Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu bản NST thai

Các bảng Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối

LÂM THỤY ANH THƯ

ĐỀ TÀI

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

TẾ BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI

TẠO TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM - hướng Sinh lý động vật

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN THỊ DÂN

Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 6/2011

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã tận tình dạy dỗ chúng em trong thời gian vừa qua Xin cám ơn Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM và ban lãnh đạo bệnh viện Từ Dũ Tp HCM đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin gởi những lời tri ân sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Dân và thầy Phùng Như Toàn, là người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn này Và cho tôi gởi những lời cám ơn chân thành đến anh Hoan, các bạn Quyên, Phú, Ngân, chị Liên, chị Oanh, chị Trang, bạn Hoàng, Trâm, anh Cường và các anh chị ở Khoa Di Truyền bệnh viện

Từ Dũ, những người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Cám ơn các thầy cô đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đóng góp ý kiến giúp cho luận văn này hoàn thiện hơn

Lâm thụy Anh Thư

AF (amniotic fluid specific): đặc trưng của dịch ối

AFP: alpha-fetoprotein

bFGF(basic fibroblast growth factor): nhân tố cơ bản phát triển nguyên bào sợi

DMSO: dimethyl sulphoxide

DVME medium: môi trường Dulbecco-Vogt modified Eagle's

E (epithelioid): dạng biểu mô

F (fibroblastic): dạng nguyên bào sợi

F12: môi trường Ham's F12

FBS (Fetal bovine serum): huyết thanh phôi bò

FISH (Flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang

FSH (human follicle-stimulating hormone ): hóc-môn kích thích nang trứng

GH (growth hormon): hóc-môn sinh trưởng

hCG (human chorionic gonadotropin): kích dục tố màng đệm người

LH (human luteinizing hormone): hóc-môn hoàng thể hoá

mFISH (multi-color flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang nhiều màu

NST: nhiễm sắc thể

PBS: phosphate buffered saline solution

SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn

SF medium (serum-free medium): môi trường không huyết thanh

α MEM: α -modifiedminimum essential medium

1 Các bảng

Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối

Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối

Bảng 4.1: Tỷ lệ thành công của 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối

Bảng 4.2: Số lượng các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển

Bảng 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian xuất hiện tế bào bám và tạo

cụm ở các phương pháp

Bảng 4.4: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (+) ở các

phương pháp

Bảng 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) của

các mẫu ối ở các phương pháp

Bảng 4.6: Thời gian nuôi cấy tế bào ối ở 3 phương pháp

Bảng 4.7: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) của các mẫu ối có

tuổi thai khác nhau

Bảng 4.8: Phân bố (%) số mẫu theo thời gian bám và tạo cụm của các

mẫu ối ở các nhóm có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau

Bảng 4.9: Số cụm NST trung bình trong một quang trường của các lô thí

nghiệm

Bảng 4.10: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các lô thí nghiệm

Bảng 4.11: Trung bình số cụm NST trong một quang trường theo liều

Bảng 4.12: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung ở các liều lượng

demecolcine khác nhau xử lý mẫu trong 60 phút

Bảng 4.13: Trung bình số cụm NST trong một quang trường ở các lô

theo thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml

Bảng 4.14: Phân bố (%) cụm NST theo độ bung của các lô thí nghiệm ở

các mức thời gian xử lý với liều demecolcine 0,25 µg/ml

68

69

70

2 Hình

Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm

Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối

Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau

Hình 4.1: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có nhiều tế bào

đang phân chia (100x)

Hình 4.2: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ dày mức độ

Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 và phương pháp 3

Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào

(200x)

Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau (200x)

Hình 4.8: Bộ NST vẫn còn tế bào chất tạo lớp mờ bao bọc bộ NST và độ

(200x)

66

3 Biểu đồ

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ thành công – thất bại ở 3 phương pháp

Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển

Biểu đồ 4.3: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức phát triển (++) ở các

phương pháp

Biểu đồ 4.4: Thời gian nuôi cấy ở 3 phương pháp

Biểu đồ 4.5: Phân bố (%) mẫu theo thời gian đạt mức (+) ở 2 nhóm tuổi thai

Biểu đồ 4.6: Phân bố (%) mẫu theo thời gian bám và tạo cụm ở các nhóm

có tình trạng lẫn máu mẹ khác nhau

Biểu đồ 4.7: Số cụm NST trung bình của các lô theo liều lượng

demecolcine và thời gian xử lý với chất này

Biểu đồ 4.8: Số cụm NST trung bình ở các lô theo theo thời gian xử lý với

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tế bào ối người

2.2 Nuôi cấy tế bào

2.3 Nuôi cấy tế bào ối người

2.4 Các kỹ thuật kiểm tra số lượng và cấu trúc NST

3.3 Thiết bị và hóa chất

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.5 Phương pháp toán học sử dụng trong nghiên cứu

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định phương pháp nuôi cấy hiệu quả

4.2 Bước đầu xác dịnh liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất

này khi tạo tiêu bản NST thai

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

5.2 Đề nghị

Công trình của tác giả đã công bố

Tài liệu tham khảo

Do đó tạo ra gánh nặng cho xã hội cũng như những rối loạn về tâm sinh lý khi trẻ trưởng thành Vì vậy cần hạn chế việc sinh ra những trẻ dị tật do bệnh lý NST ngay

từ trước khi sinh và đó là vai trò quan trọng của chẩn đoán tiền sản

Một trong những phương pháp chẩn đoán tiền sản khá phổ biến hiện nay là phân tích NST Phân tích NST cùng với khám, siêu âm theo dõi, làm các xét nghiệm cần thiết đã giúp xác định được đến 99,3% trong tổng số ca dị tật được phát hiện (số liệu tại bệnh viện Từ Dũ từ tháng 6/2000 đến tháng 6/2001) Đối với các trường hợp nghi ngờ thai nhi mang các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng NST, việc phân tích NST có thể được thực hiện qua chọc rút nước ối (chọc ối) sau đó nuôi cấy tế bào nước ối thai nhi, hoặc nuôi cấy tế bào lympho của máu đứa trẻ, sau đó dùng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (kỹ thuật FISH) hay nhuộm (nhuộm thường quy hoặc nhuộm băng) khảo sát NST đồ Đây là các xét nghiệm có ích lợi rất lớn, không những giúp chẩn đoán mà còn có thể giúp bác sĩ điều trị dự đoán khả năng bất thường đó xuất hiện lại ở những đứa con sau [2]

Xét nghiệm bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang cho kết quả nhanh hơn, chỉ mất khoảng 5 ngày – 1 tuần, tuy nhiên xét nghiệm này rất đắt tiền và chỉ khảo sát được bất thường về số luợng của cặp NST số 13, 18, 21 và cặp NST giới tính Khuynh hướng xét nghiệm sàng lọc trước sinh hiện nay ở nước ta đang nghiêng về

kỹ thuật nhuộm băng khảo sát NST đồ Kỹ thuật này cho phép khảo sát cả đột biến

số lượng và cấu trúc bộ NST của thai nhi với chi phí rẻ hơn khoảng 10-20% Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là mất thời gian khá lâu để có được kết quả, khoảng 2 – 2,5 tuần Bên cạnh đó việc tiến hành kỹ thuật này đến nay vẫn chưa cho kết quả ổn định, tỷ lệ nuôi cấy thành công và thời gian nuôi cấy tế bào chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ, phương pháp nuôi cấy

tế bào ối…Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask được dùng phổ biến hiện nay có thời gian nuôi cấy dài và tiêu hao hóa chất hơn và khi tạo tiêu bản NST

chưa cho nhiều cụm NST so với các phương pháp nuôi cấy in situ

Nhằm chọn ra phương pháp nuôi cấy tế bào ối vừa hiệu quả vừa tiết kiệm, đồng thời xem xét kỹ thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng

demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu bản NST thai”

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

(1) Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả

(2) Xác định liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này để

tạo tiêu bản NST tốt

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

Trung bình lượng dịch ối đo được tương đối cố định khoảng 207 ± 92 ml ở thai

16 tuần, 258 ± 97 ml ở thai 18 tuần, và 365 ± 88 ml ở thai 20 tuần Trong dịch ối người phát hiện được lượng lớn hóc-môn, bao gồm hóc-môn sinh trưởng GH, hóc-môn kích thích nang trứng FSH, hóc-môn hoàng thể hoá LH, kích dục tố màng đệm

Bộ chuyển đổi siêu âm

Thai

người hCG, hóc-môn tuyến giáp, insulin, glucagons, testosterone, progesterone, estradiol, và cortisone [13] Lượng dịch ối hiện diện đủ để tiến hành chọc ối bắt đầu vào tuần 14 của thai kỳ, hầu hết việc chọc ối được thực hiện giữa tuần 14 – 20 của thai kỳ Lơ lửng trong dịch ối là các tế bào của thai, chúng có thể phát triển trong nuôi cấy để phân tích NST, phân tích sinh hóa và sinh học phân tử [7]

2.1.2 Tế bào ối người

Năm 1966, Steele và Breg chứng minh được trong dịch ối người có chứa các tế bào sống, có khả năng sinh sản phát triển khi nuôi cấy đủ để làm tiêu bản NST [42] mặc dù các tế bào ối đã được đề nghị dùng để chẩn đoán phái tính và ngăn ngừa các bệnh lý di truyền liên kết với giới tính từ 1960 Trong các năm sau đó, tế bào ối được nuôi cấy để khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi cũng như chẩn đoán một số các bệnh biến dưỡng di truyền ở thai nhi [21], [29], [31], [44], [48] Dịch ối người chứa lượng tế bào thay đổi tùy theo thai kỳ, trung bình chỉ 20% tế bào tồn tại trong dịch ối ở thai 14-18 tuần [37] Tổng số lượng và tỷ lệ các tế bào quan sát được cũng khác nhau giữa các thai phụ khác nhau có cùng thời gian thai

kỳ Số tế bào ở dịch ối ở 3 tháng giữa thai kỳ khoảng 10 – 1000 tế bào/µl Mức dao động còn lớn hơn khi xét các thai có các biểu hiện bệnh lý [23] Mặt khác, số lượng

tế bào của thai hiện diện trong dịch ối tăng theo tuổi thai, nhưng thai kỳ tăng cũng làm tăng lượng tế bào không có khả năng phát triển Những mẫu lấy ở thai 12 tuần

có thể có ít tế bào nhận được sau khi ly tâm, nhưng lượng lớn trong số chúng có khả năng phát triển Dù những mẫu dịch ối 20 tuần sau ly tâm có thể cho nhiều cặn tế bào, nhưng đa số chúng là tế bào chết [39] Các tế bào ối người khác nhau về nguồn gốc, hình dạng, kích thước, tỷ lệ nhân/tế bào chất, đặc điểm tế bào chất, thuộc tính

bề mặt tế bào và đặc điểm sinh hoá [15] Một loạt các nghiên cứu được thực hiện từ những năm 1980 phát hiện trong dịch ối người có các tế bào của cả 3 lớp mầm - ngoại bì, trung bì và nội bì - tùy theo tuổi thai và tình trạng bệnh lý của thai Tuy

nhiên nguồn gốc phôi thai của từng loại tế bào trong dịch ối vẫn chưa được biết rõ [10]

Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối (nguồn

http://jon.visick.faculty.noctrl.edu/120/slides/slides17.pdf)

Năm 1980, khi thực hiện các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối, người ta dựa vào hình thái chia các tế bào nuôi cấy từ dịch ối làm 2 loại, tế bào dạng biểu mô và tế bào dạng sợi Nhóm nghiên cứu của Namba và Hyodo (1980) tiến hành nuôi cấy dài ngày (nuôi cấy 7 tháng) cho thấy tế bào sợi dễ dàng cấy chuyền, và tối đa được khoảng 30 lần (nuôi cấy 150 ngày), trong khi tế bào biểu mô khó cấy chuyền và tối

đa chỉ 2 đến 5 lần Sau 6 tháng nuôi cấy, hầu hết tế bào phát triển trong nuôi cấy là

tế bào biểu mô Về hình thái, quan sát được 2 loại tế bào, loại Golgi và loại hình sợi Các tế bào loại Golgi có nhiều vi nhung mao, nhiều túi không bào trong bào chất và một phức hợp Golgi phát triển tốt biểu lộ chức năng tiết [30] Bổ sung cho quan sát của nhóm tác giả Namba, tác giả Bossolasco và cộng sự (2006) đã mô tả 3 dạng tế bào: tế bào giống biểu mô kích thước nhỏ, dạng tế bào lớn có bờ và phồng

Rút dịch ối (1)

(1)

Ly tâm (2) Nhau thai

Vách tử cung

Thành phần dịch

Khoang ối

Nghiên cứu sinh hóa và NST (4) Nuôi cấy tế bào (3)

Tế bào

không đều, thỉnh thoảng có 2 nhân hay có tỷ lệ nhân/tế bào chất cao, và dạng nguyên bào sợi [10]

Chỉ lượng nhỏ tế bào trong dịch ối có khả năng phát triển và sinh sản trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cho mục đích chẩn đoán, mặt khác có thể nhiều tế bào ối đặc biệt vẫn sống nhưng không sinh sản hay hình thành cụm do chu

kỳ tế bào đã ngừng, hoặc ở trạng thái biệt hóa hay do tế bào quá già Vì lý do đó, thời gian sau này, Kaviani và đồng sự (2001) khi phân loại các tế bào nuôi cấy từ dịch ối đã xét đến các khía cạnh bao gồm kiểu hình, tiêu chuẩn sinh hóa và đặc điểm phát triển, họ đã phân loại các tế bào ối phát triển được và hình thành cụm trong điều kiện nuôi cấy thông thường thành 3 nhóm chính [23]: tế bào dạng biểu

mô (epitheloid - loại E), tế bào đặc trưng của dịch ối (amniotic fluid specific - loại AF) và tế bào dạng nguyên bào sợi (fibroblastic - loại F) Tế bào loại AF và E xuất hiện ngay từ khi bắt đầu nuôi cấy Tế bào loại AF vẫn tiếp tục tồn tại trong suốt quá trình nuôi trong khi loại E giảm đáng kể Tế bào loại F không hình thành cụm trong mỗi mẫu ối, chúng thường xuất hiện trễ hơn trong quá trình nuôi cấy Mặc dù người

ta tin rằng vẫn còn nhiều điều chưa biết về nguồn gốc của 3 loại tế bào, tế bào loại E được cho rằng có nguồn gốc từ da và nước tiểu của thai, tế bào AF từ màng thai và

lá nuôi phôi, còn tế bào loại F từ mô sợi liên kết và nguyên bào sợi của da Tế bào

AF sản xuất estrogen, hCG và progesterone Điều này gợi ra giả thiết là các tế bào này có nguồn gốc từ mô lá nuôi phôi Dựa vào việc không sản xuất hóc-môn, các tế bào F được coi là có nguồn gốc từ trung mô [47] Tế bào biểu mô ối cấu thành lớp trong của màng ối, và được hình thành từ nguyên bào ối vào ngày thứ 8 sau thụ tinh, chúng từ lâu được cho rằng không để lộ rõ tiềm năng biệt hóa thành các loại cơ quan khác nhau, bao gồm tim, gan và não Đáng chú ý, tế bào biểu mô ối được chứng minh biểu hiện chỉ thị của tế bào nguồn gốc thần kinh và tế bào thần kinh đệm [35]

Tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ dịch ối đã được phân lập từ dịch ối thu vào 3 tháng giữa thai kỳ nhờ quy trình nuôi cấy 2 giai đoạn do nhóm tác giả Tsai

(Đài Loan) phát triển vào năm 2004 - 2005 [46], [47] Bên cạnh đó, dịch ối còn chứa các tế bào gốc biểu hiện tiềm năng nhiều dòng, khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tạo xương, tạo máu, biểu hiện kiểu hình của tế bào nguồn gốc thần kinh và có khả năng tạo van tim [10], [40], [46]

2.2 NUÔI CẤY TẾ BÀO

Trong phòng thí nghiệm, có 3 cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật, đó là nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy mô phát triển sơ cấp và nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào được

chia thành nuôi cấy in vitro (trong phòng thí nghiệm) và nuôi cấy in vivo (trong cơ thể sống) Một số khác biệt của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro so với in

vivo:

- Tập tính tế bào: tế bào nuôi cấy in vitro chuyển từ sự kết hợp theo dạng

không gian ba chiều sang mặt phẳng hai chiều, không còn đặc tính tương tác tế bào chuyên biệt của mô Vì khi dòng tế bào hình thành nó chỉ thể hiện một hay hai dạng

tế bào, nên nhiều tương tác đa chiều bị mất đi

- Tính ổn định và được kiểm soát của quá trình chuyển hóa: trong tế bào nuôi

cấy in vitro, chuyển hóa của tế bào ổn định hơn do thiếu sự kiểm soát của sự điều hòa in vivo của các chất dẫn truyền thần kinh và hệ nội tiết [7]

Khoảng 50 năm sau khi thuyết Tế bào ra đời, các kỹ thuật nuôi cấy tế bào bắt đầu phát triển Một số sự kiện đáng chú ý trong lịch sử phát triển nuôi cấy tế bào [6]:

- Năm 1907, Harrison sử dụng kỹ thuật “giọt treo” (hanging drop) nuôi 1 mẫu phôi ếch trong 1 giọt dịch bạch huyết, quan sát sự phát triển các tế bào thần kinh

- Năm 1912, bác sĩ Carrel đưa các kỹ thuật vô trùng vào nuôi cấy tế bào và sáng chế ra bình Carrel, tiền thân các bình nuôi cấy ngày nay

- Năm 1902, lần đầu tiên việc nuôi cấy tế bào thực vật được thực hiện do nhà thực vật học Harberlandt tiến hành

- Đặc biệt, vào năm 1948, Sanford và cộng sự cho rằng các tế bào đơn có thể phát triển trong môi trường dịch nuôi; và Eagle (1955) khẳng định hỗn hợp các axit amin, vitamin, các co-factor, carbonhydrat, muối và bổ sung thêm huyết thanh có thể dùng nuôi cấy tế bào, thay thế các dịch chiết mô phức tạp, điều này đã mở ra

thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào in vitro [7]

Các điều kiện khi nuôi cấy tế bào in vitro:

- Môi trường nuôi với các thành phần hóa học xác định: nhiều công thức môi trường nuôi khác nhau được phát triển cho phù hợp với nhu cầu các loại tế bào khác nhau Các môi trường nuôi thường bao gồm các chất như carbohydrat, axit amin, vitamin, hóc-môn, các nhân tố tăng trưởng, các nguyên tố vi lượng, muối với nồng

độ đẳng trương và hệ đệm để ổn định pH Đa số môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều cần bổ sung huyết thanh Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở dạng hòa tan như fibronectin, vì thế ngoài tác dụng bổ sung thêm chất dinh dưỡng, cung cấp các nguyên tố vi lượng, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng, huyết thanh còn có tác dụng giúp các tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôi

- Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở nhiệt độ ấm (36-390C) Mặt khác, môi trường cần được thông khí liên tục đủ đáp ứng nhu cầu chuyển hóa thông thường của tế bào hiếu khí, đặc biệt là tỷ lệ của O2,

CO2, N2 cần được phối trộn để tạo ra các phân áp khí thích hợp cho từng loại tế bào Nồng độ CO2 trong tủ cấy thường là 5%

- Sự vô trùng: tế bào động vật có tốc độ phân chia chậm nên chúng dễ dàng bị lấn áp bởi các sinh vật ngoại nhiễm, do đó sự vô trùng là yếu tố cực kỳ quan trọng trong nuôi cấy tế bào động vật Khi pha môi trường, tùy tính chất hóa học các thành phần của môi trường để chọn cách khử trùng thích hợp Bên cạnh đó, môi trường cần được bảo vệ chống lại các tạp nhiễm không mong muốn bằng việc sử dụng các kháng sinh [7]

2.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

2.3.1 Đặc điểm

Việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối cho chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh đến cuối thế kỷ XX Đến đầu thế kỷ XXI, với việc phát hiện nguồn tế bào gốc trong dịch ối, các nghiên cứu về nuôi cấy tế bào ối thời gian gần đây chủ yếu theo hướng khảo sát xác định thành phần và phân lập các loại tế bào gốc nhiều tiềm năng trong dịch ối, phục vụ cho y sinh học Chiều hướng này đặc biệt phát triển kể từ khi xuất hiện quy trình nuôi cấy 2 giai đoạn (Tsai, 2005) [46], [47] Các yếu tố có thể tác động tới việc nuôi cấy tế bào ối [13], [53], [55] bao gồm:

- Tình trạng dịch ối: tế bào ối có thể được lưu trữ khi cần ít nhất 2 ngày ở nhiệt

độ phòng hay tủ lạnh mà không gây giảm khả năng phát triển

- Tình trạng lẫn máu mẹ: tác động của dịch ối nhiễm máu ảnh hưởng đến thời gian cấy nhiều hơn so với tỷ lệ thành công/thất bại khi nuôi cấy

- Lượng dịch ối ít nhất cần cho nuôi cấy: để nhận được kết quả đáng tin thì lượng dịch ối tối thiểu cần là 3,2ml

- Áp lực oxy trong suốt quá trình nuôi cấy: giảm áp lực oxy trong suốt quá trình nuôi cấy làm tăng 2,5 lần số tế bào trong 1 cụm nhưng chỉ làm tăng nhẹ số cụm

- Nồng độ FBS: 20% là nồng độ FBS tốt nhất cho sự phát triển của tế bào nuôi

cấy Nồng độ cao của FBS có thể gia tăng khả năng bị nhiễm, từ đó tăng nguy cơ xuất hiện bất thường NST cho tế bào ối nuôi cấy

- Đặc điểm môi trường nuôi cấy: mỗi loại môi trường có hàm lượng các chất dinh dưỡng khác nhau do đó làm ảnh hưởng đến thời gian và hiệu quả nuôi cấy

- Sự có mặt các nhân tố sinh trưởng, ví dụ như transferrin, selenium, insulin, triiodothyronine, glucagon, nhân tố phát triển nguyên bào sợi, hydrocortisone, testosterone, estradiol, progesterone Mỗi nhân tố sinh trưởng kích thích sự phát triển 20-76%, với sự kết hợp từ 2-10 yếu tố, sự phát triển có thể tăng lên 48-213%

2.3.2 Giới thiệu một số phương pháp nuôi cấy tế bào ối

Có 2 phương pháp nuôi cấy tế bào ối chính, đó là nuôi cấy bằng bình cấy flask

và nuôi cấy in situ Trong đó nuôi cấy in situ gồm phương pháp nuôi cấy trên lá

kính đặt trong đĩa cấy (đĩa petri) hoặc nuôi cấy trên slide flask (flaskette)

Nuôi cấy tế bào ối trên bình cấy flask là phương pháp được thực hiện sớm nhất, tuy nhiên phương pháp này cần thời gian nuôi cấy dài (trước đây thời gian nuôi cấy

là 2-3 tuần) và lượng môi trường sử dụng lớn (4-5ml) Nhu cầu thực hiện nuôi cấy

tế bào ối nhanh chóng cho mục đích chẩn đoán dẫn đến kết quả ra đời các bình cấy

và môi trường nuôi cấy mới [49]

Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên slide flask (flaskette) được ứng dụng

rộng rãi trong đầu những năm 1980 [13], [57] Với dụng cụ nuôi cấy mới, quy trình nuôi cấy và thu hoạch cũng có thay đổi, thể hiện ưu điểm của phương pháp này, trong đó rõ nhất ở việc giảm thể tích môi trường sử dụng (khoảng 2ml) và rút ngắn thời gian xử lý thu hoạch mẫu tạo tiêu bản NST Khi thu hoạch tại chỗ, lượng cụm NST kỳ giữa bị mất đi sẽ giảm đáng kể so với thu hoạch tế bào huyền phù, do đó số cụm NST có được để khảo sát số lượng và cấu trúc NST tăng lên Cùng với sự phát triển các môi trường nuôi cấy mới, slide flask góp phần rút ngắn thời gian nuôi cấy

từ 2-3 tuần xuống còn từ 1 tuần đến 10 ngày [49] Tuy nhiên giá thành slide flask cao hơn nhiều so với bình cấy thông thường nên thời gian sau đó, các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm các dụng cụ nuôi cấy mới rẻ tiền và có nhiều ưu điểm hơn, phục vụ cho các mục đích nuôi cấy khác nhau

Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên giá thể lá kính trong đĩa petri được

sử dụng từ những năm 90 của thế kỷ XX và vẫn được sử dụng rộng rãi trên thế giới cho đến nay Tế bào huyền phù được đặt lên lá kính, cho bám qua đêm hoặc lâu hơn (tùy quy trình nuôi cấy), sau đó lá kính được làm ngập bằng môi trường nuôi cấy Các tế bào bám và phát triển thành cụm trên bề mặt lá kính Thời gian nuôi cấy tế bào ối bằng phương pháp này khoảng 10-12 ngày Bên cạnh các ưu điểm của nuôi

cấy in situ, phương pháp này còn có nhiều ưu điểm (Liang và cộng sự, 2008) [26]

như cho tỷ lệ thành công cao, thời gian nuôi cấy ngắn, dùng cho dịch ối từ thai tuổi lớn, dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm và giảm thể tích môi trường sử dụng Tuy nhiên khi ứng dụng thực tế, chưa có quy trình thống nhất cho phương pháp này, các quy trình nuôi cấy được thực hiện khác nhau tùy cơ sở nghiên cứu, do đó thời gian cũng như hiệu quả nuôi cấy cũng rất biến động [24], [26]

2.4 CÁC KỸ THUẬT KIỂM TRA SỐ LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC NST 2.4.1 Kỹ thuật NST đồ (Karyotyping technique)

2.4.1.1 Đặc điểm

NST đồ (kiểu nhân – karyotype) là một tập hợp hoàn chỉnh tất cả các NST của một tế bào ở bất kỳ sinh vật nào Các NST này được sắp xếp và thể hiện với định dạng chuẩn theo từng cặp, có thứ tự theo kích thước và sự định vị của tâm động

Kỹ thuật NST đồ là quá trình sắp xếp và phân cặp tất cả các NST của một cơ thể NST đồ được chuẩn bị bằng cách sử dụng các quy trình nhuộm chuẩn làm bộc

lộ cấu trúc đặc trưng của mỗi NST Các nhà di truyền học lâm sàng phân tích NST

đồ người để khám phá những thay đổi di truyền lớn như bất thường bao gồm nhiều cặp base hay nhiều DNA NST đồ cũng có thể phát hiện các thay đổi số lượng NST liên quan đến các đột biến lệch bội Phân tích kỹ NST đồ cũng có thể phát hiện nhiều thay đổi cấu trúc khó nhận diện như mất đoạn, chuyển đoạn, đảo đoạn hay lặp đoạn trên toàn NST [32] Kỹ thuật làm NST đồ sử dụng dịch ối hay gai nhau thường được dùng trong chẩn đoán tiền sản (đặc biệt cho chọc ối chẩn đoán bệnh Down), điều tra các trường hợp sẩy thai liên tiếp hay tìm kiếm nguyên nhân gây hiện tượng hình dạng bất thường, chậm phát triển trí tuệ hay nghiên cứu các bất thường về hành vi hay phân loại bệnh bạch cầu, u bạch huyết và các loại u bướu để chẩn đoán chính xác, xác định cách điều trị

Quá trình tạo NST đồ bắt đầu bằng giai đoạn nuôi cấy các tế bào mẫu xét nghiệm; các tế bào từ mẫu máu, tuỷ xương, dịch ối hay khối u được nuôi cấy khoảng 4-7 ngày Sau khi tế bào phát triển và nhân lên, phân chia tế bào bị làm ngưng lại bằng cách thêm colchicine, chất làm phá hủy thoi phân bào Tế bào sau

đó được xử lý tiếp tục với dung dịch nhược trương làm cho nhân phồng lên và tế bào vỡ ra Nhân sau đó được xử lý với chất cố định, thường là dung dịch carnoy (3 methanol: 1 acid acetic), nhỏ lên phiến kính và xử lý với các thuốc nhuộm giúp phát hiện các đặc điểm cấu trúc của NST

2.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ

Chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ được đánh giá dựa trên các chỉ tiêu bao gồm số cụm NST kỳ giữa và chất lượng cụm NST kỳ giữa Trong đó, chất lượng cụm NST được đánh giá dựa trên độ sạch (mức độ còn sót lại của tế bào chất và màng trong cụm NST), và độ bung của cụm NST

Hliscs và cộng sự (1997) khẳng định quá trình bung của NST là quá trình diễn ra chậm làm duỗi căng NST [19] Quá trình bung bao gồm sự phồng lên đáng kể do nước gây ra ở tế bào nguyên phân trong khi chất cố định bay hơi khỏi bề mặt phiến

kính [16] Mức độ bung của NST tế bào ối nuôi cấy thứ cấp hay nuôi cấy sơ cấp in

situ đều phụ thuộc nhiều yếu tố, trong số đó thời gian bay hơi của chất cố định được

coi là quan trọng nhất Thời gian bay hơi phụ thuộc thành phần của chất cố định, độ

ẩm tương đối, sức gió và nhiệt độ xung quanh (Spurbeck và cộng sự, 1996) [41], 2 yếu tố cuối có thể được điều khiển bởi việc sử dụng phòng đặc biệt điều chỉnh tiểu khí hậu [27] hay phòng thu hoạch NST (chromosome harvest chamber) Trong đó,

khi thu hoạch in situ, nhiệt độ xung quanh không ảnh hưởng chất lượng cụm NST

(Raddatz, 2005) Tuy nhiên các yếu tố nói trên chỉ tác động một cách giới hạn Trong giới hạn cho phép, các điều kiện này không phải yếu tố quyết định [54]

2.4.2 Kỹ thuật hiện băng (Banding techniques)

Kỹ thuật hiện băng (nhuộm phân hóa) do T.H.Hu (1969) nêu ra bao gồm các phương pháp, kỹ thuật nhuộm màu hiện đại đối với NST, làm nổi rõ các băng Băng

được xem là từng phần của NST bắt màu đậm hơn hoặc sáng hơn các phần kề bên

do tác dụng của các loại thuốc nhuộm khác nhau, tạo ra các giới hạn để phân biệt đặc thù sai khác giữa các NST, đặc biệt khi dùng để phân biệt các NST giống nhau

Các kỹ thuật hiện băng phổ biến hiện nay là hiện băng Q, G, R, C Mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm riêng, cùng với nhau các kỹ thuật hiện băng cung cấp cho nhà di truyền học một kho các phương tiện nhuộm màu cho chẩn đoán bất thường NST [32]

Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau Nhuộm giemsa (a), hiện băng Q (b), hiện băng R (c), và hiện băng C [32]

2.5 DEMECOLCINE

2.5.1 Đặc tính

Demecolcine (ColcemidTM), hoặc colcemid, được sản xuất từ năm 1972-1973 và

được phân lập từ Colchicum autumnale L (nghệ tây thu)

Demecolcine có liên quan mật thiết với alkaloid colchicine tự nhiên, với sự thay thế nhóm acetyl trên amin bằng methyl, nhưng ít gây độc hơn Demecolcine tan trong rượu, chloroform và DMSO đến 10mg/ml Demecolcine có tác dụng ngăn cản trùng hợp vi ống bằng cách liên kết với tubulin ở cực dương [52], gây giải trùng hợp vi ống, ức chế nguyên phân gây đồng bộ hóa các tế bào ở kỳ giữa, ngăn cản sự tách tâm động trong phân bào, ức chế sự di cư tế bào, hỗ trợ khoét nhân noãn trong

kỹ thuật chuyển nhân tạo dòng phôi vô tính và kích thích sự phát triển của phôi sau chuyển nhân Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng cho thấy xử lý với demecolcine làm tăng tỷ lệ bất thường NST trong phân bào [36]

2.5.2 Cơ chế tác dụng

Demecolcine tác động lên sự phân bố “phức hợp thúc đẩy kỳ sau” Promoting Complex – APC) là phức hợp protein gồm nhiều tiểu phần quan trọng cho điều hòa chu kỳ tế bào, thông qua đó tác động làm ngưng tế bào ở pha S hay G,

(Anaphase-Demecolcine (N-Deacetyl-N-methylcolchicine C21H25NO5) [56]

ngăn cản sự tách tâm động (Castro và cộng sự, 2005 [12], Chau và cộng sự, 1989 [14], Peters, 2002 [34])

Demecolcine là gây giải trùng hợp vi ống bằng 2 cơ chế phân biệt Vi ống có cấu trúc phân cực với cực dương và cực âm, thường cực âm được giữ chặt với tâm động trong tế bào động vật [45] Demecolcine ngăn cản trùng hợp vi ống bằng cách liên kết với tubulin ở cực dương [52].Với nồng độ rất thấp nó liên kết với tubulin ở cực dương và không cho phép cộng thêm các nguyên sợi, ngăn chặn động học vi ống [22], [25], do đó liên quan đến khả năng demecolcine ức chế sự trùng hợp các nhị hợp tubulin, ức chế sự tạo thoi vô sắc mà không gây một tác động đáng kể nào lên đặc tính sinh hóa của tế bào nguyên phân Các nghiên cứu gần đây phát hiện demecolcine nồng độ cao có thể kích thích tháo gỡ cực mang điện âm của vi ống gây giải trùng hợp theo thời gian, gây độc cho tế bào (Yang và cộng sự, 2010) [50]

Khác với colchicine,demecolcine liên kết với tubulin nhanh và thuận nghịch, ở

370C tỷ lệ liên kết không đổi cho demecolcine là 1,88x106mol/giờ, khoảng 10 lần cao hơn colchicine Điều này được phản ánh trong năng lượng hoạt hóa cho liên kết demecolcine và tubulin là 51,4kJ/mol, và 84,8kJ/mol cho colchicine Sự phá vỡ liên kết của demecolcine cũng nhanh hơn colchicine Đặc tính này của demecolcine làm nó trở thành nhân tố ức chế phân bào của tế bào nuôi cấy cấp cao hơn colchicine [36]

Trên tubulin có 2 vùng có ái lực với demecolcine và colchicine, vùng ái lực cao liên kết được với cả demecolcine và colchicine, vùng ái lực thấp chỉ tạo liên kết với demecolcine Tương tự colchicine, liên kết demecolcine với tubulin được kích thích bởi ion âm có sẳn (ion sulfate và tartrate) nhưng với cơ chế khác nhau Ái lực liên kết demecolcine ở vùng ái lực thấp của tubulin tăng khi có sự hiện diện của ion âm sulfate hay tartrate và bị cải biến thành ái lực cao Tuy vậy, colchicine không nhận biết được vùng ái lực cao được cải biến nhờ sulfate

Demecolcine còn được dùng nhiều trong hóa trị và nghiên cứu di truyền tế bào

Về mặt y học demecolcine làm tăng kết quả xạ trị ung thư bằng cách đồng bộ hóa các tế bào khối u ở kỳ giữa, giai đoạn nhạy cảm với bức xạ trong chu kỳ tế bào [25], [56]

Xử lý mô phôi chuột nuôi cấy sơ cấp trên lá kính bằng demecolcine cho thấy chất này có tác dụng kích thích tổng hợp DNA, và gây ra các thay đổi được đánh dấu trong kỳ trung gian Các vùng cố định của bề mặt tế bào biến mất dẫn đến sự hoạt hóa bất thường của các phần bề mặt tế bào, ức chế di cư tế bào Demecolcine cũng tác động mạnh đến sự tổng hợp DNA trong tế bào khi nuôi cấy mật độ dày [17]

Một vài nghiên cứu cho thấy khả năng đáp ứng với demecolcine khác nhau giữa

tế bào thường và tế bào khối u Chỉ số phân bào trong nuôi cấy dòng tế bào khối u người bắt đầu tăng ngay khi thêm thuốc, nhưng với dòng tế bào bình thường, chỉ số phân bào không tăng trong 2-3 giờ sau khi thêm colcemid [28]

2.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

2.6.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, việc chọc ối được thực hiện từ những năm 1930 để phục vụ chẩn đoán các bất thường di truyền của thai nhi Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối cho chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh vào nửa cuối thế kỷ XX

Năm 1966, Steele và Breg chứng minh nước ối ở người có chứa một số tế bào còn sống, các tế bào này nếu cấy sẽ có khả năng sinh sản, phát triển với lượng đủ để làm tiêu bản nhiễm sắc thể Những năm sau đó, tế bào nước ối được lấy để cấy và khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi và chẩn đoán một số các bệnh biến dưỡng di truyền ở thai nhi [9]

Năm 1983, Tabor, Lind và các cộng sự (Đan Mạch) đăng bài báo về một loại phương tiện nuôi cấy tế bào ối mới, gọi là flaskette, giúp thu hoạch và chuẩn bị tiêu bản NST nhanh hơn so với nuôi bằng bình cấy thông thường [57]

Zheng và cộng sự (2002) khi tìm kiếm phương pháp nuôi cấy làm tăng tỷ lệ

thành công khi nuôi cấy tế bào ối đã tiến hành khảo sát việc nuôi cấy trên in situ

flask Kết quả nhận được tỷ lệ thành công là 100%, khả năng phân tích NST đồ tốt [51]

Raddatz và các cộng sự (2005) đã báo cáo một chuỗi nghiên cứu về các yếu tố

đến quá trình nuôi cấy và thu hoạch in situ tế bào ối và gai nhau, bao gồm đánh giá

tác động của thể tích dịch ối, loại môi trường lên thời gian và số cụm tế bào trong nuôi cấy sơ cấp, và đánh giá ảnh hưởng của chất kiềm hãm, nhiệt độ, độ ẩm và tốc

độ lưu thông khí lên chất lượng cụm NST kỳ giữa thu hoạch từ tế bào ối và gai nhau nuôi cấy sơ cấp [53], [54], [55]

Pan và cộng sự (2006) khảo sát hiệu quả của phương pháp nuôi cấy và thu

hoạch in situ các tế bào ối để chẩn đoán tiền sản, kết quả phương pháp mới cho tỷ lệ

nuôi cấy thành công là 100% và cụm NST tốt hơn phương pháp truyền thống [33] Sun và cộng sự (2007) nghiên cứu làm tăng tỷ lệ thành công khi nuôi cấy bằng cách thay môi trường nếu có sai sót trong khi thu nhận tế bào ối nuôi cấy và tách tế bào ối khỏi các dịch ối bất thường cùng với xử lý bằng chất kháng sinh đúng lúc khi bình cấy bị nhiễm [43]

Liang và cộng sự (2008) khảo sát kết quả nuôi cấy tế bào ối bằng phương pháp

và lượng dịch ối khác nhau Nghiên cứu tiến hành trên 155 mẫu dịch ối nuôi cấy in

situ trên lá kính và bình cấy, kết quả cho thấy nuôi cấy in situ trên lá kính cho kết

quả tốt hơn, đồng thời không có sự khác biệt kết quả khi dùng 15-20 ml hay 6-8ml dịch ối [26]

Cao và cộng sự (2008) phân tích NST đồ và khảo sát khả năng ứng dụng của chúng trong chẩn đoán tiền sản, nhóm tác giả đã dùng 104 mẫu dịch ối từ thai 16-29

tuần, kết quả nuôi cấy thành công 103/104 trường hợp (99,0%), trong đó thành công khi nuôi cấy lần đầu là 98/104 (94,2%) [11]

2.6.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Mặc dù thủ thuật chọc ối đã được thực hiện từ những năm 1970 ở các bệnh viện phụ sản để chẩn đoán trước sinh, nhưng các nghiên cứu về tế bào ối ở nước ta vẫn còn rất ít Hầu hết các nghiên cứu có liên quan đến nuôi cấy tế bào ối ở nước ta được thực hiện ở các bệnh viện, phục vụ cho chẩn đoán và sàng lọc trước sinh Trong thời gian gần đây có các nghiên cứu như:

- Từ tháng 3/1999 đến tháng 12/2003, Phùng Như Toàn ở Phòng Di truyền của bệnh viện Từ Dũ TP HCM đã khảo sát và phân tích NST đồ của thai nhi qua nuôi cấy tế bào ối của 305 trường hợp Kết quả cho thấy phân tích NST đồ của thai nhi kết hợp với các kỹ thuật khác trong đánh giá sự phát triển của thai nhi rất hữu ích cho công tác chẩn đoán trước sinh và giúp tư vấn di truyền được tốt hơn [8]

- Hoàng Thị Ngọc Lan và cộng sự (2004) nghiên cứu “Phân tích NST của tế bào ối nuôi cấy có đối chiếu với kết quả của siêu âm thai và sàng lọc trước sinh” với

75 mẫu dịch ối từ tuần thai thứ 14 được nuôi cấy theo phương pháp hở, dài ngày Kết quả cho thấy phân tích NST trong tế bào ối nuôi cấy, giúp phát hiện những rối loạn về số lượng và cấu trúc NST, làm cơ sở cho tư vấn di truyền nhằm loại bỏ thai

dị tật [5]

Nhìn chung, các cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam đã có những thành công bước đầu trong việc nuôi cấy tế bào ối nhằm mục đích kiểm tra tế bào học và chẩn đoán tiền sản Kết quả cho thấy xử lý hiện băng các tế bào sau nuôi cấy cho kết quả có tính chính xác và hiệu quả chẩn đoán rất cao, vì vậy phương pháp này thường được dùng để kiểm chứng cho kết quả các phương pháp chẩn đoán tiền sản khác Trong

đó phương pháp nuôi cấy chủ yếu được dùng là phương pháp 1 Tuy nhiên, do thời gian nuôi cấy tương đối dài và chất lượng tiêu bản NST chưa cao, nên việc nuôi cấy

tế bào ối ở nước ta chưa phát triển mạnh Do đó, hiện nay việc xác định được

phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả và kỹ thuật xử lý thu hoạch được tiêu bản NST tốt là rất thiết thực đối với sự phát triển của lĩnh vực chăm sóc sức khỏe ở Việt Nam

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN

Đối tượng nghiên cứu là 49 mẫu dịch ối được nuôi cấy từ 3/2010 đến 10/2010 Các mẫu dịch ối được sử dụng là các mẫu có thể tích tối thiểu 6 ml, điều kiện là không xảy ra tình trạng cúp điện trong suốt quá trình nuôi cấy

Địa điểm thực hiện: Phòng Di truyền bệnh viện Phụ sản Từ Dũ Tp HCM

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

(1) Nội dung 1: Khảo sát hiệu quả 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối và xem xét ảnh hưởng của các điều kiện mẫu (tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ) tới hiệu quả nuôi cấy ối

- Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask (phương pháp 1)

- Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên slide flask (phương pháp 2)

- Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên giá thể lá kính đặt trong đĩa

- Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý bằng liều demecolcine 0,25 µg/ml

ở các mức thời gian khác nhau

3.3 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị dùng trong đề tài gồm ống ly tâm, phiến kính, lá kính 22x22mm, micro pipette 100µl cùng đầu hút tương ứng, kính hiển vi quang học, bệ sấy tiêu bản, tủ sấy Dụng cụ cơ bản là tủ nuôi cấy tế bào, tủ ấm 370C, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi đảo ngược, bình cấy flask 25ml, đĩa petri 55mm, slide flask (chamber slide, flaskette) (NuncTM)

3.3.2 Chuẩn bị hóa chất

 Hóa chất dùng nuôi cấy tế bào

- AmnioMaxTM C100 Basal Medium (GIBCO)

- AmnioMaxTM Supplement (GIBCO)

- Fetal bovine serum (FBS) (GIBCO)

- Antibiotic – Antimycotic (GIBCOTM)

Môi trường nuôi cấy được pha theo thể tích: 90ml AmnioMaxTM C100, 15ml AmnioMaxTM Supplement, 20ml FBS và 1ml Antibiotic – Antimycotic

 Chuẩn bị hóa chất dùng thu hoạch và nhuộm băng NST

- Demecolcine (10µg/ml) (Sigma)

- Trypsin –EDTA 0,25% (GIBCO)

- NaCl 0,09%

- KCl 0,075M (5,6g KCl pha với nước cất thành 1000ml dung dịch)

- Hỗn hợp dung dịch sốc nhược trương (dung dịch 0,6% sodium citrate

C6H5Na3O7.2H2O và dung dịch KCl 0,075M tỷ lệ 6:4)

- Dung dich cố định carnoy (methanol:acetic acid tỷ lệ 3:1)

- Dung dịch PBS (phosphate buffered saline) dự trữ pha với lượng 40g NaCl, 1g KCl, 4,6g Na2HPO4, 1g KH2PO4 và 500ml nước cất Khi sử dụng, PBS dự trữ được pha loãng với tỷ lệ 1ml PBS: 9ml nước cất

- Trypsin pha dự trữ với tỷ lệ 350mg trypsin: 70ml PBS, được chia thành các ống 5ml cất giữ ở 4oC Trước khi nhuộm, trypsin được ủ ở 37oC, sau đó pha theo thể tích 5ml trypsin: 45ml PBS Trong quá trình nhuộm, giữ lọ trypsin ở bể ủ 37oC

- Dung dịch đệm pH 6,8 (9g KH2PO4 và 11g Na2HPO4 pha với 1000ml nước cất)

- Giemsa (MERCK): pha 1ml giemsa pha với 9ml dung dịch đệm pH 6,8

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hai nội dung nghiên cứu được tiến hành song song nhau

3.4.1 Khảo sát hiệu quả 3 phương pháp nuôi cấy tế bào ối và xem xét ảnh hưởng của các điều kiện mẫu tới hiệu quả nuôi cấy ối

3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu: 49 mẫu ối thí nghiệm, mỗi mẫu có 6ml dịch ối

và được chia đều cho 3 phương pháp, mỗi phương pháp sử dụng 2ml dịch ối Mỗi 2ml dịch ối được chứa riêng trong 1 ống ly tâm, ly tâm 2000vòng/3 phút

- Phương pháp 1: nuôi cấy trong bình cấy flask

- Phương pháp 2: nuôi cấy in situ trên slide flask

- Phương pháp 3: nuôi cấy in situ trên giá thể lá kính trong đĩa petri

Do một số khó khăn về cơ sở vật chất nên chỉ thực hiện được 45/49 mẫu nuôi cấy bằng phương pháp 2

 Thu thập thông tin về mẫu bao gồm tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ Các thông tin đó được phân thành các nhóm

- Theo tình trạng lẫn máu mẹ:

 Nhóm không lẫn máu mẹ

 Nhóm ít lẫn máu mẹ (sau khi ly tâm các tế bào hồng cầu lắng xuống

chiếm <30% cặn tế bào)

 Nhóm lẫn máu mẹ mức trung bình (sau khi ly tâm các tế bào hồng cầu

lắng xuống chiếm 30% - 60% cặn tế bào)

 Nhóm lẫn nhiều máu mẹ (sau khi ly tâm các tế bào hồng cầu lắng xuống

chiếm > 60% cặn tế bào)

Bảng 3.1: Phân bố theo tình trạng lẫn máu mẹ của các mẫu ối

- Theo tuổi thai:

 Nhóm thai dưới 20 tuần tuổi

 Nhóm thai từ 21-25 tuần tuổi

Bảng 3.2: Tuổi thai của các mẫu vào thời điểm chọc ối

Tuổi thai

Phương pháp Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3

3.4.1.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào

 Phương pháp 1 [39]: Nuôi cấy trong bình cấy flask

- Chuẩn bị sẳn bình cấy flask ghi thông tin mã số mẫu, ngày cấy, số lô

- Loại bỏ dịch nổi trong ống ly tâm, giữ lại 0.5 ml cặn tế bào, thêm vào khoảng 0,5 ml môi trường, trộn đều dịch huyền trọc và trải đều vào bình cấy flask

- Bổ sung cho đủ 4ml môi trường/flask, ủ trong tủ ấm 37oC

- Sau 5 ngày, kiểm tra và ghi nhận tình trạng mẫu, tiếp tục tiến hành kiểm tra mẫu sau mỗi 2 ngày

- Thay toàn bộ môi trường nuôi cấy lần 1 khi có ít nhất 1 cụm tế bào kích thước trung bình

- Thay môi trường lần 2 khi có ít nhất 5 cụm lớn, độ che phủ mức dày hoặc có

ít nhất 3 cụm lớn, độ che phủ mức rất dày và tiến hành thu hoạch vào ngày hôm sau

 Phương pháp 2 [39]: Nuôi cấy in situ trên slide flask

- Chuẩn bị sẳn slide flask ghi thông tin mã số mẫu, ngày cấy, số lô

- Loại bỏ dịch nổi trong ống ly tâm, giữ lại 0,5 ml cặn tế bào, thêm vào 0,5 ml môi trường, trộn đều dịch huyền trọc để huyền phù tế bào và trải đều vào slide flask

- Bổ sung cho đủ 2ml môi trường/slide flask, ủ trong tủ ấm 37oC

- Sau 5 ngày, kiểm tra và ghi nhận tình trạng mẫu, tiếp tục tiến hành kiểm tra mẫu sau mỗi 2 ngày

- Thay toàn bộ môi trường nuôi cấy lần 1 khi có ít nhất 1 cụm tế bào kích thước trung bình

- Thay môi trường lần 2 khi có ít nhất 3 cụm lớn, độ che phủ ở mức dày và tiến hành thu hoạch vào ngày hôm sau

 Phương pháp 3 [24]: Nuôi cấy in situ trên lá kính trong đĩa petri

- Chuẩn bị sẳn đĩa petri ghi thông tin mã số mẫu, ngày cấy, số lô, mỗi đĩa petri

có lót 2 lá kính 22mm2

- Loại bỏ dịch nổi trong ống ly tâm, giữ lại khoảng 0,25ml dịch nổi phía trên cặn tế bào, thêm 1ml môi trường, trộn đều dịch huyền trọc và trải vào lá kính

- Ủ trong tủ ấm 37oC

- Ngày hôm sau bổ sung thêm 2ml môi trường/đĩa petri

- Sau 5 ngày, kiểm tra và ghi nhận tình trạng mẫu, tiếp tục tiến hành kiểm tra mẫu sau mỗi 2 ngày

- Thay 2ml môi trường lần 1 khi có ít nhất 1 cụm tế bào kích thước trung bình

- Thay môi trường lần 2 khi có ít nhất 3 cụm lớn, độ che phủ ở mức dày và tiến hành thu hoạch vào ngày hôm sau

3.4.1.3 Phương pháp thu hoạch tế bào [59]

 Thu hoạch tế bào nuôi cấy bằng phương pháp 1

- Cho vào bình cấy flask 0,1ml demecolcine (10 µg/ml), lắc đều, tiếp tục ủ trong 1 giờ

- Hút môi trường cũ ra khỏi bình cấy flask cho vào ống ly tâm Cho 2ml Trypsin- EDTA 0,05%, lắc đều, ủ 10 phút làm bong tế bào

- Ức chế tác động của trypsin bằng 4ml môi trường cũ, hút hết dịch trong bình cấy flask cho vào ống ly tâm Tráng bình cấy flask bằng 2ml dung dịch NaCl 0,09%, tráng lần 2 với 1ml dung dịch NaCl 0,09% (nếu cần)

- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml KCl 0,075M, rung lắc đều để huyền phù dịch

tế bào,sau đó ly tâm ngay 1000 vòng/10 phút

- Rung lắc lại ống ly tâm, sau đó đem ủ ở 37oC trong 10 phút

- Thêm 8 giọt dung dịch cố định, rung lắc đều sau đó đem ly tâm

- Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml dung dịch cố định, ủ 4oC trong 20 phút

- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa

- Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên phiến kính

 Thu hoạch tế bào nuôi cấy bằng phương pháp 2 và 3

- Cho vào đĩa cấy petri hoặc slide flask 0,05ml demecolcine (10 µg/ml), ủ trong 20 phút

- Hút bỏ môi trường cũ

- Cho vào mỗi đĩa cấy petri hoặc slide flask 2ml KCl 0,075M, sau đó đem ủ ở

37oC trong 20 phút

- Thêm 1ml dung dịch cố định, để yên khoảng 2 phút

- Hút bỏ dịch, thêm vào 2ml dung dịch cố định, ủ 4oC ít nhất trong 20 phút

- Hút bỏ dịch, tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa

- Hút bỏ hoàn toàn dung dịch cố định, để lá kính khô tự nhiên Đối với slide flask, sau khi hút bỏ dung dịch cố định thì nạy bỏ phần trên của slide flask Trước khi nhuộm, cả lá kính và slide flask đều cần được xử lý nhiệt Riêng lá kính sau đó

sẽ được dán lên phiến kính

3.4.1.4 Phương pháp đánh giá kết quả

Phương pháp nuôi cấy tế bào hiệu quả được xác định là các phương pháp có tỷ

lệ nuôi cấy thành công cao, tế bào phát triển nhanh, thời gian nuôi cấy ngắn

 Các chỉ tiêu khảo sát

(1) Tỷ lệ thành công, thất bại của các mẫu nuôi cấy ở mỗi phương pháp

(2) Mức độ phát triển của các mẫu nuôi cấy: đánh giá và phân loại mức độ phát triển dựa trên số lượng, kích thước và mức độ che phủ của các cụm tế bào ối khi quan sát ở độ phóng đại 200x Kích thước các cụm được quan sát dựa vào số tế bào đếm được và diện tích cụm Đặc điểm các cụm tế bào được quan sát bằng kính hiển

vi đảo ngược Nikon và chụp hình bằng kính hiển vi Olympus CKX 41 sử dụng phần mềm chụp hình DP2-BSW version 2.2 Số lượng, kích thước và mức độ che phủ của các cụm tế bào được đánh giá cùng lúc để thể hiện mức độ phát triển của mẫu nuôi cấy; các mức phát triển này được quy ước theo tiêu chuẩn như sau (Raddatz, 2005) [54]:

 Có tế bào bám và tạo cụm: trong bình cấy xuất hiện 1 nhóm tế bào (có từ

5 đến khoảng <50 tế bào/nhóm)

 Mức (+): trong bình cấy xuất hiện 1 cụm với kích thước trung bình (đếm được >50 tế bào trong 1 quang trường, diện tích cụm giới hạn trong 3 quang trường) và độ dày trung bình

 Mức (++): trong bình cấy xuất hiện 1 cụm kích thước lớn (đếm được >50

tế bào trong 1 quang trường, diện tích cụm vượt quá 3 quang trường) và độ dày từ trung bình trở lên

Tiêu chí đánh giá độ dày và kích thước cụm được trình bày ở phần phụ lục

(3) Thời gian đạt được các mức phát triển của các mẫu ối

(4) Tổng thời gian nuôi cấy (tính từ ngày bắt đầu nuôi cấy đến khi thu hoạch)

Với độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SD = S; α=0,05, khoảng tin cậy (CI) thời gian nuôi cấy được tính theo công thức sau:

3.4.2 Bước đầu khảo sát liều lượng demecolcine và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST thai

Quy cách sử dụng demecolcine được xét đến ở đây bao gồm liều lượng (µg demecolcine/ml môi trường chứa trong bình cấy) và thời gian ủ với chất này khi tạo tiêu bản NST thai từ dịch ối nuôi cấy

Do điều kiện cơ sở vật chất có hạn nên chỉ một phương pháp được chọn để thực hiện nội dung 2 Mặc dù phương pháp 1 và 2 đều thể hiện hiệu quả tốt khi nuôi cấy, tuy nhiên các slide flask để thực hiện phương pháp 2 là dụng cụ rất đắt tiền so với bình cấy flask của phương pháp 1, hơn nữa hiện nay phương pháp phổ biến được dùng ở nước ta là phương pháp 1, do đó phương pháp nuôi cấy 1 được dùng

CI = X ± tn-1, α/2 (S/√n)

để tiến hành nội dung 2 Các dịch ối đã được trộn lẫn và chia đều vào các lô để đạt được sự tương đồng trong nguyên liệu sử dụng ở các lô thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu 2 được thực hiện gồm 3 phần:

- Thử nghiệm 2.1: Đánh giá ảnh hưởng của liều lượng demecolcine và

thời gian ủ với chất này lên chất lượng cụm NST quan sát

Thí nghiệm 2.1 gồm 2 yếu tố khảo sát, yếu tố liều lượng gồm 4 mức (0,125 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml) thời gian gồm 4 mức (30, 60, 90 và

120 phút) được bố trí như sau:

Liều lượng (µg/ml)

(* lô đối chứng)

Lô A6 xử lý với 0,25 µg/ml trong 60 phút là điều kiện xử lý thu hoạch tại phòng thí nghiệm Khoa Di truyền, bệnh viện Từ Dũ (2009) được chọn làm lô đối chứng

Lượng dịch ối sử dụng có giới hạn nên không thể tiến hành lặp lại toàn bộ các

lô thử nghiệm 2.1, do đó, dựa trên kết quả của thử nghiệm 2.1 chọn ra các điều kiện thí nghiệm cho kết quả tốt để tiếp tục các thử nghiệm sau

- Thử nghiệm 2 2: Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý với các liều lượng demecolcine khác nhau trong 60 phút

Thí nghiệm này gồm 4 lô, mỗi lô xử lý với liều demecolcine tương ứng là 0,125 µg/ml, 0,25 µg/ml (đối chứng), 0,375 µg/ml và 0,5 µg/ml trong 60 phút Thử nghiệm này được thực hiện để xác định liều lượng demecolcine xử lý ở thời gian 60 phút cho kết quả tốt nhất

- Thử nghiệm 2.3: Đánh giá chất lượng cụm NST khi xử lý bằng liều 0,25 µg/ml demecolcine ở các mức thời gian khác nhau

Thí nghiệm này gồm 4 lô, mỗi lô xử lý bằng 0,25 µg/ml demecolcine ở các mức thời gian tương ứng là 30, 60, 90 và 120 phút Thử nghiệm này được thực hiện để một lần nữa khẳng định kết quả của thử nghiệm 2.2 về hiệu quả khi xử lý ở liều 0,25 µg/ml demecolcine thông qua việc đánh giá chất lượng cụm NST ở các mức thời gian khác nhau

Sau khi các mẫu ối được nuôi cấy, các điều kiện thí nghiệm sẽ được tác động ở giai đoạn đầu quá trình thu hoạch khi xử lý làm ngưng tế bào ở kỳ giữa bằng demecolcine, các tiến trình thu hoạch ở giai đoạn sau đó là như nhau

 Quá trình thu hoạch [59]:

- Cho vào flask tế bào ối đã được nuôi cấy một liều demecolcine 0,125µg/ml (hoặc 0,25µg/ml, 0,375 µg/ml hay 0,5 µg/ml tùy lô), lắc đều, tiếp tục ủ trong 30 phút (hay 60, 90 hoặc 120 phút tùy lô)

- Hút môi trường cũ ra khỏi bình flask cho vào ống ly tâm Cho 2ml trypsin- EDTA 0,05%, lắc đều, ủ 10 phút làm bong tế bào

- Ức chế tác động của trypsin bằng 4ml môi trường cũ, hút hết dịch trong flask cho vào ống ly tâm Tráng flask bằng 2ml dung dịch NaCl 0,09%, tráng lần 2 với 1ml dung dịch NaCl 0,09% (nếu cần)

- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Cho vào mỗi ống ly tâm 10ml KCl 0,075M, rung lắc đều để huyền phù dịch

tế bào, sau đó ly tâm ngay 1000 vòng/10 phút

- Rung lắc lại ống ly tâm, sau đó đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 20 phút

- Thêm 8 giọt dung dịch cố định, rung lắc đều sau đó đem ly tâm

- Hút bỏ dịch nổi, thêm vào 6ml carnoy, ủ 4oC trong 20 phút

- Ly tâm 1000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Tiếp tục xử lý với dung dịch cố định thêm 2 lần nữa Ủ lạnh 4oC đến khi nhỏ lên phiến kính

 Phương pháp làm tiêu bản hiển vi

- Nhỏ dịch nuôi cấy lên phiến kính sau đó sấy phiến kính ở 550C

- Nhuộm phiến kính bằng phương pháp nhuộm thường quy hay nhuộm băng

 Phương pháp nhuộm thường quy

- Sấy phiến kính ở 900C trong 1 giờ

- Nhuộm với giemsa trong 5-7 phút

- Quan sát trên kính hiển vi và ghi nhận kết quả

 Phương pháp nhuộm băng G

- Sấy phiến kính ở 900C trong 1 giờ

- Nhúng mẫu trong trypsin EDTA 0,05% trong khoảng vài giây

- Để khô tự nhiên, sau đó nhuộm với giemsa trong 5-7 phút

 Các chỉ tiêu khảo sát: Tiêu bản NST tốt phải có nhiều cụm NST, các NST

trong cụm không gối lên nhau (độ bung tốt) Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng NST được khảo sát bao gồm chỉ số cụm NST quan sát ở độ phóng đại 200x, độ bung của các NST

(1) Chỉ số cụm NST ở kỳ giữa: mỗi mẫu được thu hoạch và nhỏ lên 3 phiến kính, chọn lấy 2 phiến kính có nhiều cụm, đếm 20 quang trường ở độ phóng đại 100x, tổng số cụm ở 20 quang trường được đếm ở 200x và tính ra số cụm trung bình trong mỗi quang trường (chỉ số cụm NST) của mỗi lô Kết quả chỉ số cụm NST

được ghi nhận và đánh giá ở 3 mức độ [40]:

 Nhiều (>5 cụm NST/quang trường)

 Trung bình (2-5 cụm NST/quang trường)

 Trung bình (≤ 5 vị trí gối nhau): tương ứng mức ++

 Tốt (các NST không gối lên nhau): tương ứng mức +++

Độ bung của các nhiễm sắc thể ở các cụm trên tổng số 20 quang trường quan sát được thống kê để xác định tỷ lệ % mỗi mức độ bung/mẫu thí nghiệm

3.5 PHƯƠNG PHÁP TOÁN HỌC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Tất cả các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng trắc nghiệm F và chi bình phương nhờ phần mềm vi tính Excel 2003 Kết quả được trình bày ở dạng: X ± SD

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HIỆU QUẢ

Phương pháp nuôi cấy hiệu quả sẽ được xác định thông qua so sánh hiệu quả của

3 phương pháp nuôi cấy Bên cạnh đó, ảnh hưởng của điều kiện mẫu tới hiệu quả nuôi cấy ối của mỗi phương pháp cũng sẽ được xét dựa vào tác động của tuổi thai

và tình trạng lẫn máu mẹ lên kết quả nuôi cấy

4.1.1 So sánh hiệu quả 3 phương pháp nuôi cấy

Hiệu quả của 3 phương pháp nuôi cấy lần lượt được đánh giá dựa trên tỷ lệ thành công, tỷ lệ các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển, thời gian cần thiết cho các mẫu nuôi cấy đạt được các mức phát triển ở mỗi phương pháp nuôi cấy

4.1.1.1 Tỷ lệ thành công ở mỗi phương pháp nuôi cấy

Với kết quả sơ bộ của một số mẫu nuôi cấy thử nghiệm ban đầu, chúng tôi nhận thấy các mẫu không xuất hiện cụm tế bào sau 8 ngày nuôi cấy thì sau đó tất cả chúng đều không xuất hiện cụm tế bào Đối với các trường hợp không đạt mức phát triển (++) sau 15 ngày nuôi cấy thì sau đó khả năng sinh sản của tế bào rất kém, không đủ tiêu chuẩn số cụm tế bào để thu hoạch hoặc khi thu hoạch thì không nhận được tế bào ở kỳ giữa Từ đó các trường hợp nuôi cấy được đánh giá là thất bại nếu

có các đặc điểm sau:

 Bị nhiễm khuẩn hoặc nhiễm nấm

 Nuôi cấy sau 8 ngày vẫn không xuất hiện cụm tế bào

 Nuôi cấy sau 15 ngày mà số cụm tế bào vẫn không đạt tiêu chuẩn mức phát triển (++)