Khảo sát tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp

Trong cơ thể bệnh nhân, tế bào ung thư phát triển các phương thức nhằm ngăn chặn hệ miễn dịch tiêu diệt chúng, trong đó có phương thức hạn chế tế bào tua nhận diện và trình diện kháng ng

DƯƠNG THANH THỦY

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA

ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN TỪ KHỐI U

VÀ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ SƠ CẤP

Chuyên ngành: Sinh Lý Động Vật

Mã số chuyên ngành: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN ĐỨC THÁI

Con gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Đức Thái, đã tận tình hướng dẫn con trong suốt thời gian qua

Em cảm ơn Anh Phạm Văn Phúc, đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức

và giúp đỡ em những lúc khó khăn

Tôi cảm ơn Chính Nhân, Thanh Bình, Steven và Minh Nguyệt, đã luôn đồng hành cùng tôi suốt thời gian qua

Cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ tôi

Dương Thanh Thủy

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC……… i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… v

DANH MỤC BẢNG……… viii

DANH MỤC HÌNH……… ix

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 3

1.1.1 Tình hình ung thư vú 3

1.1.2 Ung thư vú 4

1.1.2.1 Tổng quan 4

1.1.2.2 Các giai đoạn phát triển ung thư vú 4

1.1.3 Các liệu pháp điều trị hiện nay 6

1.1.3.1 Liệu pháp điều trị truyền thống 6

1.1.3.2 Chiến lược điều trị mới 8

1.1.4 Tế bào gốc ung thư vú 9

1.1.5 Mô hình động vật ung thư vú 11

1.1.5.1 Mô hình dị ghép 11

1.1.5.2 Mô hình cảm ứng bằng hóa chất 13

1.1.5.3 Mô hình chuột biến đổi gen 13

1.2 MIỄN DỊCH UNG THƯ 15

1.2.1 Kháng nguyên ung thư 15

1.2.1.1 Các loại kháng nguyên ung thư 15

1.2.1.2 Kháng nguyên ung thư vú 16

1.2.2 Khả năng “lẩn trốn” miễn dịch của ung thư 17

1.2.2.1 Các cơ chế lẩn trốn miễn dịch của ung thư 17

1.2.2.2 Khả năng kháng miễn dịch trong ung thư vú 18

1.2.3 Tế bào tua 19

1.2.3.1 Đặc tính sinh học của tế bào tua 19

1.2.3.2 Tế bào tua trong ung thư vú 21

1.2.4 Tình hình nghiên cứu điều trị ung thư vú bằng liệu pháp tế bào tua ở Việt Nam và thế giới 22

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 VẬT LIỆU 27

2.1.1 Mẫu vật 27

2.1.1.1 Nguồn tế bào 27

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.2.1 Hóa chất nuôi tế bào ung thư vú 27

2.1.2.2 Hóa chất tạo mô hình 28

2.1.2.3 Hóa chất nuôi tế bào tua 28

2.1.2.4 Hóa chất khác 28

2.1.3 Dụng cụ 29

2.1.4 Thiết bị 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP 31

2.2.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát 31

2.2.2 Nội dung 1: Nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư vú từ khối u 32

2.2.2.1 Nuôi cấy tế bào ung thư vú từ mảnh mô khối u vú 32

2.2.2.2 Đánh giá quần thể tế bào sơ cấp 34

2.2.3 Nội dung 2: Biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân tủy xương chuột thành tế bào tua 35

2.2.3.1 Quy trình nuôi cấy 35

2.2.3.2 Kiểm tra đặc tính tế bào tua đã biệt hóa 36

2.2.3.3 Cảm ứng tế bào tua với kháng nguyên ung thư 37

2.2.4 Nội dung 3: Xây dựng mô hình chuột ung thư vú dị ghép 38

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch 38

2.2.4.2 Nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam chuyển gen GFP 39

2.2.4.3 Tạo mô hình chuột mang khối u vú 40

2.2.4.4 Đánh giá hiệu quả tạo mô hình 40

2.2.5 Nội dung 4: Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp 41

2.2.5.1 Bố trí thí nghiệm 41

2.2.5.2 Đánh giá sự thay đổi kích thước khối u 42

2.2.5.3 Đánh giá sự biến động bạch cầu tổng 43

2.2.5.4 Đánh giá sự khác biệt lượng tế bào gây ung thư 43

2.2.5.5 Thống kê kết quả 44

3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1 NỘI DUNG 1: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO UNG THƯ VÚ THU TỪ KHỐI U 45

3.1.1 Sự tăng sinh và hình thái tế bào ung thư sơ cấp 45

3.1.2 Hiệu quả nuôi cấy sơ cấp 49

3.1.3 Đánh giá quần thể tế bào ung thư vú sơ cấp 52

3.1.4 Kết luận và biện luận chung 52

3.2 NỘI DUNG 2: BIỆT HÓA, TRƯỞNG THÀNH TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TỦY XƯƠNG CHUỘT THÀNH TẾ BÀO TUA 54

3.2.1 Hiệu quả biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tủy xương chuột 54

3.2.2 Đánh giá tế bào tua thu nhận từ tủy xương chuột 56

3.3 NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH CHUỘT UNG THƯ VÚ DỊ GHÉP 57

3.3.1 Hiệu quả gây suy giảm miễn dịch trên chuột nhắt trắng 57

3.3.2 Nuôi cấy dòng tế bào VNBC-GFP 58

3.3.3 Hiệu quả tạo mô hình chuột mang khối u vú người 59

3.3.3.1 Hình thái bên ngoài 59

3.3.3.2 Khả năng phát huỳnh quang của khối u chuột 59

3.3.3.3 Mô học khối u chuột 60

3.4 NỘI DUNG 4: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN THU TỪ KHỐI U VÀ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ SƠ CẤP 62

3.4.1 Hình thái bên ngoài 62

3.4.2 Sự biến động bạch cầu tổng 63

3.4.3 Sự thay đổi kích thước khối u 65

3.4.4 Sự thay đổi tỷ lệ tế bào VNBC-GFP trong khối u 67

3.4.5 Mô học khối u 69

3.4.5.1 Mô nhuộm H&E 69

3.4.5.2 Sự phát huỳnh quang trên mảnh cắt lát mô 70

3.4.6 Kết luận và biện luận chung 71

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77

4.1 KẾT LUẬN 77

4.2 ĐỀ NGHỊ 78

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

5-FU 5-fluorouracil

ABC ATP-binding cassette

ABC G2 ATP-binding casstte sub-family

G member 2 AFP Antigen Fetoprotein Kháng nguyên protein bào thai ALDH Aldehyde Dehydrogenase

APC Antigen Presenting Cell Tế bào trình diện kháng nguyên Bcr-Abl Break point cluster-Abelson

BLG Beta Lactoglobin

BMP-4 Bone morphogenetic protein 4

BRCA1/2 Breast cancer 1/2 Gen ung thư vú

CA-125/ 19-9 Cancer antigen 125/ 19-9 Kháng nguyên ung thư

CAF/FAC Cyclophosphamide, Doxurubicin,

5-Fluorouracil

CCL22 Chemokine (C-C motif) Ligand 22

CCR7 C-C Chemokine Receptor type 7 Thụ thể Chemokine C-C loại 7

CD Cluster of Differentiation Cụm biệt hóa

CEA Carcinoembryonic Antigen Kháng nguyên u quái

CEF/FEC Cyclophosphamide, Epirubicin,

5-Fluorouracil CHECK2 Checkpoint Kinase 2

DC-LAMP Dndritic cell Lysosomal Associated Membrance Protein Protein màng liên quan lysosome tế bào tua DMBA 7,12-dimethylbenz[a]anthrancene

DMEM Dulbecco's Modiffied Eagle Medium

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Thụ thể nhân tố tăng trưởng biểu mô ENU N-ethyl-N-nitrosourea

Erbb2 V-erb-b2 erythroblastic

FasL Fas Ligand

FGF Fibroblast Growth Factor Nhân tố tăng trưởng

nguyên bào sợi

GEM Genetically Enginerered Mice

GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Nhân tố kích thích

Stimulating Factor dòng đại thực bào hạt

HER2 Human Epidermal Growth Thụ thể tăng trưởng

HPV Human apilloma virus Virus gây ung thư cổ tử cung HTLV-1 Human T Lymphotropic Virus-1 Virus gây ung thư tế bào T IARC International Agency for Cơ quan nghiên cứu

Research on Cancer ung thư quốc tế IFN Interferone

LAIR Leukocyte-associated Thụ thể cho phân tử giống

immunoglobulin-like receptor Ig liên quan bạch cầu LCIS Lobular carcinoma in situ

MCF7 Michigan Cancer Foudation 7 Dòng tế bào ung thư vú

do Tổ chức Michigan tạo ra MDSC Myeloid Derived Suppressor Cells Tế bào dòng tủy ức chế

MHC Major histocompatibility complex Phức hợp phù hợp mô

MMP Matrix Metalloproteinase

MMTV-LTK Mouse Mammary Tumor Virus gây ung thư vú ở chuột

Virus Long Terminal Repeat MNU N-methyl-N-nitrosourea

PBS Phosphate buffered Saline

PDL1 Programmed cell death 1 ligand Ligand tế bào chết

theo chương trình

PR Progesterone receptor Thụ thể progesterone

PTEN Phosphatase and tensin homolog

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SCID

Severe Combined Immunodeficient Chuột ức chế miễn dịch

TGF-β Transforming Growth Factor β Nhân tố tăng trưởng

chuyển dạng beta TLR T lymphocyte Receptor Thụ thể bạch cầu T

TNF Tumor necrosis factor Nhân tố hoại tử mô ung thư TNM Tumor-Node-Metastasis Chỉ tiêu phân loại ung thư vú

dựa trên kích thước khối u, hạch u và di căn

VEGF

Vascular endothelial growth

nội mô mạch máu VNBC-GFP

Vietnamese Breast Cancer cell expressed GFP Dòng tế bào ung thư vú

người Việt Nam biểu hiện GFP WAP Whey Acidic Protein

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2 1 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 2 2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 30

Bảng 2 3 Bố trí thí nghiệm theo thời gian tiến hành 41

Bảng 3 1 Thống kê hiệu quả nuôi cấy thành công……… 50

Bảng 3 2 Tỷ lệ tế bào ung thư và tế bào gốc ung thư vú trong quần thể tế bào sơ cấp 52

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1 1 Tỷ suất mắc bệnh ung thư vú tại châu Á và Đông Nam Á năm 2008 3

Hình 1 2 Marker và mô hình trong nghiên cứu tế bào gốc ung thư vú 10

Hình 1 3 Ưu điểm và nhược điểm của các mô hình ung thư dị ghép, chuột hóa người và biến đổi gen 14

Hình 1 4 Điều trị ung thư vú bằng vaccine tế bào tua 23

Hình 2 1 Quy trình nghiên cứu tổng quát……… 31

Hình 2 2 Phương pháp đo kích thước khối u 42

Hình 3 1 Tế bào mới phát triển từ rìa mảnh mô……… 45

Hình 3 2 Quần thể tế bào phát triển lan rộng 45

Hình 3 3 Quần thể tế bào tương đối đồng nhất dạng biểu mô 46

Hình 3 4 Quần thể tế bào nền khối u hoặc tế bào ung thư chuyển dạng trung mô biểu mô 47

Hình 3 5 Quần thể tế bào phát triển dày đặc (a) và rải rác (b) 48

Hình 3 6 Các quần thể tế bào sơ cấp có hình thái đặc biệt 48

Hình 3 7 Quần thể tế bào sơ cấp phát triển thành dạng khối cầu-sphere 49

Hình 3 8 Biểu đồ thống kê mẫu khối u có tế bào phát triển theo thời gian 50

Hình 3 9 Biểu đồ phân bố độ tuổi của bệnh nhân cho mẫu khối u vú 51

Hình 3 10 Biểu đồ phân bố giai đoạn ung thư của bệnh nhân cho khối u vú 51

Hình 3 11 Tế bào đơn nhân tủy xương bám trên bề mặt bình nuôi trong môi trường RPMI 55

Hình 3 12 Hình thái tế bào nuôi cấy hai ngày trong môi trường CM1 55

Hình 3 13 Hình thái tế bào nuôi cấy năm ngày trong môi trường CM1 55

Hình 3 14 Hình thái tế bào tua trong môi trường CM2 56

Hình 3 15 Hình thái tế bào tròn sau bảy ngày trong môi trường CM2 56

Hình 3 16 Kết quả Flow Cytometry cho tế bào tua 57

Hình 3 17 Hình thái tế bào VNBC-GFP 58

Hình 3 18 Tế bào VNBC-GFP phát huỳnh quang (x400) 58

Hình 3 19 Khối u xuất hiện tại vùng mỡ vú chuột 59

Hình 3 20 Chuột mang khối u phát huỳnh quang 60

Hình 3 21 Hình thái tế bào trong mô khối u cắt lát được nhuộm H&E 61

Hình 3 22 Lát cắt mô khối u phát huỳnh quang 61

Hình 3 23 Hình thái khối u chuột ngày N7 62

Hình 3 24 Khối u phát huỳnh quang ngày N7 63

Hình 3 25 Biểu đồ sự biến động bạch cầu tổng trước và sau khi tiêm tế bào tua trong lô thí nghiệm và lô đối 64

Hình 3 26 Biểu đồ biến động bạch cầu tổng giữa các lô thí nghiệm tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ tế bào ung thư sơ cấp và khối u 65

Hình 3 27 Biểu đồ thay đổi kích thước khối u trong chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp 66

Hình 3 28 Biểu đồ thay đổi kích thước khối u trong lô đối chứng và thí nghiệm 67 Hình 3 29 Biểu đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u của các lô chuột tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp 68

Hình 3 30 Biểu đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u chuột của các lô đối chứng và thí nghiệm 68

Hình 3 31 Hình thái tế bào trong mẫu khối u chuột tiêm PBS (a) và tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên (b) 70

Hình 3 32 Mức độ phát huỳnh quang của các khối u 71

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú có tỷ lệ mắc phải đứng hàng thứ hai sau ung thư phổi và thuộc nhóm năm loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất [55] Đây là một căn bệnh phức tạp, nguyên nhân chưa được biết rõ Hiện nay ung thư vú chủ yếu được điều trị bằng bốn liệu pháp, phẫu thuật cắt bỏ khối u kết hợp với xạ trị, hóa trị và điều trị nội tiết Tuy nhiên, các phương pháp điều trị truyền thống chỉ hiệu quả ở những bệnh nhân giai đoạn đầu, dễ tái phát và nhiều tác dụng phụ [5] Vì vậy, đòi hỏi phải có những phương pháp điều trị mới ít tác dụng phụ, hiệu quả cao, đánh trúng đích

Những hiểu biết về miễn dịch ung thư mở ra hướng mới trong điều trị bằng liệu pháp miễn dịch Trong đó, tế bào tua đang được giới khoa học chú ý bởi những đặc tính ưu việt trong khả năng trình diện kháng nguyên ung thư trên diện rộng cho cả độc tế bào T và trợ bào T [1, 70] Trong cơ thể bệnh nhân, tế bào ung thư phát triển các phương thức nhằm ngăn chặn hệ miễn dịch tiêu diệt chúng, trong đó có phương thức hạn chế tế bào tua nhận diện và trình diện kháng nguyên ung thư cho tế bào T [18] Vì vậy cần thiết phải huấn luyện tế bào tua trước khi đưa vào cơ thể bệnh

nhân Tế bào đơn nhân từ tủy xương, máu ngoại vi có thể được biệt hóa in vitro

thành tế bào tua bằng các nhân tố kích thích và cytokine như GM-CSF, IL-4, TNF-α

nhiên, những nghiên cứu này chỉ mới dừng lại ở mức thử nghiệm in vitro, một số

nghiên cứu tại PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc đang tiến đến bước thử nghiệm cận lâm sàng trên mô hình chuột Hầu hết các nghiên cứu này sử dụng nguồn kháng nguyên là tế bào ung thư vú đã tạo dòng hoặc kháng nguyên ung thư đặc trưng cho ung thư vú để cảm ứng lượng lớn tế bào tua (trên một triệu tế bào cho

1 liều điều trị) Bệnh nhân ung thư, đặc biệt là bệnh nhân giai đoạn IV di căn, lượng

tế bào miễn dịch thấp nên việc thu nhận lượng lớn tế bào rất khó khăn Mặt khác, tế bào ung thư qua tạo dòng lâu dài, nhiều lần cấy chuyền có thể không phản ánh hoàn toàn đặc tính ung thư phức tạp trên từng bệnh nhân

Vì vậy, nhằm hướng đến liệu pháp điều trị hiệu quả cho từng bệnh nhân, chi phí

thấp, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện Việt Nam, đề tài “Khảo sát tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ

cấp” sử dụng nguồn kháng nguyên khối u đơn giản, dễ thu nhận để cảm ứng lượng

thấp tế bào tua (105 tế bào) nhằm mục tiêu:

Bước đầu tìm hiểu những tác động đến hệ miễn dịch và ức chế tăng trưởng ung thư của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp trên mô hình chuột; từ đó làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn và những thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân

Đề tài được tiến hành với bốn nội dung chính:

1 Nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư vú từ khối u

2 Biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân tủy xương chuột thành tế bào tua

3 Xây dựng mô hình chuột ung thư vú dị ghép

4 Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ

khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ

Ung thư vú đang trở nên phổ biến tại các nước đang phát triển Tại Việt Nam, năm 2002, ở nữ giới, ung thư vú chiếm tỷ lệ cao đứng thứ hai trong các loại bệnh ung thư với tỷ lệ 17 bệnh nhân trên 100.000 người, trong khi ung thư cổ tử cung là

20 Đến năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã tăng lên đến 21,5 bệnh nhân và đang trở thành bệnh ung thư phổ biến nhất ở nữ giới [30]

Hình 1 1 Tỷ suất mắc bệnh ung thư vú tại châu Á và Đông Nam Á năm 2008 [30]

Từ những năm đầu thế kỉ đã có một số nghiên cứu về bệnh ung thư vú trong cộng đồng người Việt Nam, tuy nhiên chúng chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát các yếu tố lâm sàng Năm 2002, Scarlett S Lin khảo sát trên cộng đồng người Việt Nam tại Mỹ nhận thấy bệnh nhân Việt Nam (độ tuổi trung bình mắc bệnh là 51, tới 49% bệnh nhân dưới 50 tuổi) có tỷ lệ mắc bệnh ở độ tuổi trẻ cao hơn so với các cộng đồng dân cư khác Những bệnh nhân này đòi hỏi can thiệp phẫu thuật u vú tại chỗ

hoặc cục bộ (61,1% bệnh nhân cần phẫu thuật) nhiều hơn những cộng đồng dân nhập cư khác [64]

1.1.2 Ung thư vú

1.1.2.1 Tổng quan

Ung thư vú là khối u ác tính bắt đầu từ những tế bào của tiểu thùy sản xuất sữa hoặc ống dẫn sữa từ tiểu thùy đến núm vú Ung thư vú ít bắt nguồn từ mô nền (gồm

mô mỡ và mô liên kết nguyên bào sợi của vú) Tế bào ung thư xâm lấn sang các mô

vú khỏe mạnh lân cận rồi từ đó lan đến các hạch bạch huyết dưới nách Tế bào ung thư có thể theo hệ thống bạch huyết đi đến khắp nơi trong cơ thể

Ung thư vú do sự bất thường di truyền gây ra Tuy nhiên, chỉ có 5-10% bệnh nhân ung thư nhận gen bất thường từ cha hoặc mẹ; khoảng 90% bất thường di truyền ung thư vú do tuổi già và những yếu tố nguy cơ trong cuộc sống Đột biến gen BRCA1 (gen ung thư vú-breast cancer gen) và BRCA2 chiếm 10% và thường được di truyền từ ba hoặc mẹ Ung thư vú liên quan đến sự đột biến các gen: ATM (gen mã hóa tác nhân giúp sửa chữa sự tổn thương DNA), p53 (gen TP53 mã hóa protein ngưng sự tăng sinh tế bào ung thư), CHEK2 (gen mã hóa thành phần cần cho sản xuất protein gây ngưng tăng trưởng tế bào ung thư), PTEN (gen mã hóa protein điều hòa sự tăng trưởng tế bào), CDH1 (gen mã hóa protein hỗ trợ tế bào liên kết với nhau tạo nên mô)

Khoảng 2/3 bệnh nhân ung thư vú (ngoại trừ LCIS-lobular carcinoma in situ, u

tiểu thùy tại chỗ) có biểu hiện thụ thể estrogen và progesterone (ER và PR) Tỷ lệ này ở bệnh nhân lớn tuổi cao hơn bệnh nhân trẻ tuổi Khoảng 1/5 bệnh nhân ung thư biểu hiện mức cao HER2/neu (Human epidermal grow factor 2, thụ thể tăng trưởng biểu mô người, thường viết tắt là HER2) [5]

1.1.2.2 Các giai đoạn phát triển ung thư vú

Có hai hệ thống phân loại giai đoạn phát triển ung thư vú: hệ thống theo giai đoạn từ 0 đến IV và hệ thống TNM Sự phân loại này dựa trên bốn đặc tính: kích thước khối u, ung thư xâm lấn và không xâm lấn, ung thư trong hạch bạch huyết và ung thư lan đến những phần khác của cơ thể [5]

a Hệ thống phân loại theo giai đoạn từ 0 đến IV

Giai đoạn 0: Ung thư vú không xâm lấn, có tế bào ung thư ống vú không xâm lấn những vùng vú khỏe mạnh khác

Giai đoạn I: Ung thư vú xâm lấn (có tế bào ung thư lan sang vùng mô vú bình thường xung quanh) Khối u có kích thước 2cm và không có u hạch bạch huyết Giai đoạn II: Gồm IIA và IIB Trong giai đoạn IIA, kích thước khối u dưới 2cm, xâm lấn hạch bạch huyết dưới cánh tay hoặc khối u từ 2-5cm, không xâm lấn hạch bạch huyết Trong giai đoạn IIB, kích thước khối u 2-5cm và xâm lấn hạch bạch huyết dưới cánh tay hoặc không xâm lấn, khối u lớn hơn 5cm

Giai đoạn III: Gồm IIIA, IIIB và IIIC Trong giai đoạn IIIA, không có khối u vú,

u hạch bạch huyết kết dính với các cấu trúc khác hoặc xâm lấn đến hạch bạch huyết gần xương ức; có khối u vú và lan đến hạch bạch huyết mà kết dính với các cấu trúc khác Trong giai đoạn IIIB, có khối u vú lan rộng đến ngực và lan đến hạch bạch huyết mà kết dính với các cấu trúc khác hoặc di căn hạch bạch huyết gần xương ức; thường có hiện tượng viêm khối u vú Trong giai đoạn IIIC, khối u vú xâm lấn đến vùng ngực và hạch bạch huyết dưới cánh tay, trên hoặc dưới xương đòn, hoặc gần xương ức

Giai đoạn IV: ung thư di căn đến hạch bạch huyết và các cơ quan khác như phổi,

da, xương, gan hay não [66]

N được kí hiệu theo mức độ ung thư xâm lấn hạch bạch huyết; NX là không tìm thấy hạch bạch huyết lân cận bị xâm lấn; N0 là hạch bạch huyết không ung thư; N1 đến N3 đại diện cho lượng hạch bạch huyết có ung thư

M được kí hiệu theo mức độ di căn; MX là không tìm thấy sự di căn; M0 là không có di căn xa; M1 là có di căn đến các vùng xa vú

Dựa vào các thông số trong mỗi hệ thống có thể chuyển đổi đánh giá giai đoạn ung thư vú qua lại giữa hai hệ thống này [66]

1.1.3 Các liệu pháp điều trị hiện nay

1.1.3.1 Liệu pháp điều trị truyền thống

a Phẫu thuật

Phẫu thuật là phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay Ngày nay phẫu thuật đoạn nhũ tận gốc ít được sử dụng vì mức tàn phá rộng, để lại nhiều di chứng nặng nề cho bệnh nhân

Phẫu thuật bảo tồn vú: chỉ lấy khối bướu và mô bình thường cách rìa bướu 2cm Nhiều thử nghiệm lâm sàng cho thấy phẫu thuật bảo tồn kèm theo xạ trị cho kết quả ngang bằng với phẫu thuật đoạn nhũ riêng lẻ

1-Nạo hạch bạch huyết cũng là một phương pháp phẫu thuật Cắt buồng trứng ở phụ nữ mãn kinh bị ung thư vú dương tính ER để ngăn sản xuất estrogen [66]

b Xạ trị

Xạ trị là một phần của phương pháp điều trị bảo tồn, sử dụng chùm tia năng lượng lớn để tiêu diệt tế bào ung thư còn sót lại sau phẫu thuật cắt khối u Xạ trị sau đoạn nhũ: giảm nguy cơ tái phát cho những bệnh nhân nguy cơ cao như bệnh nhân

có nhiều hạch vùng, bệnh nhân có u nguyên phát to [66]

c Hóa trị

Hóa trị có thể đóng vai trò là liệu pháp điều trị chính hoặc hỗ trợ phẫu thuật Sau phẫu thuật sử dụng hóa chất để tiêu diệt những tế bào ung thư còn lại Trước phẫu thuật, hóa trị để làm khối u lớn thu nhỏ và thuận lợi cho phẫu thuật về sau Hóa trị thay thế phẫu thuật khi ung thư lan ra bên ngoài vùng ngực và nách Hóa trị thường

sử dụng phối hợp nhiều loại thuốc hơn dùng đơn lẻ

Các loại thuốc hóa trị thông dụng như: CMF (phối hợp Cytoxan®, methotrexate và 5-fluorouracil, 5-FU); CAF hay FAC (cyclophosphamide, doxorubicin-Adriamycin® và 5-fluorouracil); CEF hay FEC

cyclophosphamide-(cyclophosphamide, epirubicin và 5-fluorouracil) Một số loại thuốc mới được thiết

kế nhắm trúng đích như CEF, Trastuzumab (Herceptin®) và Lapatinib (Tykerb®) nhắm vào HER2; Bevacizumab kháng sự tạo mạch máu mới trong khối u; Cetuximab (Erbitux®) và Erlotinib (Tarceva®) kháng EGFR (epidermal growth factor receptor, thụ thể nhân tố tăng trưởng biểu mô)

e Hạn chế

Trong hai thập kỉ qua, hơn 30 thuốc trị ung thư được ra đời nhưng tỉ lệ tử vong của bệnh nhân ung thư vú không giảm Các liệu pháp trên chỉ có hiệu quả cao khi bệnh nhân chưa đến giai đoạn ung thư di căn hoặc chưa xâm lấn mạnh đến các hạch bạch huyết ngoài vùng xương ức và nách Hiệu quả phụ thuộc vào từng bệnh nhân, hóa trị đôi khi không hiệu quả nếu bệnh nhân không có các biểu hiện đặc trưng với HER2, PR, ER Trong quá trình điều trị, bệnh nhân chịu nhiều tác dụng phụ nguy hiểm (đặc biệt sau hóa trị liều cao) như: giảm chức năng thần kinh, tăng nguy cơ bị ung thư máu, mệt mỏi, ảnh hưởng đến chức năng vận động, tim mạch, thay đổi chu

kì kinh nguyệt ở bệnh nhân trẻ tuổi, rụng tóc…[5] Sau điều trị, dù thành công, chất lượng cuộc sống của bệnh nhân bị suy giảm, ảnh hưởng đến công việc, gia đình, sinh sản Bệnh nhân Việt Nam đa số khi phát hiện ung thư vú đang ở giai đoạn III trở lên nên hầu như các liệu pháp điều trị trên có hiệu quả thấp, tỷ lệ tái phát cao Như vậy, các phương pháp điều trị hiện thời không đáp ứng được nhu cầu muốn trị hoàn toàn ung thư vú của bệnh nhân

1.1.3.2 Chiến lược điều trị mới

Trái với các tế bào ung thư, tế bào gốc ung thư có khả năng phân chia chậm và

có khả năng đi vào apoptosis (chết theo chương trình) thấp và sửa chữa DNA cao, làm chúng kháng lại các phương pháp điều trị truyền thống như xạ trị và hóa trị

Trong nghiên cứu in vitro, tế bào ung thư vú đã biệt hóa, với kiểu hình

CD24+/CD44- không có khả năng kháng xạ trị; ngược lại, tế bào gốc ung thư vú với kiểu hình CD24-/low/CD44+ kháng được hóa chất và tia xạ Ngoài ra, tế bào gốc ung thư biểu hiện kênh vận chuyển thuốc ABC, bảo vệ tế bào khỏi tác động của các tác nhân gây độc bào Hiện nay hầu hết các chiến lược điều trị mới đều nhắm đến tế bào gốc ung thư

a Liệu pháp biệt hóa

Tế bào gốc ung thư nếu đã biệt hóa thành tế bào ung thư sẽ trở thành mục tiêu

dễ tấn công cho các liệu pháp xạ trị và hóa trị nên đây là chiến lược đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư Một trong những tác nhân được sử dụng để biệt hóa là vitamin A Gần đây nhiều tác nhân khác được xác định như BMP-4 Mặc khác có thể làm mất tính gốc của tế bào gốc ung thư vú bằng cách thay đổi mức biểu hiện của CD44 và CD24 P.V.Phúc và đồng sự (2011) đã làm mất tính gốc của tế bào gốc ung thư vú CD24-/low/CD44+ bằng cách knockdown CD44 [59]

b Liệu pháp nhắm trúng mục tiêu vào tế bào gốc ung thư

Tiêu diệt tế bào gốc ung thư bằng kháng thể bất hoạt những thụ thể quan trọng cho sự tăng sinh hay can thiệp vào những gen chủ đạo trong quá trình tự làm mới của tế bào gốc [2]

c Tấn công vào con đường truyền tín hiệu và kênh vận chuyển thuốc

Đặc tính của một tế bào được điều khiển bởi các con đường truyền tín hiệu (chuỗi các sự kiện với mức biểu hiện tăng giảm các gen, tương tác qua lại của các protein để quy định một “tính trạng”) Khả năng tăng sinh mạnh và kháng được nhiều tác nhân liệu pháp cũng được quy định bởi các con đường truyền tín hiệu Trong ung thư vú, con đường truyền tín hiệu Notch, Wnt, Hedgehog và BMI-1 được giới khoa học quan tâm nhiều nhất Việc can thiệp vào các điểm “xung yếu”

trong con đường truyền tín hiệu phá vỡ con đường này Các hóa chất can thiệp vào protein, can thiệp vào sự hoạt hóa gen; các phân tử gen/RNA hay kháng thể được dùng trong chiến lược này

Chiến lược miễn dịch như dùng kháng thể, vaccine tế bào tua, tế bào T gây độc… có thể mang lại hy vọng điều trị hoàn toàn bệnh với hiệu quả cao, ít xâm lấn,

ít tác dụng phụ cho bệnh nhân ung thư (đề cập chi tiết ở phần sau)

1.1.4 Tế bào gốc ung thư vú

Trong vú, ung thư có thể phát sinh từ tế bào gốc bình thường bị đột biến sinh ung thư Gần đây, các nhà khoa học cho rằng tế bào gốc ung thư có thể phát sinh từ những đột biến trong tế bào gốc, là căn nguyên của ung thư, có khả năng tăng sinh

và biệt hóa, chịu trách nhiệm cho khả năng kháng thuốc, kháng xạ trị, di căn của khối u Tế bào gốc và tiền thân ung thư được tìm thấy trong nhiều loại ung thư biểu

mô sử dụng các dấu ấn (marker) liên quan tới tế bào gốc mô bình thường nhưng mức độ biểu hiện cao hơn Các marker này bao gồm marker tế bào gốc trung mô CD44, CD90, CD133, CD117 và kênh vận chuyển chất độc ra ngoại bào (ABC) Tế bào gốc ung thư được phát hiện đầu tiên trong bệnh ung thư máu (leukemia) là các

tế bào đơn u quái (teratoma) [60] Al-Hajj và cộng sự (2003) phát hiện tế bào gốc ung thư vú biểu hiện CD44+/CD24-/low/Lineage- thu từ khối u của chín bệnh nhân,

có khả năng tạo khối u trên chuột NOD/SCID chỉ với 1000 tế bào [48]

Hình 1 2 Marker và mô hình trong nghiên cứu tế bào gốc ung thư vú [23]

Tế bào gốc ung thư trong khối u vú có thể được chọn lọc và tinh sạch theo bốn phương pháp:

- Kỹ thuật quần thể phụ (side population-SP): dựa trên sự biểu hiện vượt mức

các kênh vận chuyển xuyên màng như phân tử gắn ABCG2/BCRP1 cùng với ATP (ATP-binding cassette molecules ABCG2/BCRP1) trên tế bào gốc ung

thư, có khả năng đẩy các thuốc nhuộm Hoechst 33342 hay Rhodamine 123 ra ngoài [23]

- Sự hình thành khối cầu (sphere): tế bào gốc ung thư vú nuôi cấy in vitro trong

môi trường chuyên biệt có khả năng hình thành khối cầu Các tế bào trong khối cầu biểu hiện CD44+/CD24-/low và có đặc tính quần thể phụ [23]

- Biểu hiện các marker bề mặt: Tế bào gốc ung thư vú biểu hiện kiểu hình CD44+/CD24-/lowLin- được tìm thấy trong khối u vú của bệnh nhân [48], trong các lòng tế bào ung thư vú thương mại [13] và có thể tạo khối u với lượng tế bào rất nhỏ [48] Một số marker bề mặt khác như CD49, CD133, CD29, CD61

cũng được một số nghiên cứu sử dụng cùng với CD44 và CD24 trong nhận diện tế bào gốc ung thư vú [23]

- Phương pháp ALDEFLOUR assay: thường được dùng để thu nhận tế bào gốc/tiền thân từ khối u vú, dựa trên hoạt tính của enzym ALDH1 (Aldehyde Dehydrogenase) có vai trò trong sự biệt hóa sớm của tế bào gốc thông qua sự oxi hóa retinol thành acid retinoic Kiểu hình ALDFELUOR dương tính được

sử dụng như một chỉ tiêu để chọn lọc tế bào gốc ung thư vú [23]

Tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú có thể được thu nhận từ ba nguồn: các dòng tế bào ung thư vú thương mại, tế bào nuôi cấy sơ cấp từ khối u bệnh nhân, tế bào trong khối u dị ghép trên chuột ức chế miễn dịch Từ khối u bệnh nhân có thể nuôi cấy sơ cấp thành tế bào ung thư bằng hai phương pháp chính: Nuôi cấy mảnh

mô và nuôi cấy huyền phù tế bào đơn Dòng tế bào ung thư thương mại dễ nuôi cấy

và phân lập hơn nhưng do đã qua nhiều lần cấy chuyền, các dòng này có thể biến tính, không phản ánh hoàn toàn đặc tính ung thư trên bệnh nhân [63]

1.1.5 Mô hình động vật ung thư vú

Những ứng dụng mới trong nghiên cứu điều trị ung thư đều phải tiến hành trên động vật thí nghiệm trước khi áp dụng trên bệnh nhân Đối với bệnh ung thư vú, một loại ung thư phức tạp, biểu hiện đa dạng trên từng bệnh nhân, bệnh nguyên đến nay vẫn chưa được biết rõ, không có kiểu gen hay marker đặc trưng cho tất cả bệnh nhân nên đến nay vẫn chưa có mô hình động vật ung thư vú hoàn hảo, phản ánh được từng đặc tính bệnh Chuột hoang dại không phát triển ung thư vú trong suốt vòng đời ngoại trừ những chủng nhiễm virus ung thư vú chuột hoặc dạng chọn lọc đột biến Hiện nay có ba phương pháp tạo mô hình chuột ung thư: Mô hình dị ghép khác loài; mô hình cảm ứng bằng hóa chất, virus ung thư và tia xạ, mô hình chuột công nghệ biến đổi gen (Gentically Enginerered Mice, GEM)

1.1.5.1 Mô hình dị ghép

Mô hình này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu cận lâm sàng Dòng MB-435, được sử dụng để tạo mô hình dị ghép trong nhiều nghiên cứu (402 nghiên cứu chỉ trong năm 2004) Hiện có 51 dòng tế bào ung thư vú có thể phản ánh được

MDA-những phân type khác nhau của bệnh ung thư vú được dùng để tạo mô hình dị ghép [38, 51] Mô hình dị ghép có lợi thế là ít tốn kém, dễ thực hiện và khối u nhanh chóng xuất hiện Tạo khối u trên chuột bằng cách tiêm tế bào ung thư vú vào dưới

da, vào vùng mỡ vú hoặc tiêm vào ống tiết sữa hay tiểu thùy vú chuột [4]

Mô hình chuột dị ghép tế bào ung thư được tiến hành đầu tiên trên chuột Nude năm 1993 và sau đó là trên chuột suy giảm miễn dịch nghiêm ngặt (Severe Combined Immunodeficicent, SCID) Chủng chuột Nude, thiếu hụt tế bào T, và chủng chuột SCID, thiếu hụt tế bào B và tế bào T; nhưng hệ miễn dịch tự nhiên vẫn hoạt động và có thể bị kích ứng hoạt động mạnh hơn khi ghép tế bào ung thư người vào chuột [36] nên tỷ lệ tạo khối u chưa cao (60% ở chủng Nude và 65% ở chủng SCID theo Kubota T và cộng sự, 1993) và khối u dễ bị tiêu diệt, khó gây di căn Sau

đó chủng NOD (Nonobese diabetic) kết hợp với SCID, do gây đột biến đa dạng locus nên cả hệ miễn dịch thích ứng và tự nhiên (thiếu hụt tế bào giết tự nhiên, hệ thống bổ thể và mất chức năng của tế trình diện kháng nguyên) đều bị bất hoạt được dùng để tạo mô hình ung thư dị ghép với hiệu quả tăng lên 90-93% chuột mang khối u [10] Đồng ghép tế bào ung thư với lớp màng cơ bản như Matrigel (màng cơ bản thu nhận từ khối u chuột) vào vùng mỡ vú chuột NOD/SCID giúp tăng hiệu quả tạo mô hình lên đến 100% [73] Các khối u dị ghép phát triển trong khoảng 1-8 tuần (trong một vài trường hợp có thể kéo dài đến 4 tháng hoặc lâu hơn) [7]

Các dòng tế bào ung thư vú biểu hiện các marker ở nhiều bệnh nhân như ER, PR hoặc HER2 Ví dụ: dòng MCF7 được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu biểu hiện

ER, CD24, CD44 và MUC1 Mô hình chuột dị ghép các dòng tế bào này phù hợp cho các nghiên cứu thử thuốc điều trị ức chế các thụ thể steroid, HER2

Trong nghiên cứu điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch thì các chủng chuột khiếm khuyết miễn dịch dị ghép không đáp ứng được yêu cầu tìm hiểu tác động lên khối u của miễn dịch được kích hoạt bởi yếu tố ngoại sinh Mô hình chuột hóa người, chuột khiếm khuyết miễn dịch mang khối u dị ghép có hệ thống tạo máu, sinh miễn dịch của người, được tạo bằng cách tiêm tế bào tủy xương, tế bào gốc tạo máu hoặc tế bào miễn dịch của người vào chuột khiếm khuyết miễn dịch mô hình

ung thư dị ghép Mô hình này có ưu thế trong nghiên cứu vaccine, tương tác miễn dịch với khối u, tương tác giữa phần nền với khối u trong tiến trình phát triển và di căn [36], thích hợp cho nghiên cứu trị ung thư bằng liệu pháp tế bào tua

1.1.5.2 Mô hình cảm ứng bằng hóa chất

Từ năm 1940, các hóa chất có bản chất polycyclic hydrocarbon (như DMBA) và tác nhân alkylating (như MNU, ENU) được sử dụng trong nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu chuột ung thư vú Tùy tác nhân, liều lượng hóa chất, chủng chuột, hormone và chế độ dinh dưỡng được áp dụng; chuột mô hình sẽ có đặc tính, loại ung thư khác nhau (Medina và Thompson, 1999) Chuột ung thư bằng cảm ứng hóa chất mất khả năng sinh sản nên chỉ có ý nghĩa trong một đời [40]

1.1.5.3 Mô hình chuột biến đổi gen

Trong hai thập kỉ gần đây, các mô hình chuột biến đổi gen phục vụ nghiên cứu ung thư được phát triển mạnh Mô hình được tạo bằng hai kĩ thuật chính: Chuyển gen biểu hiện các gen ung thư (oncogene) chuyên biệt mức cao trong chuột; gen mục tiêu (gene-targeted hay knockout các gen vốn có vai trò ức chế ung thư) làm cho chuột nhạy cảm sinh ung thư vú Chuyển gen mã hóa các promoter như MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat), WAP (whey acidic protein) và BLG (β lactoglobin) hoạt hóa mạnh tế bào biểu mô ống vú, phiên

mã ở mức cao, phụ thuộc hormone tạo ra tính nhạy cảm hormone và corticoid thông qua sự điều biến sự biểu hiện oncogene Knockout các gen Tp53 và Ecad bằng cách gây đột biến tạo mô hình chuột ung thư tiểu thùy xâm lấn tương tự ở người Mô hình chuột biểu hiện vượt mức Erbb2 cũng hình thành khối u vú tương tự ở bệnh nhân có sự khếch đại Erbb2 (tìm thấy ở 20% bệnh nhân) [4]

Mỗi mô hình đều có ưu nhược điểm riêng Mô hình dị ghép có điểm bất lợi là thời gian khối u tồn tại hạn chế, môi trường phát triển khối u phức tạp, khó kiểm soát và bị giới hạn bởi hệ thống ức chế miễn dịch Bộ gen trong các dòng tế bào qua nhiều lần cấy chuyền và lưu trữ nhiều năm có thể không còn bền vững do đó mô hình dị ghép tế bào này không dùng để tiên lượng sự thay đổi gen trong cơ thể bệnh nhân, không phù hợp với nghiên cứu trị bệnh dựa trên liệu pháp gen

Hình 1 3 Ưu điểm và nhược điểm của các mô hình ung thư dị ghép, chuột hóa người và

biến đổi gen [7]

Mô hình biến đổi gen tuy ổn định, khối u tồn tại lâu dài, phản ánh được những biến đổi gen ở người nhưng chi phí lớn, tiến trình thực hiện phức tạp, chỉ phản ánh một số biến đổi gen nhất định ở một số bệnh nhân cụ thể Mô hình dị ghép thích hợp cho nghiên cứu thử thuốc, còn mô hình GEM thích hợp cho nghiên cứu vai trò của các gen chuyên biệt trong sự phát triển, di căn, mất đi của ung thư [7]

1.2 MIỄN DỊCH UNG THƯ

1.2.1 Kháng nguyên ung thư

1.2.1.1 Các loại kháng nguyên ung thư

Kháng nguyên ung thư là kháng nguyên biểu hiện trên tế bào ung thư nhưng không biểu hiện hoặc biểu hiện ở mức độ khác trên tế bào bình thường Kháng nguyên ung thư có thể là loại chuyên biệt cho một loại ung thư nhất định hoặc thể hiện khác nhau trong nhiều loại ung thư khác nhau

Kháng nguyên ung thư do đột biến: Đột biến oncogene hình thành protein Ras

và Bcr-Abl, protein đột biến gen ức chế khối u p53 có thể cảm ứng tế bào T gây độc (Cytocxity T cell, CTL) và đáp ứng thải loại khối u biểu hiện những protein này Động vật ung thư cảm ứng với hóa chất có những đột biến ngẫu nhiên tạo ra kháng nguyên được trình diện trên MHC I có khả năng kích thích CTL

Protein tế bào bình thường biểu hiện bất thường trong tế bào ung thư như tyrosinase (liên quan tổng hợp melanine, biểu hiện trong tế bào sắc tố da bình thường nhưng biểu hiện vượt mức trong tế bào u sắc tố ác tính) kích hoạt được độc bào T CD8+ và trợ bào T CD4+ Protein biểu hiện trong tinh tử, lá nuôi phôi và trong nhiều loại ung thư (ung thư bàng quang, vú, da, phổi, tuyến tiền liệt, tinh hoàn) nhưng không có trong mô dinh dưỡng bình thường đã được ứng dụng trong nghiên cứu vaccine trị ung thư Một nửa trong số các kháng nguyên này được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể (NST) giới tính X

Virus có bản chất DNA (như virus Epstein-Barr gây ung thư hạch bạch huyết tế bào B và ung thư họng-mũi-hầu; Human apilloma virus-HPV gây ung thư cổ tử cung) tạo ra kháng nguyên nội sinh được trình diện qua MHC I trên bề mặt tế bào ung thư bị nhiễm virus và có tính sinh miễn dịch Vỏ protein của HPV đã được ứng dụng làm vaccine phòng trị bệnh ung thư cổ tử cung cho phụ nữ trên khắp thế giới Virus có bản chất RNA đã được xác định trên người chỉ có HTLV-1 (Human T Lymphotroic Virus-1, gây ung thư máu dòng tế bào T CD4+) tạo ra kháng nguyên

có khả năng gây đáp ứng miễn dịch nhưng không chống ung thư được có thể do tế bào bị ung thư là tế bào T nên cảm ứng chức năng bất thường trong chúng

Gen mã hóa một số protein, mà chỉ biểu hiện trong quá trình phát triển phôi nhưng im lặng trong quá trình phát triển cá thể sau này, có khả năng được giải phóng khi có biến đổi ác tính CEA (kháng nguyên Carcinoembryonic hay CD66 biểu hiện trong ung thư dạ dày, tụy, ruột kết, vú) và AFP (Kháng nguyên α-Fetoprotein, một loại glycoprotein tuần hoàn ở bào thai và được thay thế bởi albumin khi trưởng thành, biểu hiện trong ung thư gan) được sử dụng như marker chẩn đoán ung thư

Các kháng nguyên ung thư dạng glycolipid và glycoprptein như GM2, GD3 (loại glycolipid biểu hiện cao trong ung thư da) và Mucin (glycoprotein có nhiều loại như CA-125, CA-19-9 biểu hiện trong ung thư buồng trứng, MUC-1 ở ung thư vú) có thể sinh miễn dịch (nhận diện bởi các kháng thể đơn dòng và tế bào T) trong bệnh nhân ung thư nên là ứng viên cho vaccine ung thư

Kháng nguyên biệt hóa, biểu hiện trong những dòng tế bào chuyên biệt hoặc các giai đoạn phát triển riêng, như CD10 và CD20 (marker cho dòng tế bào B, biểu hiện mức cao trong ung thư máu dòng tế bào B), được sử dụng làm marker chẩn đoán loại ung thư, xác định nguồn gốc mô ung thư Tuy nhiên do kháng nguyên này cũng hiện diện bình thường trong các tế bào đã biệt hóa bình thường nên không kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh chống khối u [1, 70]

1.2.1.2 Kháng nguyên ung thư vú

Kháng nguyên ung thư vú đã được xác định bao gồm: HER2 (biểu hiện vượt mức ở 20-30% trường hợp); mucin 1 (MUC1, biểu hiện trên bề mặt tế bào biểu mô bình thường, có vai trò bảo vệ tế bào, biểu hiện mức cao ở tế bào ung thư vú [28]); surviving (có vai trò ức chế tế bào chết theo chu trình, hiện diện mức cao ở tế bào ung thư vú, không hoặc hiện diện mức thấp ở tế bào vú bình thường [50, 69]); p53 đột biến (tìm thấy ở 20-40% trường hợp và được xem có vai trò sinh khối u [11]); enzyme phiên mã ngược telomere người (human telomerase reverse transcriptase – hTERT, có vai trò nối dài telomere, giúp tế bào trở nên bất tử, hiện diện trên 90% trường hợp và không tìm thấy ở tế bào vú bình thường [34]); kháng nguyên phôi

thai u quái (carcinoembryonic Ag–CEA) Thử nghiệm in vitro cho thấy HER2 được

nhận diện và trình diện cho tế bào T gây độc chuyên biệt HER2 qua MHC I làm chết tế bào ung thư, tuy nhiên nghiên cứu trên bệnh nhân ung thư lại không tìm thấy

tế bào T gây độc chuyên biệt HER2 trong vòng tuần hoàn [49, 77] Đối với kháng nguyên MUC1, tìm thấy trong máu ngoại vi và tủy xương bệnh nhân ung thư vú có hiện diện tế bào TCL chuyên biệt MUC1 [25] Khối u mang p53 đột biến thường bị xâm nhập bởi tế bào tua CD1a+ hơn trường hợp biểu hiện HER2 hay MUC1 Các tế bào tua này trình diện kháng nguyên p53 đột biến qua MHC II và trong khối u cũng

có lượng lớn bạch cầu lympho xâm nhập khối u TIL CD45RO+ [46] CTL chuyên biệt surviving được tìm thấy trong máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vú nhưng không hiện diện ở người khỏe mạnh [6] Hiện nay vẫn chưa tìm thấy bằng chứng về đáp ứng miễn dịch với hTERT trong ung thư vú nhưng có đáp ứng ở những dạng ung thư khác [74].

1.2.2 Khả năng “lẩn trốn” miễn dịch của ung thư

1.2.2.1 Các cơ chế lẩn trốn miễn dịch của ung thư

Ung thư ác tính có khả năng “trốn thoát” miễn dịch của cơ thể Tế bào ung thư phát triển theo hướng chọn lọc dòng có khả năng kháng miễn dịch theo nhiều cơ chế

Kháng nguyên ung thư có thể cảm ứng dung nạp miễn dịch đặc hiệu Trong khối

u có tế bào T điều hòa thâm nhập có khả năng ức chế tế bào T gây độc Các tế bào ung thư âm tính với kháng nguyên (loại kháng nguyên không cần thiết cho sự phát triển hoặc được nhận diện bởi CTL) được ưu tiên tăng trưởng MHC I được điều hòa âm trong tế bào ung thư Hầu hết tế bào ung thư không biểu hiện tác nhân đồng kích hay phân phân tử MHC II Các chất tiết từ tế bào ung thư như nhân tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF-β, Transforming Growth Factor-β) ức chế sự tăng sinh

và hoạt động của tế bào lympho và đại thực bào; Fas Ligand (FasL) gây ra sự chết theo chương trình của bạch cầu Kháng nguyên ung thư có thể được bọc lại bởi phân tử glycocalyx do tế bào ung thư sản xuất nên không bị nhận diện bởi các tế bào trình diện kháng nguyên Tế bào ung thư có khả năng điều biến kháng nguyên, khi có kháng thể chuyên biệt hiện diện tế bào không trình diện kháng nguyên đặc

hiệu tương ứng trên bề mặt, nhưng khi kháng thể này mất đi tế bào lại tái trình diện kháng nguyên này Khối u hình thành hàng rào mạch máu vừa cung cấp dinh dưỡng nuôi tế bào ung thư vừa đóng vai trò hàng rào miễn dịch ngăn cản tế bào miễn dịch tấn công khối u Tế bào ung thư hoặc nền ung thư tiết ra các nhân tố có khả năng khóa các thụ thể làm cho tế bào trình diện kháng nguyên không xử lý được kháng nguyên ung thư hoặc không trình diện kháng nguyên ung thư cho tế bào T [1, 70]

1.2.2.2 Khả năng kháng miễn dịch trong ung thư vú

Khối u vú tạo ra dạng môi trường mà trong đó tế bào miễn dịch bẩm sinh có xu hướng hình thành dạng type II và hỗ trợ khối u tăng sinh Tế bào miễn dịch bẩm sinh bao gồm đại thực bào, tế bào tua, tế bào giết tự nhiên, bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân và tế bào ức chế dòng tủy (myeloid derived suppressor cells–MDSC) Các

tế bào này phân thành 2 dạng: type I hoạt hóa đáp ứng miễn dịch thích ứng type I, sản xuất cytokine tiền phản ứng viêm và các tác nhân ức chế; trong khi type II hoạt hóa đáp ứng miễn dịch thích ứng type II, sản xuất cytokine kháng phản ứng viêm và tác nhân hỗ trợ khối u Khối u tiết ra môi trường xung quanh các tác nhân kích hoạt type II của miễn dịch bẩm sinh Tế bào ung thư và tế bào nền khối u tiết cytokine kháng viêm như IL-10 và TGF-β làm suy yếu khả năng tiết cytokine tiền phản ứng viêm của tế bào miễn dịch [31, 42] Tế bào T điều hòa (Treg) thường hiện diện mức cao trong khối u vú tiết các tín hiệu kháng viêm hoặc các tác nhân tiêu diệt tế bào miễn dịch bẩm sinh như granzyme và perforin [43, 76] Các thành phần chất nền ngoại bào (ECM) như collagen có khả năng chống độc tính kháng tế bào ung thư, thúc đẩy điều biến hoạt tính thực bào của đại thực bào Thụ thể collagen như thụ thể giống globulin miễn dịch liên quan bạch cầu (Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor–LAIRs) hiện diện trên tế bào miễn dịch, bất hoạt độc tính tế bào giết tự nhiên và gây ức chế miễn dịch chống ung thư [72]

Tế bào miễn dịch bẩm sinh type II thúc đẩy khối u phát triển Đại thực bào tiết các nhân tố tăng trưởng như nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF), thúc đẩy tế bào ung thư tăng sinh; nhân tố tiền tăng mạch như nhân tố tăng trưởng nội mạch (VEGF), prostaglandin E2 và IL-8 giúp tăng sinh mạch máu xung quanh khối u Đại

thực bào có thể thúc đẩy sự xâm lấn và di căn của ung thư vú do tiết các nhân tố như Matrix Metalloproteinase (MMP) mà làm suy thoái phân tử chất nền ngoại bào; nhân tố tăng trưởng biểu mô mà thúc đẩy tế bào u vú dạng xâm lấn tăng trưởng [20,

29, 62] Đại thực bào còn tiết lượng lớn TGF-β; IL-10; ligand 1 cho thụ thể tế bào chết theo chương trình (PDL1) cảm ứng tế bào T chết; chemokine CCL22 thu hút tế bào T điều hòa ức chế miễn dịch [19]

Hơn nữa, tế bào miễn dịch bẩm sinh như tế bào tua có thể phân giải arginine trong vi môi trường khối u gây ra sự chết theo chương trình của tế bào T và ngăn cản đáp ứng miễn dịch thích ứng Tế bào dòng tủy chưa trưởng thành như MDSC

có khả năng ức chế đáp ứng miễn dịch bằng cách khóa sự trưởng thành tế bào tua

và hoạt hóa tế bào giết tự nhiên [51, 67] Một số tế bào ung thư biểu hiện TLR và các ligand cho TLR có thể thúc đẩy tính ác tính và di căn của khối u [35]

1.2.3 Tế bào tua

1.2.3.1 Đặc tính sinh học của tế bào tua

Tế bào tua (Dendritic cell, DC) là loại tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen Present Cell, APC) chuyên nghiệp nhất APC biến đổi protein thành các phân mảnh peptide được gắn lên MHC (phức hợp phù hợp mô) tạo thành MHC-peptide và trình diện cho tế bào T; đồng thời tiết các nhân tố đồng kích thích cần thiết cho sự nhận diện kháng nguyên thông qua MHC của tế bào T và cho đáp ứng miễn dịch hoàn chỉnh của tế bào T Tế bào tua hoạt hóa cả tế bào T non và tế bào T nhớ trong khi đại thực bào trình diện kháng nguyên cho tế bào T đặc hiệu, tế bào B trình diện kháng nguyên cho trợ bào T

DC hiện diện trong các cơ quan lympho (lách, hạch bạch huyết), trong biểu mô

da và các ống tiêu hóa và ống hô hấp, và trong tế bào kẽ của hầu hết cơ quan nhu

mô Các loại DC khác nhau bởi marker khác nhau và đóng vai trò khác nhau trong đáp ứng miễn dịch DC tăng sinh từ tế bào tiền thân trong tủy xương và hầu hết là

DC dòng tủy là dòng thực bào đơn nhân DC biểu mô là tế bào Langerhans của biểu

bì, chiếm đến 25% bề mặt tế bào biểu bì mặc dù thực ra chỉ cấu thành 1% quần thể

tế bào DC biểu mô và mô vẫn ở trạng thái chưa trưởng thành Trong đáp ứng bắt

các thành phần vi sinh, DC trưởng thành trong khi chúng di cư đến hạch lympho và trở nên hiệu quả cho sự trình diện kháng nguyên và kích thích tế bào T non DC trưởng thành cư ngụ trong vùng tế bào T (T cell zone) của hạch bạch huyết và trình diện kháng nguyên cho tế bào T

DC có khả năng đặc biệt để thực bào các tế bào nhiễm virus hoặc ung thư và trình diện kháng nguyên từ những tế bào này lên MHC I Con đường trình diện kháng nguyên này ngược với quy tắc thông thường (kháng nguyên bị thực bào vào trong bóng màng được trình diện trên MHC II), protein của tế bào bị thực bào được

xử lý thành peptide nội bào và gắn vào MHC I Quá trình này gọi là trình diện chéo, hay cross-priming, cho thấy một loại tế bào (DC) có thể trình diện kháng nguyên từ

tế bào khác (tế bào ung thư và bị nhiễm virus) và hoạt hóa tế bào T đặc hiệu cho những kháng nguyên này

Tế bào B cũng nhận diện kháng nguyên hòa tan và cả kháng nguyên trình diện bởi DC Loại tế bào tua chuyên biệt này gọi là tế bào tua nang (DC follicular) trình diện kháng nguyên để hoạt hóa tế bào B trong trung tâm mầm [1, 70]

Sự trưởng thành của tế bào tua

DC chưa trưởng thành có các thụ thể gắn với kháng nguyên lạ, bắt và chế biến protein lạ thành peptide gắn vào MHC Đồng thời có thụ thể Toll-like nhận diện phân tử lạ gây hoạt hóa tế bào làm tiết cytokine như TNF (Tumor necrosis factor, nhân tố hoại tử mô) cần thiết cho sự trưởng thành của DC Khi đó DC mất kết dính với biểu mô và biểu hiện thụ thể cho CCR7 (một loại chemokine được sản xuất tại vùng tế bào T của hạch bạch huyết) nên bị thu hút đến hạch bạch huyết và trình diện kháng nguyên cho tế bào T non và hoạt hóa tế bào lympho DC trưởng thành biểu hiệu mức cao MHC II gắn với peptide và tác nhân đồng kích thích cần thiết cho sự

hoạt hóa tế bào T Quá trình trưởng thành có thể được tạo ra trong in vitro bằng

cách nuôi cấy DC từ tủy xương với các cytokine (như TNF và nhân tố kích thích tập đoàn đại thực bào hạt GM-CSF, Granulocyte Macrophage Colony Stimulating

Factor) và sản phẩm vi sinh vật (như endotoxin) Biệt hóa in vitro bạch cầu đơn

nhân thành tế bào tua bằng các tín hiệu trưởng thành như GM-CSF và IL-4 (104)

Tế bào tua trưởng thành biểu hiện các marker bề mặt CD40, CD80, CD83, CD86, HLADR, s100 và DC-LAMP (protein màng liên quan đến lysosomal tế bào tua, DC Lysosomal-Associated Membrane Protein) [1, 70]

Bạch cầu đơn nhân là nguồn tạo tế bào tua chủ yếu bằng cách biệt hóa chúng thành tế bào tua nhờ các tín hiệu trưởng thành như GM-CSF và IL-4 [61] Phụ thuộc vào loại tín hiệu trưởng thành dùng trong nuôi cấy bạch cầu đơn nhân, tế bào tua đã biệt hóa có khả năng tiêu diệt khối u khác nhau William P và cộng sự đã gây

ức chế sự tăng trưởng của khối u vú trên chuột bằng cách tiêm tế bào tua được biệt hóa từ bạch cầu đơn nhân nhờ protein dung hợp GM-CSF và IL-21 [75] Tế bào tua thu từ nguồn bạch cầu đơn nhân được xử lý với TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IFN-α và TLR3 cho hiệu quả kháng ung thư cao gấp 40 lần so với tế bào tua trưởng thành trong môi trường chứa TNF-α, IL-1β và IFN-γ Vì vậy có thể thấy TLR3 có vai trò

quan trọng trong hiệu quả kháng ung thư của tế bào tua thu từ nuôi cấy in vitro [44]

1.2.3.2 Tế bào tua trong ung thư vú

Bên trong khối u vú của bệnh nhân có sự hiện diện của tế bào tua chưa trưởng thành CD1a+ nhưng vùng ngoại vi xuất hiện DC trưởng thành CD83+ (chiếm 63% mẫu khối u) và cũng biểu hiện DC-LAMP, MHC II Một số DC CD83+ tạo thành cụm với tế bào T CD3+ và CD8+ Sự hiện diện của DC CD83+ có thể liên quan đến

sự biểu hiện mức thấp các cytokin ức chế bên trong khối u, VEGF và TGFβ [18]

DC hiện diện trong hạch bạch huyết đầu tiên được dẫn lưu từ khối u (SN, Sentinel Node) chủ yếu là dạng DC chưa trưởng thành Ngược lại, DC trong hạch bạch huyết khác chủ yếu là DC trưởng thành, đã được hoạt hóa s100+,MHC II+ Nguyên nhân có thể là tế bào ung thư vú tiết các cytokine ức chế miễn dịch vào SN ngăn cản đáp ứng miễn dịch đặc hiệu DC trưởng thành có thể tăng mức biểu hiện trong hạch bạch huyết khi điều trị cho bệnh nhân ung thư vú với các tác nhân như GM-CSF Lượng DC trong máu bệnh nhân giảm sau khi hóa trị [18]

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy DC trong bệnh nhân ung thư vú bất thường

về chức năng DC trong cơ thể bệnh nhân ung thư giảm tính cảm ứng đáp ứng tế bào lympho, MHC I mất hiệu quả làm hạn chế đáp ứng nhắc lại VEGF do tế bào

ung thư vú sản xuất thúc đẩy sự tăng sinh mạch máu đồng thời có khả năng ức chế

sự trưởng thành và chức năng của DC in vitro (Gabrilovich DI và cộng sự, 1997)

1.2.4 Tình hình nghiên cứu điều trị ung thư vú bằng liệu pháp tế bào tua ở Việt Nam và thế giới

Điều trị ung thư vú bằng liệu pháp miễn dịch có các chiến lược: sử dụng kháng thể chuyên biệt, thiết kế vaccine phòng và trị ung thư vú, dùng các tác nhân kích thích hệ miễn dịch hoạt động chống khối u hoặc khóa những tác nhân ức chế miễn dịch do khối u sản xuất ra Vaccine trị ung thư vú có thể là DNA (DNA mã hóa cho một số kháng nguyên tinh sạch đơn lẻ hoặc các phân mảnh DNA tổng số của toàn tế bào) và tế bào tua [22]

Tế bào tua có tính ưu việt trong trình diện kháng nguyên, đặc biệt là kháng nguyên ung thư, kích hoạt được hệ thống miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào ung

thư Nhưng trong điều kiện in vitro, tế bào tua có khả năng trình diện được kháng

nguyên ung thư cho độc bào T và dẫn đến tiêu diệt tế bào ung thư Các nhà khoa học cho rằng có thể sử dụng tế bào tua của cơ thể, biến đổi và cảm ứng trình diện

kháng nguyên in vitro sau đó đưa vào cơ thể bệnh nhân, DC này trình diện kháng

nguyên cho tế bào T CD4+ và CD8+ và dẫn đến tiêu diệt tế bào ung thư [18]

Trong nghiên cứu DC trị ung thư vú cần quan tâm đến: nguồn và cách chuẩn bị DC; hoạt tính của DC; nguồn kháng nguyên ung thư; kĩ thuật cảm ứng kháng nguyên và quy trình tiêm chủng DC [18]

Có ba nguồn DC từ bệnh nhân: DC trong máu ngoại vi (chọn lọc bằng gradient đẳng tỷ trọng hoặc miễn dịch đánh dấu điện từ, chỉ chiếm 1% nên ứng dụng rất hạn chế); tế bào miễn dịch đơn nhân-monocyte thu từ máu ngoại vi và tế bào tiền thân

đơn nhân tủy xương nuôi cấy in vitro với cytokine GM-CSF và IL-4 tạo ra DC có

chức năng như DC non trong máu; tế bào gốc tạo máu CD34+ cũng là nguồn DC được quan tâm trong nghiên cứu lâm sàng Nguồn kháng nguyên ung thư có thể là: khối u/tế bào ung thư phân giải; epitop peptide và protein kháng nguyên chuyên biệt; nucleic acid xác định kháng nguyên ung thư tổng số; và dung hợp tế bào ung thư và DC [18]

Báo cáo đầu tiên sử dụng vaccine DC cho ung thư vú được tiến hành trên chuột được tiêm chủng dưới da với hỗn hợp DC chưa trưởng thành từ tủy xương và tế bào ung thư bị chiếu xạ Kết quả cho thấy khối u giảm kích thước và có sự kích hoạt CTL (Conveney E và cộng sự, 1997) Chuột mô hình hóa người chủng NOD/SCID

dị ghép tế bào ung thư người được tiêm chủng phối hợp DC và tế bào T DC thu từ tủy xương này đã được nạp dịch phân giải khối u và đồng nuôi cấy với tế bào T Khối u còn lại chủ yếu là mô nền có hiện diện tế bào T CD8+, CD4+; tế bào T nhớ CD45RO+ và tế bào T non nhớ CD45RA+ [25] DC cần thiết cho hiệu quả của miễn dịch thích nghi của tế bào T Hiệu quả điều trị có thể tăng lên khi phối hợp DC với độc bào T hoặc tế bào T nhớ Ứng dụng lâm sàng trên một bệnh nhân ung thư vú giai đoạn IV, tiêm chủng Monocyte-DC đã nạp dịch khối u phân giải tự thân vào hạch u bạch huyết ác tính trên xương đòn cho thấy có hiệu quả giảm thế tích các hạch bạch huyết ở hai phía đối nhau trên xương đòn nhưng khối u không bị ảnh hưởng, kháng nguyên u quái (Carcinoembryonic antigen, CEA) và kháng nguyên ung thư Ag 15.3 trong huyết thanh vẫn tăng lên [39]

Hình 1 4 Điều trị ung thư vú bằng vaccine tế bào tua [53]

Ứng dụng khác của liệu pháp DC là sử dụng các kháng nguyên hay epitope peptide chuyên biệt cho việc trình diện kháng nguyên HER2 có gây đáp ứng miễn dịch dịch thể đã được thử nghiệm làm vaccine dạng đơn hoặc kết hợp với Flt3 hay

DC đến pha I/II Chín bệnh nhân biểu hiện mức cao HER2, ở giai đoạn di căn được thử nghiệm tiêm chủng với DC được nạp đoạn peptide của HER2 mỗi ba tuần/lần cho thấy có hiệu quả điều trị nhất định Một bệnh nhân ổn định được tình trạng di căn xương trong sáu tháng, ba bệnh nhân không tái phát bệnh trong vòng hai năm rưỡi nhưng những người khác vẫn tiếp diễn bệnh theo hướng xấu đi như bệnh nhân không điều trị [47] Các kháng nguyên ung thư vú khác như MUC1 và CEA được dùng để cảm ứng DC và đã thử nghiệm trên một số bệnh nhân di căn giai đoạn IV, tuy nhiên hầu hết bệnh nhân không có đáp ứng miễn dịch rõ ràng (IFNγ và chất độc bào tăng trong máu bệnh nhân nhưng độc tính với tế bào ung thư lại không hiện diện) với khối u và bệnh vẫn tiếp diễn [12]

Adenovirus (virus DNA) chứa cDNA kháng nguyên ung thư xâm nhiễm vào DC

sẽ tạo ra kháng nguyên ung thư bên trong DC và được trình diện qua MHC I của

DC nhờ đó hạn chế được những giới hạn trong bắt, xử lý và trình diện kháng nguyên ung thư thuộc MHC II DC được chuyển gen HER2+ và MUC1 đã được thử nghiệm đến pha II/I trên bệnh nhân nhưng hiệu quả còn thấp, một số bệnh nhân ổn định được bệnh trong 3 tháng, tăng IFN-γ của CTL chuyên biệt cho kháng nguyên ung thư nhưng số khác bệnh vẫn tiếp diễn [17, 54]

Dung hợp DC với tế bào ung thư vú bằng các tác nhân gây mất ổn định màng như hóa chất và dòng điện có lợi điểm là tế bào tua có thể trình diện toàn bộ kháng nguyên ung thư Thử nghiệm cận lâm sàng trên chuột cho thấy DC dung hợp tế bào ung thư vú ngăn cản ung thư phát triển khi tiêm vào chuột mô hình biến đổi gen [16] Thử nghiệm lâm sàng pha I đang tiến hành trên bệnh nhân có thể sẽ mang lại những kết quả đầy hứa hẹn [9]

Một số loại thuốc trị ung thư có thể hoạt hóa miễn dịch bẩm sinh khi điều trị ở liều thấp và phối hợp với tế bào miễn dịch Khi phối hợp tế bào tua với liều thấp

vinblastine cho kết quả : tăng sản xuất các tiền kháng interleukine ; điều hòa làm tăng biểu hiện CD40, phức hợp MHC II và các phân tử đồng kích thích [68]

Hiệu quả của tế bào tua trị bệnh ung thư vú trong thử nghiệm lâm sàng vẫn còn

giới hạn có thể do các tế bào tua hoạt hóa ex vivo chưa đủ tác động khi chúng phải đối mặt với khả năng ức chế miễn dịch mạnh của khối u in vivo, hoặc do tương tác phức tạp giữa nhiều loại tế bào in vivo nên khi đưa vào thử nghiệm các tế bào miễn dịch không đáp ứng chính xác giống như in vitro Sự hiểu biết về các tương tác tự

nhiên phức tạp này vẫn chưa hoàn thiện, nhưng hiện nay cytokine trong vi môi trường ung thư có thể là chìa khóa để tiêu diệt hay thúc đẩy ung thư Có thể IL-12 là chìa khóa quan trọng trong việc cảm ứng ức chế khối u IL-12 do tế bào tua và đại thực bào tiết ra hoạt hóa tế bào giết tự nhiên và sự biệt hóa của tế bào T giúp đỡ [20, 33] Cả tế bào giết tự nhiên và Th1 sản xuất lượng lớn IFN-γ đáp trả feedback (phản hồi) là tăng cường miễn dịch bẩm sinh Sự hoạt hóa tế bào NK nhờ sự biểu hiện vượt mức IL-12 gây ức chế mạnh sự phát triển của ung thư da [21] IL-12 còn có vai trò kháng sự hình thành mạch máu ở khối u [3]

Nghiên cứu điều trị ung thư vú tại Việt Nam vẫn còn hạn chế, chủ yếu nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý, mô học, tế bào học, đặc tính di truyền của ung thư vú trong cộng đồng người Việt Nam Một số bệnh viện và trung tâm khoa học bước đầu có những nghiên cứu chuyên sâu về việc điều trị ung thư vú bằng những phương thuốc mới (công nghệ nano cho thuốc trị ung thư vú tiến hành tại Viện Hóa học miền Nam; chiết xuất, tìm kiếm thành phần hóa học trị bệnh trong các bài thuốc dân gian), hoặc cải tiến kĩ thuật phẫu thuật, xạ trị, hóa trị nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và phù hợp hơn với người Việt Nam

Tuy nhiên, nghiên cứu điều trị ung thư vú bằng liệu pháp hiện đại như sử dụng

tế bào tua, mới bắt đầu được triển khai từ năm 2010 Các nghiên cứu này tập trung vào hướng tạo nguồn tế bào tua từ các nguồn khác nhau như máu cuống rốn, máu ngoại vi, tủy xương và cả máu kinh nguyệt Nhóm nghiên cứu tại PTN Tế bào gốc

chứng minh nguồn tế bào thu từ máu kinh nguyệt biệt hóa, trưởng thành in vitro

bằng IL-4, GM-CSF và TNF-α thành tế bào tua; tế bào này biểu hiện CD80, CD86,

HLA-DR, HLA-ABC, có khả năng kích thích tế bào T và sản xuất IL-12 in vitro

[57] Bước đầu đã có những thử nghiệm cận lâm sàng trên mô hình chuột ung thư

vú dị ghép sử dụng tế bào tua thu từ tủy xương và cảm ứng với kháng nguyên tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24-/low cho hiệu quả khả quan (khối u biến mất sau 15-60 ngày) [56] Từ những kết quả ban đầu có thể đưa đến những tiềm năng thử nghiệm lâm sàng trong tương lai cho bệnh nhân ung thư vú giai đoạn cuối tại bệnh viện Ung bướu Tp HCM

Dòng tế bào VNBC-GFP là dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam biểu hiện mức cao marker CD44+, có tính kháng thuốc mạnh và có tỷ lệ tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- cao Dòng tế bào này được tạo dòng từ nguồn tế bào phát triển trong nuôi cấy sơ cấp mảnh mô ung thư vú người Việt Nam Sau đó dòng tế bào này được chuyển gen GFP bằng lentivirus tạo thành dòng tế bào chuyển gen GFP bền vững, biểu hiện mạnh GFP, dễ dàng phát hiện được bằng kính hiển vi huỳnh quang

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng Mus Musculus var Albino sạch bệnh, được nuôi ở điều kiện

chuẩn (nước, chuồng nuôi, thức ăn và vật liệu lót chuồng đều được khử trùng sạch bằng nhiệt hoặc chiếu xạ) do Viện Pastuer Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Chuột cái khỏe mạnh, từ 10–12 tuần tuổi, cân nặng 25–30 gram được dùng trong thí nghiệm tạo mô hình chuột ung thư vú

Chuột đực khỏe mạnh, từ 6–8 tuần tuổi, cân nặng 18–20 gram được dùng trong thí nghiệm thu nhận tủy xương để thu tế bào tua

2.1.2 Hóa chất

2.1.2.1 Hóa chất nuôi tế bào ung thư vú

Môi trường nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư vú từ mảnh mô là môi trường M171 (Invitrogen, Carlsbad, CA) có chứa 0,4% dịch chiết tuyến yên bò (BPE), 5µg/ml insulin bò, 0,5µg/ml hydrocortisol, 3ng/ml nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF

Môi trường nuôi cấy dòng tế bào VNBC-GFP: môi trường DMEM-F12 (Lonza, Basel, Switzeland) bổ sung 10%FBS–huyết thanh thai bò và 1% kháng sinh (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo)

Hóa chất tách tế bào: dung dịch trypsin/EDTA 0,25% (Sigma)

Đông lạnh mảnh mô: môi trường đông lạnh (Sigma)

2.1.2.2 Hóa chất tạo mô hình

Tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch sử dụng 2 hóa chất:

- Busulfan (Sigma) dạng bột hòa tan trong dung dịch DMSO

- Cyclophosphamide (Endoxan, Baxter, Đức) dạng bột hòa tan trong dung dịch PBS

Hóa chất cố định mẫu khối u vú thu từ chuột: Paraformandehide 4% (Sigma để cắt lát mô Parffin); Tissue freezing medium (Jung, Đức để cắt lát mô lạnh)

2.1.2.3 Hóa chất nuôi tế bào tua

Môi trường nuôi tế bào tủy xương bám dính ban đầu là môi trường RPMI –

1640 (Sigma-Adlrich, Saint Louis, Mo) bổ sung 2mM/L glutamine, 100µg/ml penicilin, 100µg/ml streptomycin và 10% FCS, huyết thanh thai bê bất hoạt nhiệt Môi trường biệt hóa tế bào tua giai đoạn một: môi trường CM1 chứa môi trường RPMI–1640 bổ sung 20ng/ml GM-CSF và 20ng/ml IL-4 (Santa Cruz, Biotechnology)

Môi trường biệt hóa tế bào tua giai đoạn hai: môi trường CM2 chứa môi trường RPMI–1640 bổ sung bổ sung 20ng/ml GM-CSF và 20ng/ml IL-4 và 20ng/ml TNF-

α (Santa Cruz, Biotechnology)

2.1.2.4 Hóa chất khác

a Dung dịch muối đệm phosphate

Dung dịch muối đệm phosphate–PBS: 0,0027M KCl; 0,000176 KH2PO4; 0,0081M Na2HPO4.12H2O và 0,137M NaCl; được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, áp suất 1atm và bảo quản ở nhiệt độ phòng