Để liên tục có được các công bố về nhu cầu protein và acid amin cho cơ thể từ lâu trên thế giới đã áp dụng nhiều phương pháp phân tích hàm lượng protein và acid amin trong thực phẩm như:
Trang 1Bộ y tế Viện dinh d−ỡng
===== =====
Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) tối −u hoá các điều kiện
phân tích một số acid amin trong cá
Cơ sở quản lý: Cấp cơ sở
Chủ nhiệm đề tài: Thạc sỹ Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP
5750
05/4/2006
Hà Nội, tháng 12 - 2005
Trang 2I Đặt vấn đề
Acid amin là một thành phần quan trọng của cơ thể Acid amin tạo nên
tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut Acid amin là một phần của ezim và hệ thống hocmon Nó tạo nên ARN (acid ribo nucleic), AND (acid deoxi nucleic) vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ Acid amin được cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm dầu protein Protein khi vào cơ thể được chuyển hoá thành 22 acid amin, trong
đó có 8 acid amin thiết yếu không được tạo ra từ cơ thể, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyllalanine, threonine, tryptophan và valine Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [9]
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất
đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩa là chất lượng của protein thức ăn Ngoài ra đối với các nước
đang trên đà phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần thiết Nó giúp ta phương hướng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất lượng của protein trong khẩu phần Vì vậy xác định các acid amin trong thực phẩm là rất cần thiết
Sự cần thiết của protein với cơ thể người đã được nghiên cứu hàng thập
kỷ qua Nhu cầu protein và acid amin cần thiết cho cơ thể được công bố đầu tiên vào năm 1973 và liên tục được bổ sung vào năm 1975 và sau đó là 1977 bởi FAO (Tổ chức lương thực và thực phẩm thế giới), WHO (Tổ chức Y tế thế giới) và NRC (Hội đồng nghiên cứu quốc tế) [5] Để liên tục có được các công
bố về nhu cầu protein và acid amin cho cơ thể từ lâu trên thế giới đã áp dụng nhiều phương pháp phân tích hàm lượng protein và acid amin trong thực phẩm như: sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí, định lượng vi sinh, quy trình ngày càng hoàn thiện và được áp dụng nhiều kỹ thuật mới
Trang 3II Mục tiêu nghiên cứu
2.1 Tìm các điều kiện tối ưu để phân tích acid amin trong cá bằng
phương pháp sắc ký lỏng cao áp
2.2 áp dụng và ổn định phương pháp phân tích một số acid amin trên 5
loại cá nước biển và 5 loại cá nước ngọt thông dụng trên thị trường phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm dầu acid amin, đặc biệt trong cá của Việt Nam
III Phương pháp nghiên cứu
3.1 Hoá chất thuốc thử
Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại hoá chất tinh khiết phân tích Acetonitril, natri borat, acid clohydric của hãng Merk (Đức), chất dẫn suất 6-aminoquinoline, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ), chất chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp)
3.2 Hệ thống sắc ký lỏng
Hệ thống sắc ký lỏng được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là
hệ thống acid amin với các detector PAD 2996, huỳnh quang 2475 và bộ bơm mẫu tự động của hãng Water (Mỹ) Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water Thành phần pha động gồm đệm borat, acetonitril, nước cất tinh khiết chạy theo gradie Tốc độ dòng là 1ml/phút và nhiệt độ cột là 35oC Các acid amin được định lượng bằng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm
3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/àl cho tất cả các amino acid và 1,25 mmol/àl đối với cystine trong HCl
20 mmol để được dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100pmol/àl đối với 17 acid amin và 50 pmol/àl đối với cystein Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -200C dùng được trong vòng 1 tháng Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo quản trong môi trường acid với các điều kiện tương tự như chuẩn hỗn hợp
3.4 Chuẩn bị mẫu cá
Trang 4Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá nước ngọt (trắm, trôi, cá quả, rofi, chép); 5 loại cá nước mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá hồng, cá cam) Mẫu được lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đưa về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai giờ ở phòng thí nghiệm mẫu được phân loại, lọc lấy phần ăn được (loại bỏ phủ tạng, vẩy, vây, xương), sau đó mẫu được xay nhiễn, làm đồng nhất và tiến hành thuỷ phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu lưu cho vào hộp sạch bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -20oC
3.5 Thuỷ phân mẫu
Theo một số tác giả [3, 4, 7] phương pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trường acid clohydric có nồng độ cao
Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu như sau:
Loại không khí bằng nitơ, hàn kín ống
Tạo dẫn suất
Xác định bằng sắc ký lỏng pha ngược, Detector huỳnh quang và
PDA
Định mức bằng HCl 20 mmol
Để nguội, đuổi HCl dư trong môi
trường chân không
ủ ở nhiệt độ thích hợp
125 o C
Cho vào ống nghiệm thành dày
+ HCL 15%
Cân chính xác 1g mẫu đã xử lý
Trang 5IV Kết quả và bàn luận
4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích
4.1.1 Khảo sát các loại dẫn suất acid amin
Để xác định đ−ợc một số acid amin trong thực phẩm dựa trên những
điều kiện thí nghiệm sẵn có của phòng thí nghiệm Viện Dinh d−ỡng, chúng tôi
đã tiến hành dẫn suất các acid amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyt) [hình 1] và dẫn suất bằng AMQ (6-aminoquinolin) [hình 2], qua khảo sát chúng tôi thấy dẫn suất bằng OPA chỉ tách đ−ợc 15 acid amin, còn dẫn suất bằng AMQ tách đ−ợc 17 acid amin và NH3 với độ ổn định cao, nên trong nghiên cứu chúng tôi chỉ tiến hành dẫn suất bằng AMQ
Hình 1: Tách 15 acid amin bằng dẫn suất OPA
Hình 2: Tách 17 acid amin bằng dẫn suất AMQ
4.1.2 Khảo sát các điều kiện trên sắc ký lỏng
Để thực hiện một trong những nhiệm vụ quan trọng nhất của đề tài là tách và xác định đ−ợc acid amin, kỹ thuật đ−ợc lựa chọn là HPLC Kỹ thuật
Trang 6này đang là những kỹ thuật được phát triển nhất hiện nay trên thế giới có hiệu quả tách cao, độ chính xác cao cũng như có thể tự động hoá được trong trường hợp phân tích hàng loạt
Trong kỹ thuật HPLC ba vấn đề lớn cần tối ưu hoá là:
• Chọn cột tách: sử dụng cột pha ngược
Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water Qua kết quả chạy thử mẫu chuẩn cho thấy pic chạy ra với cột Symmetry Shield RP18 không tách được các acid amin nên chúng tôi chọn cột Symmetry acid amin RP18 để tiến hành phân tích mẫu
• Nghiên cứu tối ưu hoá pha động
Sau khi đã tham khảo các tài liệu và chạy thử, pha động chúng tôi lựa chọn là đệm borat, acetonitril, nước với tỉ lệ chạy theo bảng gradien như sau:
Bảng 1: Tỷ lệ thành phần pha động
Thời gian
(Phút)
Tốc độ dòng (ml/phút)
% Borat % Acetonitril % H2O
• Detector:
Sử dụng detector PDA và huỳnh quang là hai loại detector phổ biến, có
độ nhạy cao
Qua khảo sát độ phát hiện của các acid amin bằng detecto huỳnh quang nhạy hơn nhiều so với detector PAD, nên chúng tôi chọn sử dụng detector PAD để định tính (kiểm tra lại từng dạng phổ của từng pic acid amin đơn lẻ) còn để định lượng chúng tôi sử dụng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm
4.1.3 Các điều kiện thuỷ phân mẫu
Để thuỷ phân các sản phẩm chứa acid amin có nhiều phương pháp, tuỳ theo đặc tính của từng mẫu thử, tuỳ theo mục đích định tính hay định lượng
Trang 7+ Thuỷ phân bằng acid
+ Thuỷ phân bằng kiềm
+ Thuỷ phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion
+ Thuỷ phân bằng men
Trong đề tài nghiên cứu này, của chúng tôi sử dụng phương pháp thuỷ phân bằng acid Trong quá trình thuỷ phân, yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thuỷ phân và thời gian thuỷ phân
* Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân:
+ Chuẩn bị dung dịch để khảo sát: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn các acid amin (gồm 17 loại acid amin) bao gồm bảy dung dịch chuẩn có cùng nồng độ; với nền là một loại cá: 7 mẫu cá không thêm chuẩn và 7 mẫu cá thêm chuẩn
+ Tiến hành khảo sát:
Để khảo sát nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân acid amin chúng tôi khảo sát trên một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn acid amin và mẫu cá được thêm chuẩn như nhau, môi trường HCl 6N, nhưng nhiệt độ thuỷ phân khác nhau (110, 115, 120, 125, 130, 135, 140oC) sau mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau mẫu được đem đo
Theo khảo sát của chúng tôi, nhiệt độ có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình thuỷ phân mẫu Không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi (Kết quả khảo sát yếu tố này được trình bầy ở bảng 2) Với điều kiện nhiệt độ chưa đủ để phá vỡ các chuỗi peptit thì chúng ta còn không thể tách được riêng biệt từng acid amin (ví dụ hình 3)
Hình 3: ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin
Trang 8Bảng 2: ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin
(Lysine) trong cá
Hàm lượng biết
trước (àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468
Hàm lượng tính
được (àg/ml) 4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093
Hiệu suất 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32
Kết quả bảng 2 cho thấy nhiệt độ từ 120OC hiệu suất phản ứng đã đạt
được là cao nhất Nên chúng tôi chọn 125OC để làm nhiệt độ thuỷ phân mẫu
* Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân:
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thuỷ phân acid amin, chúng tôi khảo sát trên một dãy chuẩn acid amin và mẫu cá được thêm chuẩn như nhau, môi trường HCl 6N, nhiệt độ thuỷ phân như nhau 125oC, nhưng thời gian thuỷ phân khác nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giờ) Kết quả khảo sát chỉ
ra ở bảng 3
Bảng 3: ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu suất thuỷ phân của
acid amin (Lysine) trong cá
Trang 9Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7
Hàm lượng biết
trước (àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468
Hàm lượng tính
được (àg/ml) 5,859 4,365 4,685 5,312 5,3083 5,3152 5,2938
Hiệu suất 109,58 81,64 87,63 99,35 99,28 99,41 99,01
Kết quả bảng 3 cho thấy thời gian thuỷ phân 22 giờ trở lên hiệu suất phản ứng thu được là tốt nhất Chúng tôi đã chọn 24 giờ để tiến hành thuỷ phân mẫu
Khi thời gian thuỷ phân chưa đủ, các acid amin trong mẫu cũng không tách được ra khỏi nhau (ví dụ hình 4)
Hình 4: ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin
4.2 Đánh giá phương pháp
4.2.1 Xác định khoảng tuyến tính
Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích, chúng tôi pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100(àg/ml) cho 17 acid amin, từ 0,05 đến 50(àg/ml) đối cystine và tiến hành đo cho tất cả các acid amin Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,5 đến 100 (àg/ml) cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50(àg/ml) đối cystine với hệ số tương quan đạt
được từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin
4.2.2 Độ lặp lại của phương pháp
Trang 10Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 2 loại cá Mỗi loại cá tiến hành phân tích trên 6 mẫu
1
) (
1
2 2
ư
ư
= ∑
=
n
mtb mi
S
n i
Độ lệch chuẩn được tính theo công thức sau:
Độ lệch chuẩn tương đối được tính theo công thức sau:
RSD = s*100/XTB
Trang 11Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu cá quả
Các thông số
Các acid amin
% % % % % % % (%) Aspartic acid 0,721 0,693 0,724 0,695 0,737 0,742 6 0,719 0,021 2,878 Serine 0,795 0,774 0,786 0,772 0,783 0,799 6 0,785 0,011 1,387 Glutamic acid 1,234 1,425 1,243 1,229 1,354 1,343 6 1,305 0,081 6,219 Glycine 1,860 1,778 1,693 1,689 1,723 1,892 6 1,772 0,087 4,892 Histidine 0,656 0,697 0,621 0,637 0,656 0,672 6 0,657 0,027 4,042 NH3 0,865 0,835 0,856 0,821 0,862 0,821 6 0,843 0,020 2,398 Arginine 1,870 1,875 1,912 1,923 1,869 1,924 6 1,896 0,027 1,418 Threonine 0,873 0,829 0,859 0,875 0,864 0,862 6 0,860 0,017 1,928 Alanine 0,628 0,597 0,625 0,598 0,635 0,673 6 0,626 0,028 4,473 Proline 0,734 0,742 0,753 0,768 0,759 0,762 6 0,753 0,013 1,705 Cysteine 0,239 0,251 0,245 0,249 0,251 0,246 6 0,247 0,005 1,855 Tyrosine 0,939 0,927 0,896 0,917 0,879 0,953 6 0,919 0,027 2,982 Valine 0,453 0,397 0,512 0,437 0,456 0,473 6 0,455 0,038 8,384 Methionine 0,672 0,712 0,689 0,702 0,705 0,691 6 0,695 0,014 2,053 Lysine 0,298 0,321 0,297 0,352 0,319 0,327 6 0,319 0,020 6,375 Isoleucine 0,421 0,398 0,425 0,396 0,431 0,433 6 0,417 0,016 3,913 Leucine 0,842 0,839 0,843 0,851 0,799 0,798 6 0,829 0,024 2,860 Phenylalanine 1,256 1,227 1,123 1,214 1,125 1,121 6 1,178 0,061 5,216
Bảng 5: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu cá quả
Các thông số
Các acid amin
% % % % % % % (%) Aspartic acid 13,819 13,691 13,634 13,747 13,661 13,652 6 13,70 0,070 0,510 Serine 15,336 15,144 15,109 15,262 15,12 15,123 6 15,18 0,094 0,621 Glutamic acid 16,177 16,356 15,931 16,111 15,935 15,942 6 16,07 0,173 1,078 Glycine 17,470 17,219 17,199 17,395 17,194 17,221 6 17,28 0,121 0,700 Histidine 18,119 17,837 17,800 18,020 18,294 17,821 6 17,98 0,199 1,107 NH3 19,821 19,571 19,521 19,709 19,533 19,553 6 19,62 0,120 0,613 Arginine 21,184 21,09 21,08 21,153 21,085 21,092 6 21,11 0,044 0,209 Threonine 21,395 21,312 21,314 21,387 21,308 21,311 6 21,34 0,041 0,194 Alanine 22,022 21,932 21,923 21,982 21,928 21,931 6 21,95 0,040 0,182 Proline 23,346 23,253 23,229 23,275 23,250 23,263 6 23,27 0,041 0,175 Cysteine 26,467 26,634 26,600 26,467 26,647 26,652 6 26,58 0,088 0,330 Tyrosine 26,743 27,117 27,087 26,632 27,132 27,133 6 26,97 0,225 0,836 Valine 27,916 27,891 27,783 27,816 27,816 27,822 6 27,84 0,051 0,184 Methionine 28,466 28,351 28,333 28,366 28,368 28,372 6 28,38 0,046 0,164 Lysine 31,124 30,999 30,991 31,024 31,018 31,023 6 31,03 0,048 0,155 Isoleucine 31,951 31,82 31,818 31,854 31,842 31,845 6 31,86 0,049 0,154 Leucine 32,561 32,416 32,414 32,454 32,439 32,450 6 32,45 0,054 0,168 Phenylalanine 34,026 33,845 33,836 33,886 33,872 33,891 6 33,89 0,069 0,203
Trang 12Bảng 6: Kết quả độ lặp lại hàm lượng đối với mẫu cá thu
Các thông số
Các acid amin
% % % % % % % (%) Aspartic acid 0,926 0,918 0,897 0,889 0,918 0,931 6 0,913 0,017 1,816 Serine 0,865 0,859 0,837 0,871 0,902 0,856 6 0,865 0,021 2,483 Glutamic acid 1,652 1,598 1,701 1,689 1,634 1,657 6 1,655 0,037 2,257 Glycine 1,298 1,386 1,357 1,403 1,387 1,279 6 1,352 0,051 3,809 Histidine 1,125 0,987 1,131 0,989 0,984 1,024 6 1,040 0,070 6,704 NH3 0,122 0,109 0,123 0,115 0,128 0,132 6 0,122 0,008 6,920 Arginine 1,787 1,902 1,783 1,856 1,798 1,905 6 1,839 0,057 3,090 Threonine 1,105 1,231 1,304 1,098 1,159 1,236 6 1,189 0,082 6,878 Alanine 0,762 0,756 0,802 0,812 0,789 0,745 6 0,778 0,027 3,489 Proline 0,598 0,612 0,631 0,597 0,689 0,587 6 0,619 0,038 6,063 Cysteine 2,639 2,574 2,702 2,564 2,316 2,655 6 2,575 0,137 5,320 Tyrosine 0,112 0,131 0,135 0,132 0,121 0,121 6 0,125 0,009 7,004 Valine 0,658 0,678 0,598 0,654 0,702 0,579 6 0,645 0,047 7,324 Methionine 0,823 0,798 0,857 0,779 0,802 0,812 6 0,812 0,027 3,273 Lysine 0,546 0,498 0,578 0,581 0,605 0,535 6 0,557 0,038 6,908 Isoleucine 0,623 0,587 0,621 0,606 0,613 0,600 6 0,608 0,014 2,239 Leucine 1,116 1,206 1,215 1,033 1,234 1,158 6 1,160 0,076 6,528 Phenylalanine 1,322 1,302 1,401 1,189 1,298 1,325 6 1,306 0,068 5,239
Bảng 7: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu đối với mẫu cá thu
Các thông số
Các acid amin
Aspartic acid 13,717 13,626 13,793 13,76 13,768 13,692 6 13,73 0,061 0,445 Serine 15,184 15,089 15,275 15,212 15,241 15,345 6 15,22 0,087 0,569 Glutamic acid 16,012 15,902 16,116 16,074 16,076 15,937 6 16,02 0,085 0,531 Glycine 17,280 17,171 17,385 17,324 17,346 17,202 6 17,28 0,288 1,796 Histidine 17,904 17,79 18,026 17,954 17,979 17,820 6 17,91 0,732 4,448 NH3 19,622 19,52 19,73 19,682 19,688 19,554 6 19,63 0,622 3,446 Arginine 21,113 21,066 21,156 21,135 21,149 21,087 6 21,12 0,102 0,515 Threonine 21,336 21,288 21,379 21,348 21,368 21,311 6 21,34 0,263 1,344 Alanine 21,955 21,907 22,001 21,975 21,988 21,933 6 21,96 0,549 2,732 Proline 23,277 23,225 23,327 23,299 23,306 23,258 6 23,28 1,289 6,058 Cysteine 26,671 26,608 26,467 26,435 26,705 26,651 6 26,59 0,090 0,386 Tyrosine 27,156 27,094 26,735 26,706 27,191 27,134 6 27,00 0,374 1,598 Valine 27,849 27,78 27,914 27,883 27,882 27,821 6 27,85 0,243 0,943 Methionine 28,398 28,331 28,466 28,433 28,431 28,371 6 28,41 1,321 5,085 Lysine 31,05 30,98 31,129 31,633 31,089 31,021 6 31,15 0,362 1,175 Isoleucine 31,873 31,805 31,954 31,931 31,913 31,845 6 31,89 0,259 0,876 Leucine 32,475 32,401 32,563 32,500 32,519 32,445 6 32,48 0,481 1,615 Phenylalanine 33,920 33,828 34,025 33,650 33,970 33,842 6 33,87 0,847 0,257
