn Gram âm, Gram dương

· Các tác nhân gây bệnh không điển hình

· Vi sinh vật kị khí

· Gatifloxacin

1.9.3 Cơ chế hoạt động

Enzyme mục tiêu của fluoroquinolone trong tế bào vi khuẩn là DNA gyrase và Topoisomerase IV Cả hai enzyme này đều cần thiết cho quá trình sao chép của vi khuẩn

DNA gyrase là một cấu trúc tứ phân gồm 2 tiều đơn vị GyrA và 2 tiểu đơn vị GyrB Topoisomerase IV được cấu thành bởi 2 tiểu đơn vị ParC và 2

tiểu đơn vị ParE, được biết đến với tên GrlA, GrlB ở Staphylococcus aureus

ParC thì tương đồng với GyrA và ParE tương đồng với GyrB

DNA gyrase là enzyme duy nhất của vi khuẩn tạo siêu xoắn âm cho DNA, cần thiết cho quá trình khởi sự sao chép và giúp loại bỏ những vòng DNA xoắn dương thường hình thành ở đầu ngã ba sao chép

Topoisomerase IV thì hoạt động ở giai đoạn cuối cùng của quá trình sao chép, giúp tách liên kết của các cặp nhiễm sắc thể chị em để chúng đi vào các

tế bào con

Fluoroquinolone ức chế những enzyme này bằng cách ổn định phức hợp DNA-DNA gyrase hay phức hợp DNA-topoisomerase IV Phức hợp DNA-DNA gyrase khi bị ổn định sẽ khóa sự di chuyển ngã ba sao chép làm cho phức hợp giữa DNA và các enzyme từ liên kết thuận nghịch trở thành không thuận nghịch Mặt khác DNA bị cắt ra trong phức hợp với DNA gyrase không được nối lại nên dần dần sẽ gây chết tế bào

1.9.4 Cơ chế kháng quinolone [77]

Có 3 cơ chế kháng quinolone đã được miêu tả ở vi khuẩn Gram âm: đột biến gen mục tiêu; bảo vệ mục tiêu thông qua protein Qnr và giảm sự tích lũy kháng sinh nội bào (bằng cách giảm tính thấm của màng ngoài hay tăng hoạt

tính của bơm đẩy thuốc) Gen qnr qua trung gian plasmid gây kháng

fluoroquinolone ở mức thấp trên các loài vi khuẩn khác nhưng chưa được miêu

tả ở Campylobacter (Hình 1.5)

Hình 1.5 Các cơ chế kháng quinolone bao gồm (1) Đột biến gen mục tiêu,

(2) sự bảo vệ mục tiêu thông qua plasmid, (3) + (4) giảm sự tích lũy kháng sinh nội bào (giảm tính thấm của màng + thông qua bơm đẩy thuốc)

1.9.4.1 Các đột biến gen mục tiêu

Ở vi khuẩn Gram âm, DNA gyrase là mục tiêu chủ yếu và DNA topoisomerase IV là mục tiêu thứ yếu của fluoroquinolone Hai tiểu đơn vị của

DNA gyrase được mã hóa bởi gen gyrA và gyrB và hai tiểu đơn vị của topoisomerase IV là sản phẩm của các gen parC và parE Sự kháng với các loại

kháng sinh fluoroquinolone bắt nguồn từ sự thay thế một hay các amino acid trong một vùng mục tiêu tương ứng gọi là “vùng quy định kháng quinolone” (Quinolone resistance determining region – QRDR) của enzyme DNA gyrase

và topoisomerase IV

Ở Campylobacter, emzyme mục tiêu của fluoroquinolone chỉ có DNA

gyrase, còn enzyme topoisomerase IV không có bằng chứng cho thấy có tồn tại

ở vi khuẩn này Cho đến nay chỉ có một bài báo duy nhất của Gibreel và các

đồng nghiệp [32] là miêu tả gen parC ở Campylobacter Tuy nhiên những tác

giả từ rất nhiều phòng thí nghiệm khác đã cố gắng khuếch đại gen parC nhưng đều không thành công, thậm chí họ đã sử dụng cùng chủng C jejuni và các mồi khuếch đại gen parC mà Gibreel đã sử dụng [8],[77] Hơn nữa, các nhà nghiên cứu bộ gen đã thử BLAST trình tự gen của parC đã được miêu tả ở C jejuni hay trình tự của gen parC của E coli trên bộ gen đã được giải trình tự của C

jejuni NCTC 11168, RM 1221 và C coli RM 2228 đều không tìm thấy kết quả

nào tương đồng Họ đề nghị rằng không có gen parC ở vi khuẩn

Campylobacter

Sự vắng mặt của enzyme topoisomerase IV dẫn đến sự biến đổi của DNA gyrase là cơ chế chính dẫn đến sự kháng fluoroquinolone ở

Campylobacter Theo kết quả của nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy sự biến

đổi duy nhất của tiểu đơn vị GyrA mà chuyển Threonin thành Isoleucin ở

codon 86 ( tương ứng với vị trí 83 ở GyrA của E coli ) là đã đủ để gây ra một kiểu hình kháng với fluoroquinolone ở Campylobacter Còn các đột biến ở

GyrB thì đều là các đột biến im lặng, không tác động đến tính kháng fluoroquinolone [77]

Những đột biến khác của tiểu đơn vị GyrA cũng giúp vi khuẩn kháng fluoroquinolone Những đột biến thường xảy ra và gây kháng ở mức độ vừa phải bao gồm Asp90→Asn và Thr86→Lys Ngoài ra còn có đột biến không xuất hiện thường xuyên là Thr86→Ala, Asp90→Tyr và những đột biến đôi gây

ra sự biến đổi ở hai amino acid như Thr86→Ile và Pro104→Ser hay Thr86→Ile và Asp90→Asn [77]

1.9.4.2 Giảm nồng độ kháng sinh nội bào

Sự kháng với các loại kháng sinh thông qua sự giảm tính thấm của màng

ngoài tế bào chưa được miêu tả ở Campylobacter Ở C jejuni, có hai kênh

xuyên màng (porin) đã được miêu tả là MOMP (major outer membrane protein) và Omp50 Tuy nhiên không có sự biến đổi nào về mặt biểu hiện hay trong trình tự của hai kênh xuyên màng này được tìm thấy là có liên quan tới sự

kháng kháng sinh ở Campylobacter

Cơ chế khác liên quan tới sự kháng fluoroquinolone ở Campylobacter là

thông qua các hệ thống bơm đẩy thuốc ra ngoài – efflux pump CmeABC là hệ

thống bơm đẩy thuốc tốt nhất ở Campylobacter, góp phần vào sự kháng thuốc

từ bên trong [35] Hệ thống bơm họat động hiệu quả với phổ rộng các kháng

sinh bao gồm cả fluoroquinolone Operon cmeABC phân bố rộng rãi trong các chủng Campylobacter ngay cả ở các chủng hoang dại

Bơm CmeABC bao gồm 3 thành viên là một kênh xuyên màng ngoài - CmeC, một protein vận chuyển thuốc nằm ở màng trong - CmeB và một protein nằm ở giữa màng ngoài và màng trong – CmeA Ba protein này được

mã hóa bởi một operon gồm 3 gen là cmeABC và ba protein này phối hợp với

nhau tạo nên một kênh xuyên màng có vai trò đẩy thuốc trực tiếp ra ngoài tế

bào Campylobacter

CmeABC được điều hòa biểu hiện bởi yếu tố ức chế phiên mã – CmeR

Gen cmeR nằm phía trước operon cmeABC và mã hóa cho một protein gồm 210 amino acid CmeR được phiên mã cùng hướng với cmeABC và vùng gen nằm giữa cmeR và cmeA chứa một đoạn trình tự lặp lại gồm 16 bp thuộc vị trí promoter của operon cmeABC Với chức năng là chất ức chế phiên mã, cmeR

gắn trực tiếp vào đoạn trình tự lặp lại ở vùng promoter này và ức chế sự phiên

mã của operon cmeABC

Những đột biến ở vùng trình tự 16 bp (5’-TGTAATAAATATTACA-3’)

của vùng gắn cmeR trên promoter dẫn đến sự biểu hiện vượt mức của cmeABC,

làm tăng cường sự kháng với nhiều kháng sinh trong đó có fluoroquinolone

Bơm CmeABC hoạt động phối hợp với đột biến gen gyrA để tạo ra mức độ

kháng fluoroquinolone cao [59]

Hình 1.6 Tổ chức gen của operon cmeABC và những đặc điểm về trình tự

của vùng gen nằm giữa cmeR - cmeABC [59]

Chú thích: Vùng trình tự in đậm là vùng trình tự 16 bp

(5’-TGTAATAAATATTACA-3’)

1.10 Các phương pháp phân loại Campylobacter [103]

Có rất nhiều phương pháp phân loại được phát triển để xác định và phân

biệt các chủng Campylobacter dựa vào kiểu hình - phenotyping hay dựa vào

kiểu gen - genotyping

Các phương pháp dựa vào kiểu hình thì dựa vào các đặc tính sinh hóa

hay việc tiết protein của vi khuẩn Đối với C coli và C jejuni thì phương pháp

kiểm tra kiểu hình quan trọng nhất là serotyping gồm phương pháp dựa vào kháng nguyên bền nhiệt của Penner và phương pháp khác dựa vào kháng nguyên không bền nhiệt của Lior Ưu điểm của phương pháp dựa vào kiểu hình

là có khả năng sàng lọc một số lượng lớn các mẫu phân lập với giá thành rẻ, nhưng nhược điểm là khả năng phân biệt không cao

Vì các phương pháp phân loại dựa vào kiểu hình chưa đủ sức mạnh để phân biệt giữa các chủng nên ngày càng có nhiều phương pháp dựa vào kiểu

gen để phân loại Campylobacter Các phương pháp này có hiệu quả phân biệt

tốt giữa các chủng và có thể được sử dụng cho những nghiên cứu dịch tễ

Một phương pháp dựa vào kiểu gen - genotyping được sử dụng phổ biến

để phân loại Campylobacter là điện di trường xung (Pulsed field gel

electrophoresis -PFGE) Nguyên tắc của phương pháp này là phân cắt toàn bộ

DNA nhiễm sắc thể của tế bào với các enzyme cắt giới hạn hiếm tạo ra tương đối ít các phân đoạn DNA có kích thước khá lớn Các phân đoạn DNA này sau

đó được tách biệt nhau theo kích thước bởi một phương pháp điện di đặc biệt

đó là điện di trong trường xung Nguyên tắc của điện di trong trường xung là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại Thời gian cần cho việc tự định hướng lại tùy thuộc vào kích thước của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng lại càng lớn khiến nó di chuyển chậm hơn Những thay đổi của các vị trí cắt giới hạn sẽ tạo nên một dữ liệu về các kiểu vạch DNA khác nhau của mỗi vi khuẩn Dựa vào dữ liệu này ta có thể so sánh được hai mẫu phân lập bất kỳ có phải là cùng một chủng vi khuẩn hay không Nếu dữ liệu về các kiểu vạch DNA của hai mẫu này giống nhau thì chúng được xem là cùng một chủng vi khuẩn và ngược lại

Hai kỹ thuật genotyping khác cũng hay sử dụng là phương pháp phân tích độ đa hình của các phân đoạn được khuếch đại (Amplified fragment length

polymorphism - AFLP) và phương pháp Fla - typing

Nguyên tắc của phương pháp AFLP là phân cắt DNA nhiễm sắc thể với hai enzyme cắt giới hạn khác nhau gồm một enzyme cắt hiếm và một enzyme cắt thường xuyên Sau đó các sản phẩm cắt ra được nối với “adaptor” có thiết

kế đặc biệt gồm một trình tự lõi DNA đã biết và một trình tự chuyên biệt cho enzyme cắt giới hạn Trình tự adaptor này sau đó được sử dụng làm trình tự mồi khuếch đại Một trong hai mồi sử dụng được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang để có thể quan sát được sự di chuyển của DNA Để giới hạn mức độ đa hình của vị trí cắt giới hạn, các mồi được thêm vào một hay nhiều nucleotide chuyên biệt gần bên vị trí cắt giới hạn Lúc đó chỉ có những phân đoạn nào chứa các nucleotide chuyên biệt gần bên vị trí cắt giới hạn mới được phát hiện

và phân tích Các sản phẩm PCR sau đó được biến tính và chạy trên gel acrylamide của máy giải trình tự hay phân tích trên gel polyacrylamide biến tính So sánh dữ liệu các vạch trên gel hay dựa vào kết quả điện di đồ của máy giải trình tự có thể phân biệt được giữa các chủng vi sinh vật

Phương pháp Fla - typing (fla – PCR RFLP) liên quan đến việc khuếch

đại các gen flagellin bởi PCR và sau đó phân cắt các sản phẩm PCR với enzyme cắt giới hạn Gen mã hóa cho flagellin có chứa cả những vùng bảo tồn

và những vùng thay đổi cho nên nó rất thích hợp đối với phương pháp phân tích độ đa hình của những phân đoạn cắt giới hạn của một sản phẩm PCR (Restriction fragment length polymorphism-RFLP) Các phân đoạn được cắt ra

sẽ tách ra nhau theo kích thước khi điện di trên gel agarose Các chủng giống nhau sẽ có dữ liệu các vạch DNA trên gel giống nhau và ngược lại

Ngoài ra còn nhiều phương pháp xác định kiểu gen khác được sử dụng

để phân loại Campylobacter như: Random Amplyfied polymorphic DNA

(RAPD), ribotyping

Bảng 1.4 Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp phân loại

dựa vào kiểu gen Campylobacter [103]

Phương

pháp

Sức mạnh phân biệt

Khả năng phân loại (%)

Tính lặp lại (%)

Sự nhạy với sự bất

ổn định di truyền

Thời gian thực hiện Chi phí

bình

bình

bình

1.11 Phương pháp Multilocus sequence typing – MLST

Phương pháp MLST là một phương pháp xác định kiểu di truyền bằng cách xác định trực tiếp sự thay đổi trình tự DNA của những phân đoạn gen nằm bên trong các gen giữ nhà (house - keeping gene) Các gen giữ nhà tiến hóa rất chậm vì chúng chịu ảnh hưởng của sự chọn lọc ổn định để bảo tồn các chức năng trao đổi chất của tế bào do đó phân tích đột biến trong các gen này có thể phản ánh chính xác hơn mối quan hệ phát sinh loài giữa các chủng

Phương pháp này khai thác những phát triển về mặt kỹ thuật gần đây trong việc giải trình tự số lượng lớn, sinh tin học và các khái niệm tiến bộ về sinh học quần thể vi khuẩn Phương pháp MLST được đề xuất lần đầu tiên vào

năm 1998 cho Neiserria và đã được áp dụng thành công trong việc miêu tả rất

nhiều quần thể vi khuẩn

1.11.1 Phương pháp MLST cho Campylobacter [23]

Vào năm 2001, Dingle và đồng sự [23] đề xuất một hệ thống MLST cho

C jejuni mà sau đó đã được cập nhật để bao gồm cho cả C coli và tất cả các

loài Campylobacter khác sử dụng cùng các phân đoạn gen Các loci của gen được đề xuất cho C jejuni là: aspA (aspartase), glnA (glutamine synthetase),

gltA (citrate synthase), glyA (serine hydroxy methyl transferase), tkt

(transketolase), pgm (phospho glucomutase) and uncA (ATP synthase alpha

Vị trí của 7 loci trên bản đồ của C jejuni là bắt nguồn từ trình tự bộ gen của C jejuni NCTC

11168 Bộ gen 1641.481 bp được chia thành 10 phân đoạn (bên trong vòng tròn), mỗi phân

đoạn đại diện 164.148 bp

Dingle và đồng sự đã thiết kế mồi dựa vào trình tự bộ gen của C jejuni

đã được công bố Các mồi được sử dụng để khuếch đại một đoạn gen khoảng 450-550 bp phụ thuộc vào loci của gen Các phân đoạn gen từ mỗi một loci trong 7 loci được giải trình tự và các allele sẽ được cho một con số dựa vào thứ

tự thời gian chúng được xác định Bảy allele tại 7 loci gen này hình thành nên một kiểu trình tự trọn vẹn – sequence type (ST) mà cũng được cho một con số dựa vào thời điểm chúng được xác định Allele đầu tiên được xác định ở locus

aspA sẽ là aspA1 và trình tự ST đầu tiên sẽ là ST-1 và vân vân Dingle và đồng

sự đã sử dụng thuật toán BURST (Based Upon Related Sequence Types - một thuật toán chuyên phân tích dữ liệu về trình tự MLST) để xác định clonal complex (CC); các mẫu phân lập được xác định thuộc clonal complex nhất định nếu mỗi mẫu phân lập có chung ít nhất 4 trong 7 allele so với kiểu trình tự (ST) trung tâm giả định của clonal complex đó (clonal complex mang tên của kiểu trình tự trung tâm)

1.11.2 Ưu điểm và khuyết điểm của phương pháp MLST so với các phương pháp genotyping khác

Phương pháp MLST là một phương pháp phân loại dựa vào kiểu gen có sức mạnh phân biệt giữa các chủng cao Ngoài ra phương pháp MLST còn có nhiều ưu điểm khác bao gồm:

o Phương pháp MLST giúp giảm nhu cầu vận chuyển vi khuẩn sống

vì việc xác định trình tự DNA từ những sản phẩm PCR có thể đạt được từ dịch huyền phù vi khuẩn đã bị giết hay DNA đã được tinh sạch

o Có thể lấy được trình tự mồi, quy trình thực hiện và trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí ngiệm thông qua internet vì có một địa chỉ mạng toàn cầu để cất giữ quy trình thực hiện, các trình tự mồi cho MLST

và toàn bộ dữ liệu về trình tự allele, kiểu trình tự ST, clonal

complex của các mẫu Campylobacter được phân lập trên toàn thế

giới (http://pubmlst.org/Campylobacter/)

o Phương pháp MLST cung cấp kết quả dưới dạng số nên rõ ràng, chính xác và cho phép so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm thông qua internet một cách dễ dàng Trong khi các phương pháp phân tích kết quả dựa vào so sánh kích thước DNA trên gel thì không rõ ràng

o Vì phương pháp này hoàn toàn dựa vào dữ liệu về trình tự nên có tính lặp lại cao

o Phương pháp này thích hợp đối với những nghiên cứu dịch tễ toàn cầu và kéo dài vì nó xác định sự thay đổi mà tích lũy chậm trong một quần thể vi khuẩn

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm nêu trên thì phương pháp MLST cũng có những khuyết điểm là đòi hỏi thiết bị đắc tiền và nhân công có kỹ thuật cao.Phương pháp MLST hay được sử dụng kết hợp với một phương pháp khác

như Fla - typing để tăng sức mạnh phân loại vi khuẩn khi khảo sát dịch tễ các

trận dịch lớn xảy ra trong một thời gian ngắn và trong một phạm vi nhỏ

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Bộ sưu tập chủng

64 chủng Campylobacter spp trong nghiên cứu này được phân lập từ

mẫu phân của các trẻ em bị tiêu chảy từ tháng 6 năm 2009 đến tháng 5 năm

2010, tại 3 bệnh viện: Bệnh Viện Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh Viện Nhi Đồng 1 và Nhi Đồng 2

Các bệnh nhi tham gia nghiên cứu đều dưới 5 tuổi, nhập viện vì bệnh tiêu chảy, không bị các biến chứng của bệnh viêm dạ dày-ruột, thường trú tại thành phố Hồ Chí Minh và không sử dụng kháng sinh trước đó hay đã sử dụng kháng sinh nhưng không quá 3 ngày Nghiên cứu này là một phần của nghiên cứu “Những tác nhân gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố Hồ Chí Minh” giám sát bởi tiến sĩ Stephen Baker thuộc Đơn Vị Nghiên Cứu Lâm Sàng Trường Đại Học Oxford (OUCRU), Bệnh Viện Bệnh Nhiệt Đới (HTD), thành phố Hồ Chí Minh

Trong 64 chủng Campylobacter phân lập được, có 24 chủng

Campylobacter đã bị chết trong quá trình giữ chủng Do đó trong nghiên cứu

này chỉ thực hiện kháng sinh đồ và các thí nghiệm sinh học phân tử đối với 40

chủng Campylobacter spp còn sống Danh sách 40 chủng Campylobacter còn

sống được nêu ở phụ lục 1.1

- Máy ly tâm thường và ly tâm lạnh (eppendorf)

- Máy vortex (Jencons)

- Máy đo quang phổ DNA (NanoDrop, Thermo Scientific)

- Máy PCR (Eppendorf)

- Bộ điện di DNA (Biorad)

- Máy chụp hình gel (Biorad)

- Pipette các loại

- Micropipette và đầu típ các loại

- Eppendorf các loại

- Máy giải trình tự 3130XL (Applied Biosystem)

- Máy sấy khô DNA (ThermoSavant)

2.1.3 Hóa chất

2.1.3.1 Hóa chất tách chiết DNA bộ gen

Bộ kit tách chiết DNA bộ gen Wizard (Promega) Bộ kít này gồm các thành phần: dung dịch ly giải màng nhân, dung dịch tủa protein, RNase, isopropanol, ethanol 70% và dung dịch đệm TE

2.1.3.2 Hóa chất dùng trong điện di DNA

- Agarose (Biorad)

- Đệm TBE 1X dùng để pha gel agarose và chạy điện di có thành phần:

Tris 10,8 g Acid boric 55 g EDTA 0,5M 40 ml

- Đệm nạp mẫu (6X) có thành phần:

Orange G 0,25% (w/v) Glycerol 30% (v/v)

- Dung dịch nhuộm DNA trên agarose: Ethidium bromide 1%

2.1.3.4 Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm của PCR

Bộ kít QIAquick PCR purification (Qiagen) được dùng để tinh sạch sản

phẩm của phản ứng PCR bằng cột hấp thu silica, gồm các thành phần:

- Dung dịch đệm PB giúp DNA bám được trên cột silica

- Dung dịch đệm PE có chứa ethanol có tác dụng rửa trôi những thành

phần không cần thiết (mồi, Taq DNA polymerase, muối…) ra khỏi cột

- Nước cất vô trùng