Nghiên cứu đặc điểm gen h5 và n1 của virus cúm AH5N1 phân lập tại việt nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm.. Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đâ

NGUYỄN THỊ BÍCH NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VACXIN THẾ HỆ MỚI

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 30 15

THÁI NGUYÊN, 2012

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ

lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong

nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và

Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9)

Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt

là “vùng kháng nguyên 2” (vị trí 152 – 157) và điểm cắt của enzym protease ở vị trí

chuỗi nối giữa HA1 và HA), hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch

Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm

Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây dịch cúm gia cầm

đã bùng phát ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm

2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong cả nước Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại

kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi Hiện tại, năm 2011 và những tháng đầu năm

2012, cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam, làm cho tình hình dịch tễ quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng phức tạp hơn

Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (type 5) và NA (type 1) ở các chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần thiết, nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ phân tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả

Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại

Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”

2 Mục tiêu của đề tài

1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm

A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011

2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho

nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới

3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định

mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011

Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho thấy sự đa nhiễm các clade của virus cúm gia cầm ở từng thời điểm, từ khi xuất hiện tại Việt Nam đến nay, đó là clade 1, 1.1, clade 2.3.4 (2.3.4.3) và clade 2.3.2 (2.3.2.1) tại

Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR và giải trình

tự để phân tích thành phần gen

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Do hệ gen của virus cúm A/H5N1 là hệ gen phân đoạn, luôn biến đổi và thích ứng - đặc biệt là 2 gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1), việc theo dõi thông tin di truyền của virus cúm A/H5N1 là hết sức cần thiết, vì đây là những dữ liệu cung cấp thông tin về sự tiến hóa của virus và khả năng tái tổ hợp tạo nên một biến chủng mới trong quần thể virus cúm gia cầm

Xác lập trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm sinh học phân tử của toàn bộ phân đoạn gen H5 và N1 của gia cầm, thuỷ cầm ở một số chủng phân lập qua các năm

từ 2004 đến nay sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng để tìm hiểu về dịch tễ học và mối quan

hệ nguồn gốc tiến hoá của loại virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam và thế giới trong thời gian qua Việc phân tích trình tự nucleotide của các chủng virus còn có ý nghĩa lớn trong việc xác định biến đối di truyền của các chủng tại các địa phương khác nhau, các vùng địa lý và quốc gia khác nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở mức độ sinh học phân tử

Mặt khác, do virus cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng virus phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về bộ mã di truyền và đặc tính kháng nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh So sánh giống và khác nhau của trình tự nucleotide và amino acid từ các chủng phân lập hàng năm, giúp chúng ta tìm hiểu những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM

1.1.1 Virus cúm và phân loại virus cúm

Virus cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân thành các nhóm:

1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật (gia cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho loài người Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc những trận đại dịch toàn cầu

2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người, chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu

3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn

Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động vật có xương sống Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF(hemagglutinin esterase fusion)

4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương sống (muỗi, rận biển) Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP (glycoprotein)

Virus cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các glycoprotein bề mặt HA và NA Hiện nay, người ta đã xác định được 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) Từ năm 1980, việc xác định phân type HA

đã được tiêu chuẩn hóa cho tất cả các virus cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và người Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương phục hồi sau khi mắc bệnh và kháng thể đơn dòng được dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của virus cúm trong từng phân type Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope trong từng kháng nguyên như so sánh HA của các virus H1N1 từ gà tây và lợn để thiết lập mối quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng [18]

1.1.2 Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm A/H5N1

Năm 1959, lần đầu tiên phát hiện chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở gia cầm được coi là chủng cổ điển Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm 1996, virus cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc) cho thấy đây là chủng đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm vừa qua [126] Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA (H5) cho quá trình tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông năm 1997, nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ virus cúm A có ở chim cút [57] Riêng nguồn gen NA (N1) trong cấu trúc của gen đã có hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein

neuraminidase và đột biến “xóa gen” của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus

cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86]

Năm 1997, virus cúm A/H5N1 gây bệnh tại Hồng Kông làm chết 6 người trong tổng số 18 người bị nhiễm Do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1 nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus đã biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới [33],

đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên clade (clade) 1 có độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong những năm 2001 - 2002 Tiếp tục trong năm 2002 - 2003, gen HA(H5) có những đột

biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên

biến chủng có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang người [56] Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [34], [45]

Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện từ năm 2001, nhưng đến cuối năm 2004 mới chính thức được công bố [5], [7] Virus H5N1 thể độc lực cao và H5N2,

H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm 2001 và 2003 [122].Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải clade 1 thuộc phân dòng Quảng Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003 [71] Tiến hóa chủng/phân type và phân dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát từ phía của Nam Trung Quốc [107], [118], [122] Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong các năm 2004 - 2005 [107] Tuy nhiên, xét về di truyền học phân tử và tính kháng nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông [34] và bắt đầu phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.1)

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á Các mũi tên chỉ

vùng xuất phát và thời điểm lan truyền của virus [45]

Từ cuối năm 2005, ngoài phân dòng chính Quảng Đông tiếp tục lưu hành, còn có nhiều phân dòng khác của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất hiện của phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc,

Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan [78], [107], tràn sang Trung Á, châu Âu và châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người [47], 106]

Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không

thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm cắt

protease là (-RRRK-) đã giảm mất một lysine (K) so với các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông [107], vì thế kể từ năm 2006 đến nay, có nhiều chủng virus cúm A/H5N1 thuộc nhiều clade (clade) khác nhau cùng tồn tại gây bệnh trên thế giới, trong đó có Việt Nam [94] Trong các năm 2006 - 2008, dịch cúm gia cầm xảy ra không ác liệt như những năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm A/H5N1 có biến động kháng nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở nên phức tạp hơn [53], [128]

1.1.3 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam

Kể từ khi cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông

(A/Gs/CN/Gd1/1996(H5N1) [126], cho đến nay có tất cả 12 genotype được hình thành(Hình 1.2A)

Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E) nhưng thêm nhiều genotype kế tiếp, bao gồm GD, A, B, C, D, E, X(X0-X3), V, Y, W, Z(Z+) và G, tiếp tục tiến hóa xuất hiện

và tồn tại 8 genotype của H5N1 (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) [85]

Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là

bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của virus cúm A/H5N1 [125]

Các chủng virus A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004 - 2006 thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: dưới nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt Nam và dưới nhóm S (South) phân bố ở phía Nam [94], [107] Từ năm 2001 đến 2007,

đã có 9 nhóm di truyền là VN1 – VN9 (genotype) xuất hiện hoặc xâm nhập vào Việt Nam, được xác định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành genotype [117] (Hình 1.2B), theo đó dựa trên thành phần H5 chúng thuộc vào các clade khác nhau

Hình 1.2 (A) Hình thành các genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen khác nhau,

(B) Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm A/H5N1 [45]

Các nhóm di truyền và clade, cụ thể đó là: VN1, năm 2001 (clade 3), VN2, năm

2003 (clade 5), VN3, các năm 2003 – 2007 (clade 1), VN4, từ năm 2005 (clade 2.3.2), VN5, năm 2005 (clade 0), VN6, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN8, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9, từ năm 2007 (clade 2.3.4) [117] Các chủng thuộc clade 7, dòng Á - Âu đã được xác định ở Lạng Sơn năm 2007 - 2008 và biến mất sau đó [95] và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay [42], [117] Một số chủng virus chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen trong quá trình tiến hoá (Hình 1.3), một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau đó không phát hiện được, số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 phát hiện năm 2009 có nguồn gốc từ vùng

hồ Thanh Hải (Trung Quốc) hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng biến đổi khác nhau

Genotype Z phổ biến hầu hết các nước trong khu vực châu Á Đặc điểm của genotype Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn, và vùng chuỗi nối HA1-HA2 (điểm cắt protease) của protein HA (H5) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus Tuy nhiên, một số virus phân lập tại vùng phía Nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây và Hồ Nam) có sự đa dạng hơn của các type Z, V, W và G Sự xuất hiện của genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W và genotype Z [36]

1.1.4 Biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các clade của virus cúm A/H5N1

Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine

Virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam đa dạng về kiểu hình HA liên quan nhiều đến đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh cho người và clade 2 cũng đã phát triển thành các clade khác nhau trên cơ sở thay đổi về một số amino acid [13]

Thông báo của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho biết, hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 (9] Các phân nhánh này không phải là mới xuất hiện mà

do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành Clade 1.1 có nguồn gốc tứ clade

1 trước đây Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được phát hiện từ chim hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông Cổ, Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào và Hồng Kông và mới đây là Việt Nam [124]

Hiện nay, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam Trong năm 2011, clade 2.3.2.1 đã được phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên hải miền Trung thay thế cho clade 2.3.4 trước đây [50, 123, 124](Phụ lục 3)

Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1 Clade 1.1 đã được phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia gây chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay [123] Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại Việt Nam, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm

và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vaccine hiện nay không có đáp ứng miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011 Kết quả thí nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7 ngày Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể gây chết 60 – 70% vịt) (http://www.cucthuy.gov.vn/)

Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người Tuy nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây bệnh trên người [124] Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích hợp Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền

từ gia cầm sang người

1.2 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA VIRUS CÚM A

Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix) Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một

ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của virus, mỗi gai

có độ dài từ 10 - 14 nm Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein Có hai loại glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1

Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình 1.4B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tư: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) [91], [103] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.4C)

Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có

cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus

HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập vật liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp để giải phóng virus từ các tế bào cảm thụ Các glycoprotein HA và NA quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để các loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vaccine Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate [91]

(A)

Hình 1.4 (A) Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi

điện từ truyền qua (Nguồn: Dr Erskine Palmer, Centers for Disease Control and Prevention

Public Health Image Library), (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (hemagglutinin: phân tử

kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị

phức hợp enzym polymerase của virus), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

của virus cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge)

Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [70], [121] Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections) Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc

lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [65], [126]

H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm Để khắc phục điều này,

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse genetics -based technology) Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây bệnh Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn

1.2.2 Cấu trúc hệ gen của virus cúm A

Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của virus

Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là AGUAGAACAAGG và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC [70] Sáu phân đoạn (từ 1- 6) mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và

5'-8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [70] Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus

Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự bám dính của virus và là thụ thể của virus, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus

Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein

Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng của một enzym cắt thụ thể để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào

Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng

"gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên

và giải phóng virus

Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm, bao gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận chuyển các thành phần của virus qua màng

Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm hai tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra không hoàn chỉnh, trở thành virus thiểu năng

1.2.3 Chức năng các phân đoạn trong hệ gen

Phân đoạn 1 mã hoá cho enzym polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã,

có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là:

87 kDa) [70]

Phân đoạn 2 mã hoá cho enzym polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [30]

Phân đoạn 3 mã hoá cho enzym kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85kDa) [30]

Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu) Có 16 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể

lây nhiễm từ chim sang người HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là protein gắn virus vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết hồng cầu và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48kDa và HA2 là 29 kDa) [108], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1

63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350 – 1410 bp [32]

Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2 Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói

và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M

có độ dài khoảng 1027 bp [63]

Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã hoá cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 Tiểu phần NS1 có chức năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu phần NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12kDa), NS có độ dài 890 bp [84]

1.3 CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN HEMAGGLUTININ VÀ NEURAMINIDASE

1.3.1 Protein hemagglutinin (HA)

Protein hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) là kháng nguyên bề mặt đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [73], có vai trò đặc biệt quan trọng

trong quá trình gây nhiễm và góp phần rất lớn quyết định tính gây bệnh của virus Gen

mã hóa kháng nguyên HA là một glycoprotein có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có thể ngăn cản sự ngưng kết

đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI, Hemagglutinin Inhibitory test) Có 16 phân type HA đã được phát hiện, trong đó có 3 phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm đã xảy ra trong lịch sử [91]

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hemagglutinin (lipid bilayer of envelope: Lớp màng bao lipid kép,

4 Major antigenic variable regions: 4 vùng biến đổi kháng nguyên chính, Receptor site: vị trí

bề mặt màng tế bào đích [27]

Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease Đây là vùng quyết định độc lực của virus hay tính gây bệnh của H5N1 Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng và có khả năng làm ngưng kết hồng cầu

HA 1

HA 2

Màng bao lipid kép

và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm[109].

Trên phân tử HA có hai vùng kỵ nước ở tận cùng đầu N và đầu C Vùng kỵ nước ở đầu tận cùng N định hướng cho protein ra khỏi màng tế bào và bị cắt bỏ khỏi

HA trưởng thành, còn vùng tận cùng đầu C (gốc amino acid từ 186-211 của HA2) có nhiệm vụ neo giữ phân tử protein trên vỏ virus [38] Sự biến đổi trong gen mã hoá cho kháng nguyên HA là nguyên nhân gây ra các vụ dịch hằng năm

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [116]

Nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều của gen kháng nguyên hemagglutinin H5 của virus gây bệnh ở gà và H9 ở lợn, cũng như H5 của virus thích ứng gây bệnh trên người cho thấy : virus cúm gà thích hợp với loại tế bào có thụ thể HA chứa acid sialic liên kết với đường galactose góc quay α-2,3, trong khi ở lợn và người virus cúm

có thụ thể thich hợp ở góc quay α-2,6 Vị trí amino acid 226 (aa 226) của tiểu đơn vị

HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ

thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của

galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A) Ở các chủng virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N2 gây bệnh ở người, vị trí này trên protein HA là leucine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,6 sialic acid có mặt ở tế bào biểu mô đường hô hấp dưới của người [108] Các tế bào cảm thụ với virus cúm A của lợn có cả hai loại thụ thể này, do đó lợn được coi là vật chủ trung gian để virus cúm A tiến hóa thích ứng lây nhiễm sang người [108]

Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ [73] Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx, A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm nhiễm bệnh) [25], [68]

Trình tự mã hóa chuỗi nối và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA [73] Protein HA kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa virus Vì thế HA được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus vừa là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm và là cơ sở trong điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [64], [73]

Chuỗi oligopeptide nối giữa HA1 và HA2 thuộc loại hình riêng biệt, đặc trưng cho các biến thể H trong quá trình tái tổ hợp tạo nên biến chủng [58], [115] Chuỗi này chứa một số amino acid mang tính kiềm (basic amino acid) làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình phân type Sự biến đổi thành phần của chuỗi nối quyết định tính độc lực của virus thuộc biến chủng mới [66] Nếu ở điểm cắt của protease càng có nhiều amino acid kiềm (arginine và lysine) thì khả năng HA được phân cắt càng lớn, và quá trình xâm nhập nội bào nhanh dẫn đến tăng độc lực của virus cúm A [27], [115]

Đối với phân type H5N2 chuỗi nối này có cấu trúc VPQRKRKTR Đối với các phân type H vô độc (hoặc nhược độc) của H5N1, H5N2, H5N3, H4N6 và H11N1, loại hình của chuỗi nối này có cấu trúc là VPQRETR [65], [129] Đối với các chủng H5 cường độc, cấu trúc của chuỗi nối là TPQRERRRKKR, trong đó RRRKK quyết định tính gây bệnh của H5N1 Sự đột biến ‘‘giãn nở” chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mã hóa cho các amino acid kiềm có liên quan đến tiến trình tăng cường độc lực của virus và ở các chủng thuộc phân dòng Quảng Đông (Guangdong-like sublineage), các amino acid thông

thường là -RRRKK- [39], [86] còn ở các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến (Fujian-like sublineage) các amino acid của vùng chuỗi nối là -RRRK- [6], [9]

Mức độ gây bệnh của virus cúm A còn phụ thuộc rất lớn đến chức năng hoạt động của vùng tiếp nhận enzym protease để cắt rời HA khỏi thụ thể sialic acid [108] Virus cúm A không có gen tổng hợp enzym protease, mà phải nhờ vào

hỗ trợ của tế bào cơ thể bị nhiễm virus Càng có điểm cắt protease hoàn chỉnh và cắt đặc hiệu, càng có nhiều enzym tham gia cắt thụ thể, thì virus mới nhanh chóng xâm nhập vào tế bào thực hiện quá trình nhân lên tạo nhiều virus mới và mức độ gây bệnh cũng vì thế mà nặng nề hơn Khi cơ thể gia cầm bị đa nhiễm

nhiều vi khuẩn, đặc biệt là tụ cầu khuẩn Staphylococcus và liên cầu khuẩn Streptococcus, thì hoạt động tương tác gây bệnh của virus cúm A càng mạnh mẽ

hơn, do các loại cầu khuẩn này có nhiều protease trợ giúp cho virus cúm trong quá trình thực hiện cắt hemagglutinin khỏi thụ thể để gây bệnh [35]

1.3.2 Protein neuraminidase (NA)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18), là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [24], [116] Phân

tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid

- Tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh

quá trình cởi vỏ bọc “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [116]

- Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu

Virus cúm hình thành nên cơ chế để vượt qua sự bảo vệ của mucin đường hô hấp Chức năng của NA liên quan đến khả năng của virus xuyên qua màng nhầy do phân cắt liên kết giữa mucin và sialic acid, vốn là mối liên kết ngăn cản sự xâm nhập của virus vào các thụ thể chức năng trên tế bào đích [40], [89] Mặt khác, NA có thể phá vỡ trục liên kết màng nhầy và IgA, tạo nên trạng thái ức chế miễn dịch cục bộ từng phần, nâng cao khả năng lây nhiễm của virus cúm và viêm phổi kế phát do vi khuẩn

Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA

là đích tác động của các loại thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [22], [32] Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của

cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [46]

Sự đột biến trượt - xóa gen (slippage-mediated deletion) qua các giai đoạn tiến

hóa là hiện tượng đột biến đặc biệt được phát hiện ở gen NA (N1) và đã được chứng minh rằng thông qua loại hình đột biến xoá gen này, virus cúm A/H5N1 tạo nên một subtype N1 mới có độc lực cao hơn [73], [86]

Trong quá trình tiến hoá của giai đoạn 1996 - 1997, cấu trúc gen NA có hiện tượng xoá đi 57 nucleotide mã hoá cho 19 amino acid và sau đó lại tiếp tục xoá lệch đi

60 nucleotide (mã hoá cho 20 amino acid) tại vùng đầu tận cùng N của protein

neuraminidase Sự đột biến ‘‘xoá gen’’ kiểu này của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86]

Gen N1 của virus cúm A/H5N1 đã trải qua nhiều giai đoạn tiến hoá cho đến khi hình thành thể độc lực cao HPAI thì độ dài của gen chỉ còn lại 1350 nucleotide so với gen N1 trước đó có độ dài 1410 nucleotide Trong hệ gen của virus cúm A, chức năng của gen NA chịu trách nhiệm trong quá trình tổng hợp neuraminidase

Gen NP chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3 loại A, B, C) Gen M chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp matrix protein

Gen NS chịu trách nhiệm quá trình tổng hợp protein không cấu trúc structural protein) Các gen còn lại là PA, PB1, PB2 là các thành phần tạo nên các RNA polymerase

(non-Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở nghiên cứu và ứng dụng đối với các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [118]

Phân tích hệ gen của các phân lập cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy NA, HA và NS1 thường biến đổi nhất trong hệ gen của virus cúm gia cầm [96] Biến đổi trượt xóa amino acid trong protein NA vùng cuống (NA-stalk) có thể làm thay đổi đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 dẫn đến mở rộng phạm vi vật chủ cảm nhiễm [119]

1.4 CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC

Trong đa số trường hợp độc lực virus do nhiều gen quyết định, nhưng một gen (hoặc đột biến trong một gen) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến độc lực của chúng Chuỗi nối giữa HA1 và HA2 chứa một số amino acid mang tính kiềm được mã hoá bởi một chuỗi oligonucleotide, là điểm cắt của protease và là vùng quyết định độc lực của virus [53] Các HA của virus cúm gia cầm độc lực thấp có một amino acid arginine (R)

ở vùng phân cắt [90] HA của virus độc lực thấp chỉ bị phân cắt trong một số ít cơ quan, do đó chỉ gây bệnh nhẹ hoặc gây bệnh không biểu hiện triệu chứng Ngược lại, virus cúm gia cầm độc lực cao có các amino acid mang tính kiềm ở vùng phân cắt, được nhận diện bởi các protease nội bào Protease nội bào có mặt ở khắp nơi nên dễ

dàng gây nhiễm virus cho cơ thể [66] HA của tất cả các virus cúm gia cầm gây chết người đều có khả năng phân cắt cao Điều này chứng tỏ các amino acid mang tính kiềm

ở vùng phân cắt của HA là yếu tố cần thiết quyết định độc lực của loại virus này

Protein NS1 cũng đóng vai trò như một yếu tố độc lực của virus nhờ khả năng thoát khỏi tác động của IFN (interferon) trong quá trình lây nhiễm virus cúm A [75] do

ức chế sự tổng hợp IFN Cùng với việc ngăn chặn đáp ứng của IFN, protein NS1 còn liên kết đặc hiệu với protein của tế bào nhiễm và phá vỡ chức năng của chúng [96] Sự đột biến xoá đi 15 nucleotide (vị trí 263 - 277) của NS làm gia tăng độc tính của virus cúm A/H5N1 [83]

Nhóm RNA-polymerase bao gồm protein PB1, PB2 và PA cũng liên quan đến độc lực của virus cúm A Một số đột biến có thể nâng cao hoạt lực của polymerase và làm tăng độc lực của virus cúm A/H5N1 chủng độc lực cao đã được phát hiện trên chuột [52] Chủng virus cúm A/H5N1 có độc lực trên chuột mã hoá Lysine ở vị trí 627 trong PB2, trong khi đó các chủng A/H5N1 không độc lực trên chuột mã hoá glutamic acid ở vị trí này [59], [77]

Các gen M2 và PB1-F2 có liên quan đến sự thích ứng của virus H5N1 trên vật chủ mới, cũng như sự lây truyền giữa các loài [72], [107] Protein PB1-F2, được tạo thành bởi một khung đọc mở của gen PB1 của virus cúm A, đã làm gia tăng độc lực của virus trên chuột [127] Protein PB1-F2 làm tăng độc lực của virus cúm A do gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các đại thực bào, do đó làm giảm đáp ứng

miễn dịch của cơ thể vật chủ đối với sự lây nhiễm của virus cúm A [37]

1.5 CÁC PHƯƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN

Đặc tính cơ bản của virus cúm A là hệ gen luôn biến đổi, sự thay đổi kháng nguyên theo thời gian tồn tại giúp cho virus lưu hành rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài vật chủ khác nhau [91]

Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [125]

1.5.1 Hiện tượng «lệch kháng nguyên»

«Lệch kháng nguyên» (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra

trong các phân đoạn gen/hệ gen của virus, chủ yếu là ở phân đoạn 4 của phân đoạn HA

(Hình 1.6) Do virus cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế “đọc và sửa bản sao” (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích, cho nên

sự thiếu hụt enzym sửa chữa RNA dẫn đến các enzym sao chép phụ thuộc RNA sẽ có

thể thêm nucleotide (đột biến thêm), làm mất đi (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến điểm) [12] một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA

chuỗi đơn mới trong quá trình nhân lên của virus [41], [91]

Hình 1.6 Minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift) ở virus

cúm A [88]

Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi đặc tính sinh học của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột

biến (đột biến điểm) Tần suất xảy ra đột biến điểm (point-mutation) rất cao, cứ mỗi

10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide sai khác [103] Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa một hoặc hai đột biến điểm trong hệ gen của nó và như vậy, các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có gen HA với những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch

Sự chuyển dịch lệch kháng nguyên cũng có thể xảy ra với gen NA NA có chứa nhiều phần dư amino acid quan trọng, những phần dư này khi đột biến sẽ làm cho virus kháng lại các thuốc ức chế neuramidase Các đột biến này thường xảy ra tại các vị trí amino acid R152K, E119V, H274Y, R292K Đột biến tại vị trí H274K liên quan đến vấn đề kháng thuốc Oseltamivir (Tamiflu) [76] Lysine (K) thay thế cho arginine (R) ở

vị trí 292 của NA sẽ đưa đến sự kháng thuốc hoàn toàn Đột biến R thành K gắn liền với sự trao đổi nucleotide AGA thành AAA trong gen NA

1.5.2 Hiện tượng «trộn kháng nguyên»

Hiện tượng «trộn kháng nguyên» (antigenic shift) (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các gen kháng nguyên chỉ có ở virus cúm và ở rất ít một số virus RNA gây bệnh

gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao (Hình 1.7)

có thể trao đổi cho nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap)

các phân đoạn gen giữa hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại thành một hệ gen mới, tạo ra các dạng khác nhau của RNA hệ gen ở các hạt virus mới sinh ra, hỗn hợp từ thành phần các phân đoạn của hệ gen từ những virus ban đầu Kết quả là tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [35], [61], [85]

1.5.3 Hiện tượng glycosyl hoá

Thông thường, các virus cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng có mức độ đột biến điểm cao làm thay thế một số nucleotide tại những vị trí mà ở đó có thể tạo nên các amino acid mới có khả năng tiếp nhận carbon hydrate tạo nên hiện tượng glycosyl hoá (glycosylation) Hay nói cách khác, ở virus cúm A (và A/H5N1), glycosyl

hoá là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào với amino acid

asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một

số polypeptide khác Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí NXS hoặc NXT (trong đó, N: asparagine, X: amino acid bất kỳ, trừ proline, S: serine hoặc T: threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh

ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm virus Hiện

tượng «lệch kháng nguyên» sinh ra do đột biến điểm ở một vị trí nào đó hình thành nên

bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hoá xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA

và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà

sự nhân lên của virus [24]

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus

cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù virus này chưa

có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho

người, và rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn) gen HA hay NA, hoặc cả

hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống [23], [56], [74]

1.6 BỆNH CÚM GIA CẦM

1.6.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm lần đầu tiên được mô tả như là bệnh dịch tả gia cầm và được Perroncito báo cáo vào năm 1878 ở Italia, khi đó bệnh bị nhầm lẫn với dạng nhiễm trùng huyết cấp tính của bệnh tụ huyết trùng gia cầm[4]

Từ những năm 1500 - 1978 có khoảng 13 đại dịch cúm đã được ghi nhận, điển hình là các năm 1878, 1818, 1957, 1968 và 1977 [112]

Theo lịch sử ghi nhận, đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 - 1919 do virus cúm A/H1N1, đại dịch cúm châu Á năm 1957 - 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch cúm

Hồng Kông năm 1968 - 1969 do virus cúm A/H3N2, đại dịch cúm Nga năm 1977 do

virus cúm A/H1N1 [11] và gần đây nhất là đại dịch cúm do virus cúm A/H1N1 vào năm 2009

- Năm 1959, phát hiện virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gà tại Scotland, có thể coi đây là biến thể H5N1 đầu tiên trên thế giới

- Năm 1996: virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông

- Năm 1997: Dịch cúm tại Hồng Kông do virus cúm A/H5N1 lần đầu tiên gây bệnh cho cả người và gia cầm [33], [105], [121]

Cuối năm 2003, những đợt cúm gà do virus cúm A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra ở nhiều quốc gia thuộc Đông Nam Á và Đông Á (Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Indonesia ) virus gây bệnh đã được phân lập và định type, chủ yếu là H5N1 có độc lực cao

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người bị nhiễm cúm gia cầm từ năm 2003 đến ngày 06/07/2012 thì toàn thế giới đã có 607 trường hợp người mắc cúm A subtype H5N1, trong đó có 358 trường hợp đã tử vong, riêng Việt Nam có

123 người mắc, trong đó có 61 người tử vong (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua các năm

Ghi chú: M: số người mắc, C: số người chết

Nguồn: Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO, July 6, 2012

Cho đến nay chỉ có hai biến chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 được xem là loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ hợp phân type H7N7 gây đại dịch cúm gà ở châu Âu và H5N1 ở châu Á Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng chứa H5 và H7 đều gây bệnh và chính bản thân H7N7 hoặc H5N1 cũng tồn tại nhiều biến chủng vô độc hoặc độc lực thấp H5N1 mới xuất hiện gần đây ở các nước châu Á là một phân type có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gà trong những năm 1996 - 2010 [81]

Tháng 6/2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố đại dịch cúm do virus cúm A/H1N1 trên toàn thế giới

1.6.2 Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới

Bệnh cúm A/H5N1 còn có nhiều tên gọi khác nhau: Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI - highly pathogenic avian influenza); Bệnh cúm chim (Bird Flu) Trong dân gian thường gọi là “cúm gà”

Virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959, có thể coi đây là chủng virus cổ điển (danh pháp: A-Ck-

Dòng virus A/H5N1 năm 1996 phân lập từ ngỗng (Quảng Đông - Trung Quốc)

là virus cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện [43] Đặc biệt sự khác biệt của gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) đã có những thay đổi lớn trong thành phần chuỗi gen và kháng nguyên miễn dịch Kể từ khi xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997), đến nay virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết ở người Mặc dù về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 đã được phát hiện trước đây [69], [128]

Một biến thể mới của H5N1 khác biệt so với chủng virus Gs-Gd1-1996(H5N1) (dòng Quảng Đông) xuất hiện từ 2005 đó là chủng Phúc Kiến và đã trở thành chủng cúm gia cầm phổ biến tại nhiều tỉnh ở Trung Quốc và lây lan sang Hồng Kông, Lào,

Malaysia, Thái Lan, Việt Nam [9], [82], [107] Từ cuối năm 2005, cúm A/H5N1 chủ yếu là các chủng virus thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu

và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc- Trung Phi và đến nay cũng đã được phát hiện tại Việt Nam

1.6.3 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam

Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên gà lần đầu tiên bùng phát tại Việt Nam ở các tỉnh phía Bắc, trong một thời gian ngắn dịch bệnh đã nhanh chóng lây lan ra 57/64 tỉnh, thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị chết và tiêu huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm [14] Dịch bệnh cúm A/H5N1 vẫn thường xuyên tái phát hàng năm tại nước ta Từ khi dịch bệnh xuất hiện đến nay đã có nhiều trường hợp người bị mắc cúm gia cầm và tử vong (Bảng 1.1)

Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã rải rác xảy ra ở các tỉnh/thành phố: Nam Định,

Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Đắc Lắc, Cà Mau, Quảng Ninh, Hà Nam, Bình

Định và Quảng Ngãi và một số địa phương khác Thông báo của Cục Thú y - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết, kết quả xét nghiệm huyết thanh học các mẫu bệnh phẩm virus cúm gia cầm xảy ra vào tháng 7/2011 của hai tỉnh Quảng Trị và Phú Thọ đều dương tính với nhánh virus mới thuộc clade 2.3.2 Đây là loại virus mới xâm nhập vào Việt Nam và chưa có loại vaccine thích hợp để phòng bệnh Điều đặc biệt là nhánh virus mới này lưu hành ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, duyên hải miền Trung và Tây Nguyên Riêng nhánh virus cũ (clade 1) vẫn lưu hành ở một số tỉnh phía Nam

Như vậy, hiện nay dịch cúm gia cầm ở nước ta đã có sự xuất hiện của nhiều các nhánh virus mới làm cho tình hình dịch tễ và phòng chống trở nên phức tạp trong định hướng đối phó dịch bệnh (http://www.cucthuy.gov.vn/)

1.6.4 Đặc điểm của bệnh cúm gia cầm

1.6.4.1 Triệu chứng bệnh tích ở cúm gia cầm

Các triệu chứng của bệnh cúm gia cầm thay đổi và bị chi phối bởi độc lực của virus, loài cảm nhiễm, tuổi, thời gian tác động, kế phát do vi khuẩn và điều kiện môi trường [28] Thời gian ủ bệnh từ vài giờ đến 21 hoặc 28 ngày Gia cầm mắc bệnh thân

nhiệt cao, chảy nước mắt, đứng tụm một chỗ, lông xù, phù đầu và mắt, da tím tái, xuất huyết cẳng chân Triệu chứng chung là giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn Những triệu chứng trên có thể xảy ra cùng một lúc hoặc riêng rẽ [18] Tỷ lệ chết cao, có khi đến gần 100% Trường hợp cấp tính gia cầm chết xuất hiện chỉ 24 giờ sau khi có triệu chứng đầu tiên và thường kéo dài trong khoảng 48 giờ Mổ khám bệnh tích thấy phù ở niêm mạc khí quản với dịch thẩm xuất khác nhau từ thanh dịch đến casein Hiện tượng xuất huyết và xung huyết được thấy ở hầu hết toàn bộ đường tiêu hoá, bệnh tích này rất giống với bệnh tích của bệnh Newcastle Các biến đổi bệnh tích ở ngan và vịt cũng giống như trên gà Tuy nhiên tần suất biến đổi tập trung chủ yếu ở các cơ quan phổi, túi khí, tim, buồng trứng, xương lồng ngực, cơ quan sinh sản và đường ruột [15], [21]

1.6.4.2 Triệu chứng bệnh cúm gia cầm ở người

Đối với người, sau khi nhiễm bệnh, thời gian ủ bệnh từ 1 đến 5 ngày, trung bình khoảng 3 ngày Bệnh nhân sốt cao 39oC, đau toàn thân, ho nhiều có thể khó thở rồi ngạt thở, kèm theo các rối loạn về thính giác và thị giác Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 gây tỷ lệ tử vong rất cao cả ở gia cầm và trên người, ở người có thể nhiễm cả đường hô hấp trên và dưới [68] Trong trường hợp không xảy ra những biến chứng phức tạp, sự lây nhiễm tự giới hạn và bệnh nhân tự phục hồi trong vòng một tuần Tuy nhiên, nếu trường hợp diễn biến phức tạp, bệnh có thể trở nên trầm trọng thậm chí có thể dẫn đến tử vong ở các trường hợp bị biến chứng đi kèm với bội nhiễm [25], [53]

Virus xâm nhập qua tế bào niêm mạc đường hô hấp trên, phế nang, phế quản Khi virus nhân lên gây hủy hoại biểu mô túi khí, gây xung huyết, xuất huyết và tràn dịch phổi Virus có khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não và có thể đi xuyên qua nhau thai, xâm nhập vào bào thai Người bệnh mất cân bằng điều hòa miễn dịch do hiện tượng tăng cytokine không kiểm soát (cytokine storm) dẫn đến hiện tượng cơ thể

bị suy sụp và nhanh chóng tử vong [74],[99]

1.6.5 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1

Virus cúm A có phổ thích ứng rộng trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người (Hình 1.8)

Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời và ngỗng), tàng trữ nguồn virus gây nhiễm, và là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát [69], [120] Hơn nữa, virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ trong quá trình lây truyền trong tự nhiên [44]

Hình 1.8 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ của biến chủng virus cúm A [65].

Đặc điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi hoặc tái tổ hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các chủng để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ

mới, đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích

ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [65]

Trong lịch sử, các đại dịch cúm xảy ra ở người được vật chủ trung gian là lợn thường có vai trò chuyển tiếp giúp cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên dịch bệnh [130] Virus cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus cúm A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [65], [121]

Một số biến thể cường độc (H5, H7) xuất hiện gần đây do tái tổ hợp với nhiều gen khác nhau, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở chim và gia cầm và ở các loài động vật có vú khác như hổ, mèo ngựa, lợn và người [20], [69], [80]

1.6.6 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào

Virus cúm A khi xâm nhập vào tế bào động vật hay người qua đường hô hấp trên hoặc hệ tiêu hóa, ngay lập tức virus sẽ bám vào lớp màng nhày niêm mạc vật chủ Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà bản chất là glycoprotein chứa acid sialic, sau đó virus qua màng tế bào nhờ loại enzym đặc biệt để vào nguyên sinh chất và nhân tế bào (Hình 1.9) Tại đây, protein HA bề mặt của virus gắn vào thụ thể chứa neuraminic acid của tế bào chủ và tiến hành nhập bào tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”) Tiếp theo là quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của virus với màng endosome, điều này thực hiện được nhờ gai HA chồi lên khi pH trong endosome thấp Sau khi dung hợp, ribonucleoprotein (RNP) và RNA-polymerase vào

tế bào chất RNA-polymerase của virus được hoạt hoá ở giai đoạn này

Hình 1.9 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào [98]

Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 phân đoạn RNA từ hệ gen sợi âm của virus

là tạo ra 10 phân tử protein Sáu phân đoạn (từ 1 đến 6) RNA thông tin (mRNA) được tạo ra và chịu trách nhiệm tổng hợp thành 6 loại protein: HA, NA, NP, PB1, PB2, PA,

còn phân đoạn 7 và phân đoạn 8 do có hai khung đọc trên mỗi phân đoạn, nên có hai mRNA tạo ra cho mỗi phân đoạn để tổng hợp các protein M1, M2 và NS1, NS2

Sau khi hợp nhất màng đã được thực hiện trong “khoang ẩm bào”, nucleocapsid của virus được chuyển vào trong nhân tế bào để thực hiện quá trình tổng hợp RNA nguyên liệu hệ gen cho các virus mới Hệ thống enzym sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các RNA thông tin

Đối với virus cúm, để tổng hợp RNA thông tin, các phân đoạn RNA hệ gen được mũ hoá ở 10 -13 nucleotide ở đầu 5’ với nguyên liệu mũ hoá lấy từ RNA tế bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 (polymerase basic protein 2) của virus RNA sợi đơn âm được chuyển thành RNA sợi đơn dương theo cơ chế bổ sung, và sợi dương này lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA đơn âm mới nhờ RNA polymerase Các sợi RNA được tạo ra là một sợi hoàn chỉnh, không được mũ hóa ở đầu 5' và không được adenyl hóa ở đầu 3', chúng sẽ được bao gói lại để hình thành nên ribonucleocapsid Sau khi được bao gói, ribonucleocapsid được vận chuyển đến màng

tế bào mà ở đó các gai HA, NA, M2 đã được gắn sẵn nhờ hệ thống Golgi chuyển ra và hạt virus mới được hình thành, lúc này NA sẽ cắt thụ thể sialic acid giải phóng virus khỏi tế bào chủ, bắt đầu một quá trình lây nhiễm mới

Quá trình phiên mã, sao chép của virus cúm đặc biệt khác với các RNA virus khác là quá trình này chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị nhiễm Thời gian xâm nhiễm và giải phóng hạt virus mới của virus cúm kéo dài trong vài giờ, các hạt virus mới được tạo thành không làm tan tế bào bị nhiễm, nhưng các tế bào này dường như không còn khả năng sống sót do rối loạn ở hệ thống tổng hợp các đại phân tử sinh học

1.6.7 Phương thức lây truyền của virus cúm gia cầm A/H5N1

Các loài chim di trú là một trong những nguồn phát tán virus cúm A/H5N1 Chim bị nhiễm giải phóng virus H5N1 ở trong nước bọt, dịch mũi và phân Những con khác có thể bị lây nhiễm do tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết của con bệnh hoặc gián tiếp qua môi trường bị ô nhiễm Những đợt bùng phát dịch cúm gia cầm thường xuất phát từ những khu vực ở Đông Á và Đông Nam Á, nơi mà con người và lợn, gia cầm sống rất gần gũi với nhau Các loài động vật có vú nhiễm bệnh sẽ giải phóng virus ra

ngoài dưới dạng các hạt nhỏ lơ lửng trong không khí có chứa virus Virus dễ dàng lan truyền tới những vùng khác do con người thông qua các phương tiện vận chuyển, dụng

cụ chăn nuôi [1],[20]

Nguy cơ lây nhiễm virus cúm gia cầm sang người phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

số lượng virus, vật liệu phơi nhiễm và chủng virus Đường xâm nhập chính của virus cúm A là đường hô hấp trên và kết mạc Kết mạc có thể là đường xâm nhập quan trọng của virus A/H7N7 và A/H7N3 Virus xâm nhập trực tiếp vào đường hô hấp dưới có thể xảy ra trong trường hợp phơi nhiễm nhiều

1.6.8 Sức đề kháng của virus

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các yếu tố vật lí hay hoá học Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [48] Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, natri hypoclorid, acid loãng và hydroxylamine Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau

40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm) và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (-70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30oC [121]

1.7 CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG BỆNH CHO GIA CẦM

Đối với bệnh truyền nhiễm, sử dụng vaccine để phòng bệnh được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [8] Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, đó là các kháng thể kháng HA, NA, M và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu

hoá virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào [9] Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) và NA (N1) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới [31]

Vaccine truyền thống

- Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine) là các loại vaccine được

sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gia cầm giống như chủng gây bệnh trên thực địa [110]

- Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên

NA dị chủng

Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen

Đó là các loại vaccine được sản xuất nhờ sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ các vùng

“gen độc” Các loại vaccine này hoặc đang được nghiên cứu hoặc đã đưa vào sử dụng

phổ biến, bao gồm:

1) Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: Loại vaccine này sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp hai gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1 [102]

2) Vaccine dưới nhóm (subunit vaccine) chứa protein kháng nguyên NA, HA tái

kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen [113] Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC) Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1) [93]

Hiện nay, Trung Quốc là nước sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví

dụ, Viện Nghiên cứu Thú y Cáp-Nhĩ-Tân đã thành công trong việc tạo giống vaccine

vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng 28/73(H5N2), loại phân type H5N2 có độc lực yếu, hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1) là loại

A/Turkey/England/N-có độc lực yếu [51], [102], [113]

Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14

Chủng NIBRG-14 là giống virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xoá gen bằng công nghệ gen, được lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà [87] Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo

ra chủng virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn hai gen kháng nguyên HA và NA được lấy từ chủng cúm cường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1) [2], [113] Mặc

dù virus được xử lý làm mất tính độc lực gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên [46], [100])

Sử dụng hai plasmid mang gen HA và NA bắt nguồn từ chủng virus A/Vietnam/1194/04 (H5N1) hoặc A/Vietnam/1203/04 (H5N1) đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo dùng làm vaccine Các gen còn lại (M, NS, NP, PA, PB1

và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Gen HA được biến đổi di

truyền để làm giảm tính độc lực của virus cúm bằng cách cắt bỏ ba amino acid arginine (R), một amino acid lysine (K) và thay thế một amino acid lysine bằng một amino acid threonine (T), ở vị trí 327-328 vị trí phân cắt HA1 và HA2 của gen HA Biến nạp 2

plasmid mang gen HA và NA từ chủng được chọn và 6 plasmid mang các gen còn lại

(M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) vào tế bào nuôi cấy (phôi trứng gà SPF hoặc tế bào Vero, tế bào MDCK) Virus nhược độc tái

tổ hợp này nuôi cấy được trên phôi gà 9 ngày tuổi, nhân lên được và sau khi thu hoạch cần vô hoạt bằng formaline và cho chất bổ trợ để làm vaccine Do bị vô hoạt nên không còn khả năng gây bệnh nhưng kháng nguyên bề mặt (HA (H5) và NA (N1) kích thích

đáp ứng miễn dịch bảo hộ gia cầm khi bị nhiễm cúm A/H5N1

1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 TẠI VIỆT NAM

Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hoá của virus cúm

A/H5N1 được nhiều cơ sở tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003 Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y quốc gia giải mã và công bố trên Ngân hàng gen [12], [17], [19], [94]

Virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm A/H5N1 thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông [6], [7], [79], [107] (Phụ

chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc clade VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông [11], [35], [80]

Năm 2007, tại Việt Nam, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 phân dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) và đến nay xuất hiện clade 2.3.2, đã và đang làm phức tạp thêm vấn

đề dịch tễ học trong công tác phòng chống bệnh cúm gia cầm và quan hệ kháng nguyên

và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông [3], [6]

Nghiên cứu vấn đề gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch

cũng đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Pasteur

TP Hồ Chí Minh, Viện Thú y quốc gia, Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương tiến hành, đó là việc thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam các năm và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường độc đương nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới [2], [7], [9], [94] Nhận định hỗn hợp virus gây bệnh và phân hoá kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã được xác nhận qua phân tích hàng chục chủng thu nhận

từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước [94] Điều này ảnh hưởng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên [20], [107] cũng như vai trò miễn dịch của các chủng cổ điển đang sử dụng làm vaccine tại Việt Nam và thế giới (vaccine H5N1, chủng gốc: A-Gs-CN-Gd1(96)(H5N1), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Turkey-ENG-N28(73)(H5N2), vaccine TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-IRE-1378(83)(H5N8)), vaccine H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-232(94)(H5N2) Giống NIBRG-14 từ chủng gốc A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), đã được Việt Nam nghiên cứu công nghệ sản xuất vaccine cho gia cầm và người [2], [16]

Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm

A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới Phát hiện nhanh H5N1 và các phân type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp [125] Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam [54]

Ngoài ra, một số nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền gen kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc virus Lasota và chuyển gen vào thực vật cũng được tiến hành Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật/công nghệ cao (di

truyền ngược, tái tổ hợp vector) sử dụng nguồn gen H5N1 của Việt Nam, công nghệ tái

tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực vật và tế bào cũng được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Thú y quốc gia, Viện Di truyền Nông nghiệp

và một số cơ sở nghiên cứu khác [2], [6], [10] Song song với những nội dung nghiên cứu về cúm gia cầm ở gia cầm, các cơ sở y tế như Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, đều có những triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến cúm A/H5N1 trên người [17], [76], [13] Từ những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam đã và đang làm sáng tỏ thêm về mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hoá và genotype và kháng nguyên - miễn dịch - vaccine của cúm gia cầm tại Việt Nam

3 Phân tích so sánh tương đồng về nucleotide và amino acid suy diễn của gen H5

và N1, xác định mối quan hệ phả hệ với các chủng đăng ký trong Ngân hàng gen

2.3 VẬT LIỆU

Các mẫu bệnh phẩm là chất thẩm dịch (exudate) của niêm mạc của hầu khí-phế quản, gan, não và lách có chứa virus cường độc cúm A/H5N1 Mẫu virus cúm A/H5N1 đã được vô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -0oC hoặc -20oC Danh sách các mẫu được liệt kê ở Bảng 2.1

họng-Bảng 2.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn 2004 - 2011