GIÁO TRÌNH BỆNH TRUYỀN NHIỄM THÚ Y (PHẦN ĐẠI CƯƠNG) part 6 docx

Phản ứng ngưng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác.. Tuy vậy, bằng cách gắ

dương tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tương ứng ngưng tụ

lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong Ngưng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau,

vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngưng kết Nhờ phản ứng này ta có thể xác định được hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh, ) còn cho phản ứng dương tính

Phản ứng ngưng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác Khi đó thường phải có bộ kháng huyết thanh

đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ)

Trong thực tế các virut được coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngưng kết Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu người ta có thể tạo được kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut

có tính ngưng kết hoàn hảo với kháng thể và được áp dụng trong một biến

thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp

phát hiện và bán định lượng kháng thể Đồng thời, kháng nguyên này cũng

còn được sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp

phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lượng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó

1.3 Phản ứng cố định bổ thể

Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ

thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tương động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này được hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết)

Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tương ở trạng thái vô hoạt và có thể được hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 được hoạt hóa (con đường cổ điển)

hoặc C3 được hoạt hóa (con đường nhánh) Yếu tố C1 được hoạt hóa nhờ

phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym) Khi tổ hợp bổ thể được hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể được hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thường trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào, ) Tuy nhiên, các bổ thể là những protein mẫn cảm với nhiệt Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng thể vẫn giữ nguyên hoạt tính

Ở hệ thống phản ứng chính người ta trộn kháng nguyên chuẩn (1 ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã được đun nóng vô hoạt bổ thể rồi

thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột

lang tươi mới Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lượng nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn Lại ủ như trên, sau 15 phút kiểm tra kết quả Phản ứng chính dương tính thể hiện dưới dạng hồng cầu chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính) Ngược lại, phản ứng chính âm tính thể hiện dưới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của hemoglobin (phản ứng phụ dương tính)

Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày

làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nước sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lượng (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn Trong hệ thống phụ này có kháng nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là hemolysin Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên

trong) Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn

cho phản ứng dung huyết Pha huyết thanh chuột lang tươi mới ở nồng độ

này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc Lượng làm việc của bổ

thể được giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng

1.4 Phản ứng HI (ngăn trở ngưng kết hồng cầu)

Nhiều virut có thuộc tính ngưng kết hồng cầu Chúng có thụ thể tương ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên

nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý Phản ứng

ngưng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện được sự hiện diện cũng như bán định lượng virut tương ứng Đồng thời, người ta còn lợi dụng đặc tính này của virut để xác định sự hiện diện cũng như hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dưới dạng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction)

Trước tiên người ta phải thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu để

xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc

với hiệu giá 4 đơn vị ngưng kết (4 HA) Phản ứng này được thực hiện trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4 ml) đáy U hoặc V

Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50

μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm tính chỉ chứa nước sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất Cho

50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lượng tươi trên thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều) Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn Hồng cầu ngưng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thường tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dương tính Nồng độ virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng cách đó hai lỗ khay (22=4) Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không ngưng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngưng kết rõ còn hai lỗ sau không thấy ngưng kết Ngược lại nếu virut quá đặc (có ít nhất ba lỗ ngưng kết) thì pha thêm nước sinh lý để vừa đủ tạo ngưng kết ở hai lỗ

Phản ứng HI cũng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số

2 Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ

11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl

huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA Hai lỗ 11 và 12,

như vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và dương tính (chứa chỉ nước sinh lý và hồng cầu) Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dương tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay) Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh

mà ở đó còn thấy ngăn trở được ngưng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ) 1.5 Các phương pháp kháng thể đánh dấu

Các phương pháp kháng thể đánh dấu gồm phương pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin Phương pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán

Bản chất các phương pháp này là sử dụng các kháng thể (thường là kháng thể đơn dòng) được gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu phát màu (kháng thể đánh dấu enzym) Chúng còn được gọi chung là conjugat (conjugate) Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu epitop của mầm bệnh hay đối tượng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần nghiên cứu

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố

định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thường bằng aceton lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm Rửa bằng nước rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dương tính

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố

định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa bằng nước rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma-globullin loài cho huyết thanh lần phủ trước Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa,

để khô và hiển vi huỳnh quang Kết quả dương tính tương tự phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có độ

nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên

Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis) Các biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện được kháng nguyên trong khi phản ứng gián tiếp phát hiện được cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu)

Phương pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ) protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng (khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trường trong một đêm Sau khi rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay được phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ Nếu phản ứng kháng nguyên - kháng thể dương tính, cơ chất enzym sẽ chuyển

từ không màu sang có màu và có thể đo được bằng quang phổ kế Phản ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H2SO4 Enzym

có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza Cơ chất enzym có thể là tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H2O2 3% trước khi dùng hiển thị phản ứng

Phương pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dưới dạng phản ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay được gắn sẵn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng nguyên với lỗ khay Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay Tiếp theo sau là phủ lỗ khay bằng conjugat đặc hiệu và các bước rửa và hiển thị như đã mô tả ở

trên Trong lỗ khay cho phản ứng dương tính như vậy có ba lớp, một lớp

kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phương pháp được gọi là "bánh

mỳ kẹp thịt"

Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong phát hiện kháng thể) được đánh dấu enzym

Tương tự phương pháp ELISA trực tiếp, trong phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu người ta cố định dịch bệnh phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thường qua đêm) vào

lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng thể, ở nhiệt độ thấp) Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp Sau khi rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp Phản ứng màu giúp ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu

Để phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA gián tiếp, cần cố định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein không kháng thể, sau khi rửa người ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho tiếp xúc với kháng nguyên Sau bước rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị Phản ứng phát màu của

cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm

1.6 Phương pháp điện di miễn dịch

Đây là phương pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut

có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm được điện di song song trong một bản keo (gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di Phương pháp này thường để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink

2 Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn

Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào như bệnh lao, bệnh tỵ thư, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta được "dị ứng nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai

truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thư là mallein và với bệnh Johne là

johnin Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang

(Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton), Các phản ứng

này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhưng nhiều khi là bệnh đang tiến triển

Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dương tính ta thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ Các dị ứng nguyên quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tương tự Ngoài

ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dưới da (tiêm kháng nguyên vào dưới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt) Phản ứng dưới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm trước khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất

cả các bệnh nêu trên Riêng bệnh tỵ thư ở ngựa phản ứng trong mắt khá tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm Phản ứng dương tính biểu hiện viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và dính chảy ra từ khóe mắt

IV Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen

1 Phương pháp lai phân tử (hybridization)

Các phương pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi được biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì trở thành một sợi Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic một sợi có trình tự nucleotid tương bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phương pháp được gọi là hybridization (phương pháp lai, để thuận tiện trong tiếng Việt thường gọi lai phân tử) Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh trong bệnh phẩm ADN hoặc ARN một sợi được đánh dấu gọi là "dò" hay

"mẫu dò" (probe)

Phương pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phương pháp kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym, là những

phương pháp phi phóng xạ được khai phát đã làm các phương pháp lai

phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán Các phương pháp này so với dùng đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm như khả năng bảo quản dò được lâu và

có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thường, không lo ô nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng Tuy nhiên do có độ nhạy thấp

so với phương pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ được sử dụng trong việc đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết

Phương pháp lai phân tử thông thường cần cố định axit nucleic có trong bệnh phẩm lên màng nylon hoặc nitrocelluloza rồi cho phản ứng với

dò đặc hiệu Sau đó rửa bỏ các thành phần (kể cả dò) không gắn kết do không có trình tự tương bổ đặc hiệu với axit nucleic đã cố định và cho hiển thị dò đặc hiệu Nếu không thấy được dò chứng tỏ không có sự tương đồng trong trình tự nucleotid của dò và của axit nucleic đã cố định Tùy thuộc vào phương pháp cố định mà ta có những biến thể dưới đây

1.1 Lai khuẩn lạc (colony hybridization)

Phương pháp này dùng để đồng định vi khuẩn mầm bệnh đã phân lập hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch Đặt màng nylon lên mặt môi trường thạch sẽ làm khuẩn lạc in lên màng, hoặc là lấy cặn vi khuẩn phết lên màng, sau đó bằng phương pháp kiềm làm biến tính axit nucleic rồi cho phản ứng với dò Do có thể không cần cấy chuyển và bồi dưỡng thuần khiết nên có thể thực thi nhanh việc chẩn đoán Tuy nhiên, do nhiều thành phần của tế bào nên phản ứng có thể bị trở ngại và làm việc phán định kết quả khó khăn

1.2 Lai đốm (dot hybridization)

Còn gọi là phương pháp thẩm đốm (dot blot), phương pháp này bắt

đầu bằng việc chiết xuất axit nucleic từ bệnh phẩm rồi nhỏ giọt (đốm) lên màng và cố định axit nucleic trên đó rồi cho phản ứng với dò Tuy cần nuôi cấy phân lập lứa cấy thuần vi khuẩn mầm bệnh nhưng là phương pháp nhanh chóng do sử dụng axit nucleic không cần tinh khiết được chiết xuất bằng phương pháp đơn giản

1.3 Lai Southern (Southern hybridization)

Phân tử ADN cần kiểm có thể để nguyên hoặc được cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân đoạn trên gel agarose, sau đó chuyển các phân đoạn ADN từ gel sang màng nylon rồi cho phản ứng với dò Bằng phương pháp này có thể phân tích một cách chi tiết đoạn ADN nào

phản ứng với dò nên không chỉ dùng để đồng định mà còn sử dụng để

giám biệt typ Hơn nữa với các loại mầm bệnh có ADN lớn như vi khuẩn, nguyên trùng, ký sinh trùng, thì sau khi phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di thì số phân đoạn quá nhiều làm khó phân tích nhưng với phương pháp này có thể phân tích được các mô hình, hay kiểu dạng (pattern), do số phân đoạn phản ứng với dò trở nên hạn chế tức là chỉ những đoạn ADN đặc hiệu được hiển thị vị trí trong làn gel điện di Sự khác biệt của các kiểu dạng của các đoạn cắt bởi enzym hạn chế phản ứng với dò được gọi là tính

đa hình độ dài phân đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism)

1.4 Lai khay vi thể (microplate hybridization)

Chiết xuất axit nucleic từ vi sinh vật mầm bệnh, cho hấp phụ cố định vào đáy lỗ khay vi thể rồi cho phản ứng với dò Nếu sử dụng phương pháp kháng thể đánh dấu để phát hiện dò thì phương pháp này tương tự phản ứng ELISA, có thể phán định và xử lý kết quả tương tự, đồng thời có thể xử lý chẩn đoán số lượng lớn mẫu bệnh phẩm Hơn nữa, các axit nucleic từ vi khuẩn mầm bệnh không chỉ có ADN mà còn có ARN thông tin vốn rất nhiều trong tế bào cũng phản ứng với dò nên độ nhạy của phương pháp cao

2 PCR (Phản ứng chuỗi polymeraza)

2.1 Nguyên lý và ứng dụng PCR

Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) là

kỹ thuật dựa trên phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza lặp đi lặp lại mà chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh phẩm được tăng lượng DNA-polymeraza (DNA-polymerase) là enzym lấy ADN một sợi làm khuôn để tổng hợp sợi ADN tương bổ Quá trình tổng hợp ADN được thực hiện nối dài một hướng từ đầu 5' đến đầu 3' và tại vị trí xuất phát của quá trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một sợi gọi là mồi (primer) tương bổ với ADN khuôn Nếu tổng hợp được hai mồi (một cặp) tương bổ với hai vị trí trên hai sợi khác nhau của một ADN hai sợi và hướng của phản ứng từ một mồi ngược với hướng phản ứng từ mồi kia, tức là kẹp một đoạn cần tăng lượng của ADN, thì nếu cho cặp primer với lượng gấp bội vào dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA-polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần Kết quả là từ vị trí một mồi ADN được kéo dài rồi trong chu kỳ tiếp theo lại làm khuôn cho mồi

có chiều ngược lại tổng hợp kéo dài ADN đến quá vị trí của mồi trước

Quá trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi làm cho chỉ đoạn ADN nằm

giữa (tức được kẹp giữa) hai mồi được tăng lượng theo cấp số nhân Nếu

số chu kỳ nhiệt là 30 thì đoạn ADN này tăng là 230

(tức khoảng 109) lần

Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt và thiết bị luân nhiệt (thermocycler) tự động hóa, và mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba bước 1) biến tính ADN hai sợi thành một sợi bằng nhiệt (94 - 95 °C), 2) nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN bệnh phẩm và 3) nhiệt độ thích hợp phản ứng kéo dài chuỗi ADN nhờ DNA-polymeraza Nhiệt độ chu kỳ 2) và 3) phụ thuộc vào thành phần nucleotid của mồi và khuôn nhưng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi khoảng 60 °C, nhiệt độ phản ứng kéo dài khoảng 70 °C Thành phần dịch

phản ứng gồm DNA-polymeraza chịu nhiệt (Taq polymerase), hỗn hợp

deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP, gồm 4 loại dATP, dTTP, dCTP và dGTP), cặp mồi (primer), dung dịch đệm và ADN khuôn (template DNA) Sản phẩm PCR được điện di để xác nhận độ dài đặc hiệu của ADN theo lý luận phải có, thường nhờ điện di song song với ADN dấu phân tử lượng (molecular weight marker DNA) Đôi khi sản phẩm được lai Southern để kiểm tra tính đặc hiệu Để điện di thường dùng gel agarose 0,8% trong dung dịch đệm acetat-tris, nhuộm ADN bằng ethidium bromid (~50 g/ml) pha vào agarose trước khi đổ bản gel hoặc pha vào dung dịch điện di sau khi điện di

Thời gian gần đây nhờ phát triển kỹ thuật chế primer đánh dấu huỳnh quang chỉ phát quang khi gắn kết vào ADN và thiết bị phân tích huỳnh quang tự động người ta đã phát triển PCR thông thường thành PCR thực thời (real-time PCR) với năng lực chẩn đoán và phân tích định lượng rất tiện lợi

Nhờ PCR có thể tăng lượng bất kỳ ADN nào có trong bệnh phẩm nên ta có thể chẩn đoán thông qua phát hiện sự hiện diện của gen đặc hiệu mầm bệnh mà không cần nuôi cấy phân lập mầm bệnh Điều này làm cho việc chẩn đoán các mầm bệnh không nuôi cấy được trở nên khả thi Phương pháp PCR còn được phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu như mô tả dưới đây

2.2 PCR-RFLP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng độ dài đoạn ngẫu nhiên)

PCR-RFLP là phương pháp so sánh các kiểu dạng (hay mô hình: pattern) các phân đoạn của sản phẩm PCR được phân cắt bởi enzym hạn chế được phân tách bằng điện di trong gel

2.3 RT-PCR (Phản ứng phiên ngược - chuỗi polymeraza)

RT-PCR là phương pháp kết hợp phản ứng tổng hợp ADN tương

bổ (cDNA) trên khuôn ARN nhờ enzym phiên ngược (RT: reverse transcriptase) hay enzym tổng hợp ADN phụ thuộc ARN (RNA-dependent DNA-polymerase) sau đó ADN được tổng hợp nhờ cặp mồi đặc hiệu trong hàng loạt chu kỳ luân nhiệt tiếp theo Nhờ phản ứng này genom của các virut ARN trở nên có thể tổng hợp bằng PCR

2.4 PCR-SSCP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn)

Nếu một ADN hai sợi được biến tính thành một sợi thì ADN một sợi phụ thuộc vào trình tự nucleotid mà có cấu trúc bậc cao khác nhau và đặc hiệu Nếu điện di ADN một sợi này trong gel polyacrylamid phi biến tính có gia nhiệt thì các cấu trúc bậc cao khác nhau phản ứng khác nhau, tức cùng độ dài nhưng dịch chuyển trong điện trường với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu hình lập thể Phương pháp này gọi là phân tích đa dạng cấu hình lập thể chuỗi đơn (SSCP: single strand conformation polymorphism) Có thể phân biệt được tối thiểu 1 bazơ khác biệt tồn tại trong các đoạn ADN dài hàng trăm bazơ Nếu áp dụng kỹ thuật phân tích này để phân tích sự sai khác có thể có trong trình tự nucleotid của các sản phẩm PCR thì phương pháp này được gọi là PCR-SSCP

2.5 RAPD (ADN sao chép ngẫu nhiên đa hình)

ADN đa hình được khuyếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA) còn gọi là tổ hợp mơ hồ tính đa hình độ dài khuyếch đại hay ALP-HA (amplified fragment length polymorphism hazy association), PCR được mồi ngẫu nhiên hay AP-PCR (arbitrarily primed PCR) hay lấy vân tay khuyếch đại ADN (DNA amplification fingerprinting), Đây là phương pháp đồng định mầm bệnh hoặc định typ nhờ sử dụng các cặp mồi có tính đặc hiệu tương đối thấp hoặc mồi chế từ các trình tự lặp trong genom mầm bệnh để thực thi PCR, kết quả là có hàng loạt sản phẩm PCR với độ dài khác nhau được hình thành và nhờ điện di phân tách thành các băng dưới dạng mã vạch tạo ra những mô hình (kiểu dạng) đặc trưng

3 Điện di axit nucleic

Điện di axit nucleic chiết xuất từ mầm bệnh có thể sử dụng trong chẩn đoán Phương pháp này thường áp dụng sau khi phân lập và đồng định vi sinh vật mầm bệnh và dùng để khu biệt dạng/typ huyết thanh học,