Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

Bài tóm tắt Mục tiêu của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm” là : Xây dựng được quy trình c

B.KH&CN

B.KH&CN VCNTP

B.KH&CN

M∙ số: KC-04-28

Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: TS Nguyễn Thị Minh Hạnh

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm

B.KH&CN

B.KH&CN VCNTP

B.KH&CN VCNTP

Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất

các loại đường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

M∙ số: KC-04-28

Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: TS Nguyễn Thị Minh Hạnh

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm

Hà Nội, 2006

Bản quyền:

Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trưởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trong trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu.

Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghiệp thực phẩm

301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Báo cáo tổng kết

Đề tài cấp nhà nước:

Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất

các loại đường chức năng dùng trong

công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

M∙ số: KC-04-28

Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: TS Nguyễn Thị Minh Hạnh

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp Thực phẩm

Hà Nội, 2006

Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài cấp Nhà nước,

M∙ số: KC 04 – 28

Bài tóm tắt

Mục tiêu của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại đường chức

năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm” là : Xây dựng được

quy trình công nghệ sản xuất và tinh chế maltooligosacarit, xylitol, β-glucan từ sản phẩm và

phụ phẩm nông nghiệp trên cơ sở áp dụng công nghệ enzim và công nghệ vi sinh

Phương pháp nghiên cứu: Đề tài sử dụng các phương pháp phân lập giống, tuyển chọn

giống truyền thống và hiện đại (sử dụng các phương pháp đột biến gen, biến đổi gen ) để nâng cao hiệu suất lên men, công nghệ vi sinh, công nghệ enzim để sản xuất ra sản phẩm nhằm nâng cao chất lượng và tránh ô nhiễm môi trường, hạ giá thành sản phẩm Các phương pháp tinh sạch sản phẩm hiện đại như: Trao đổi ion, sắc ký, lọc màng ứng dụng các thiết

bị hiện đại để thu hồi sản phẩm đảm bảo độ sạch và chất lượng của sản phẩm: Sấy phun, cô

đặc chân không, cô đặc bằng màng, sắc ký Phân tích chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bằng các thiết bị hiện đại: Sắc kí khí, sắc ký lỏng cao áp, quang phổ hấp phụ nguyên tử ứng dụng các phương pháp phân tích sử dụng chế phẩm sinh học: kít chuẩn, các chế phẩm enzim phân tích, các cột cố định cho quá trình công nghệ

Kết quả nổi bật của đề tài:

1- Maltooligosacarit

- Đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất maltooligosacarit với các điều kiện

công nghệ sau:

+ Xử lý nguyên liệu : rửa lại bột 3 lần với tỉ lệ nước dùng là 1: 5

+ Quá trình chuyển hoá tinh bột thành maltooligosacarit giàu maltotrioza: Quá trình dịch hoá: Nồng độ tinh bột: 25%, nồng độ enzim alpha -amylaza: 0,1% so với tinh bột, pH = 6,5- 7,0, nhiệt độ: 950c, thời gian: 30 phút Quá trình đường hoá: Nồng độ dịch thuỷ phân:

22 0 Bx, DE dịch hoá: 20, nồng độ enzim pullulanaza: 1%, thời gian: 15 giờ, nhiệt độ: 550C,

pH = 6,5

Đã nghiên cứu nâng cao hàm lượng maltotrioza trong thành phần sản phẩm maltooligosacarit bằng enzim AMT tăng thêm gần 50% so với sử dụng enzim pulullanaza Làm sạch dịch thuỷ phân bằng than hoạt tính: Thời gian tẩy màu 30 phút, nhiệt độ: 800C, tỷ

lệ than hoạt tính: 1,5% so với tinh bột, nồng độ chất khô: 20- 250Bx

Đã sản xuất thử nghiệm trên quy mô pilot 100kg/mẻ, sản phẩm sản xuất ra đạt chất lượng DE=38,5 với các thành phần: Glucoza 7,15mg/ml, maltoza 39,52mg/ml, maltotrioza 54,5mg/ml, maltopentan 72,31mg/ml, maltohexan 47,23mg/ml, các oligo khác: 9,3mg/ml

Đã sản xuất thử trên quy mô công nghiệp công suất 2.500kg bột/mẻ tại Công ty cổ phẩm thực phẩm Minh dương Sản phẩm thu được đem ứng dụng cho sản xuất bánh kem tại Công

ty bánh kẹo Hải hà, sản xuất đồ uống sữa ngô, kem, bột cacao hoà tan tại Viện cơ điện, Công ty kem Băng Kỳ Lân, Công ty Chế biến ca phê cacao Hoàng Anh đạt kết quả tốt, thay thế được đường kính, giữ được màu tươi của sản phẩm, độ ổn định (khả năng định hình, độ huyền phù…) tốt hơn dùng đường kính

2- β- glucan

- Đã phân lập và chọn được môi trường thích hợp cho sự phát triển của các chủng nấm

men, tạo được chủng S.cerevisiae đột biến từ chủng hoang dại phân lập được từ bã men bia Đã xây dựng công nghệ tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men S.cerevisiae: Sản phẩm β- glucan từ chủng nấm men S.cerevisiae 1 có một loại mạch 1,6 β-glucan, từ

chủng nấm men S.cerevisiae 3 có hai loại mạch 1,6 β-glucan và 1,3 β-glucan, từ chủng

S.cerevisiae 1 có trên 80% hexoza và 0,99% protein, từ chủng S.cerevisiae 2 và S.cerevisiae 3 có hàm lượng protein khoảng 1,2% và hơn 50% hexoza

- Chế phẩm có tác dụng phục hồi số lượng tế bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ổ bụng của động vật gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng

chiếu xạ Chế phẩm β-glucan từ chủng S.cerevisiae 1 có tác dụng tốt đối với hệ thống

miễn dịch không đặc hiệu ở nồng độ nghiên cứu

Đã ký được một hợp đồng hợp tác sản xuất chế phẩm β– glucan phục vụ cho y dược với quân y viện 103 và một hợp đồng hợp tác nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với trung tâm hóa dược

3-Xylitol

- Đã tuyển chọn được 9 chủng có hiệu suất chuyển hóa lớn hơn 45%, hiệu suất cao nhất

đạt được là 70,1% Định tên các chủng bằng phương pháp đọc trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosom 26S

- Đã tìm được nguyên liệu thích hợp sản xuất xylitol là lõi ngô có thành phần xyloza cao,

ít ảnh hưởng đối với tế bào nấm men trong quá trình lên men Đã xây dựng quy trình thủy phân lõi ngô, xử lý dịch xyloza làm nguyên liệu lên men, quy trình lên men dịch xyloza thành xylitol

- Đã tiến hành lên men xylitol quy mô thử nghiệm và quy mô lớn để tạo dịch chứa xylitol Hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol đạt được là 70- 80%

- Đã đưa ra quy trình tinh chế xylitol từ dịch lên men với độ tinh khiết đạt 98%

- Đã ứng dụng chế phẩm xylitol vào sản xuất kẹo và thuốc đánh răng có chứa xylitol

4 - Đề tài đã tạo ra 5 mẫu sản phẩm, xây dựng được 6 quy trình công nghệ, có hồ sơ đăng

ký Bảo hộ sáng chế và giải pháp hữu ích tại Cục Sở hữu trí tuệ, ký được 2 hợp đồng chuyển giao công nghệ, đào tạo được 3 thạc sỹ, 4 kỹ sư, đăng được 4 bài báo tại hội nghị CNSH lần

thứ 9 ở Indonesia Đề tài đã được nhận cúp vàng tại hội chợ techmart 2005

Danh sách những người thực hiện

Chủ nhiệm đề tài : TS Nguyễn Thị Minh Hạnh

Cán bộ tham gia nghiên cứu chính:

2 CN Nguyễn Thị Bích Liên Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm

3 KTV Nguyễn Thuỳ Linh Maltooligosacarit Viện Công nghiệp Thực phẩm

2.4 C«ng nghÖ s¶n xuÊt maltooligosacharit giµu maltotrioza, xylitol,

3.2 Các phương pháp nghiên cứu 54 3.2.1 Phương pháp vi sinh

4.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất maltooligosacarit bằng phương

4.1.2 Nghiên cứu lựa chọn enzim cho quá trình phân mạch tinh bột tạo

maltooligosacarit giàu maltotrioza

65

4.1.3 Nghiên cứu các điều kiện công nghệ cho quá trình thủy phân tinh

bột bằng enzim alpha- amylaza

67

4.1.3.2 Nghiên cứu xác định pH thích hợp cho quá trình dịch hóa 70 4.1.3.3 Nghiên cứu xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình dịch hóa 71 4.1.3.4 Nghiên cứu xác định nồng độ enzim alpha - amylaza trong quá

4.1.4.4 Nghiên cứu xác định nồng độ enzim pullulanaza đến quá trình

đường hóa

79

4.1.4.6 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất thủy phân tinh bột thành maltotrioza 84

4.1.5 Nghiên cứu quá trình làm sạch và thu hồi sản phẩm 85 4.1.5.1 Nghiên cứu xác định tỷ lệ than hoạt tính dùng để tẩy màu 85 4.1.5.2 Nghiên cứu xác định nồng độ dịch phù hợp cho quá trình lọc 86

4.1.7 Sản xuất thử nghiệm trên quy mô xưởng thực nghiệm 100kg/mẻ 91

4.1.9.1 Đánh giá khả năng ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong

sản xuất bánh kẹo tại Công ty bánh kẹo Hải hà

97

4.1.9.2 ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong sản xuất đồ uống

sữa ngô

99

4.1.9.3 ứng dụng của sản phẩm maltooligosacarit trong sản xuất sản

phẩm kem tại Coiong ty kem Băng Kỹ Lân

100

4.1.9.4 Sử dụng sản phẩm trong sản xuất các sản phẩm của Công ty

Chế biến cà phê cacao Hoàng Anh

101

4.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng Saccharomyces cerevisiae từ bã

4.2.3 Quy trình lên men thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae 107

4.2.6.1 Xác định hàm l−ợng protein và hàm l−ợng hexoza trong sản

phẩm β – glucan từ chủng S cerevisiae nghiên cứu và từ bã

men bia

111

4.2.6.2 Xác định hàm l−ợng axit amin tự do trong sản phẩm β– glucan

tách chiết từ thành tế bào của các chủng S cerevisiae nghiên

4.3.2.1 Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm chủng giống 128

4.3.3 Nghiªn cøu c«ng nghÖ chiÕt t¸ch, lµm s¹ch vµ thu håi xylitol 152

Danh mục các bảng

Bảng 2.1 Hàm lượng xylitol trong một số loại rau quả và các sản

phẩm có nguồn gốc rau quả

Bảng 2.7 Tác dụng của S griseus amylaza lên các cơ chất khác nhau 18

Bảng 2.9 Tốc độ thủy phân liên kết α - 1,6 glucozit trong các

oligosacarit phân nhánh bởi enzim pullulanaza từ 2 chủng A

Bảng 2.11 Thành phần của một số loại lignocelluloza thực vật 23

Bảng 2.12 Thành phần đường của hemicelluloza ở một số loại gỗ 24

Bảng 2.13 Sử dụng maltooligosacarit giàu trong chế biến bánh Gyuhi 29

Bảng 2.14 Thành phần phản ứng và sản phẩm của phương pháp sản

xuất xylitol từ axit xylonic

38

Bảng 2.15 Thành phần phản ứng và sản phẩm của phản ứng đồng phân 38

hóa D- xyluloza Bảng 2.16 Lượng sản xuất và giá cả của các loại đường trên thế giới 46 Bảng 2.17 Các β- glucan có hoạt tính sinh học thường được sử dụng 49

Bảng 4.2 Hàm lượng maltotrioza trong dịch đường hóa sử dụng

pullulanaza của hãng Novo và Amano

Bảng 4.8 ảnh hưởng của nồng độ cơ chất trong quá trình đường hóa 76

Bảng 4.11 ảnh hưởng của nồng độ enzim pullulanaza dùng cho đường

năng lọc

86

Bảng 4.17 Điều kiện kỹ thuật cho sấy phun dịch maltooligosacarit 87

maltotrioza(sản xuất bằng enzim pullulanaza)

92

Bảng 4.19 Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng nấm men phân lập 101

Bảng 4.20 OD600 của tế bào các chủng nấm men ở các thời điểm khác

nhau

102

Bảng 4.21 Mật độ tế bào của 3 chủng nấm men trên các môi trường

nghiên cứu (CFU/ml)

103

Bảng 4.22 OD600 của tế bào các chủng nấm men theo nhiệt độ 105

Bảng 4.23 Một số đặc điểm của chủng nấm men đột biến bằng tia UV 107

Bảng 4.24 Trọng lượng thành tế bào thu được với các nồng độ kiềm và

Bảng 4.27 Hàm lượng protein và hexoza trong sản phẩm glucan của

các chủng nấm men nghiên cứu

111

Bảng 4.28 Hàm lượng các axit amin tự do trong sản phẩm β – glucan

tách chiết từ thành tế bào của các chủng S cerevisiea

112

Bảng 4.30 Phần trăm đường khử có trong dịch thủy phân trấu ở các

điều kiện I, II, III, IV, V

121

Bảng 4.32 Hàm lượng glucoza và xyloza có trong dịch thủy phân trước

và sau khi cô đặc

123

Bảng 4.33 Kết quả xử lý dịch thủy phân lõi ngô bằng Ca(OH)2, H3PO4 125

Bảng 4.34 Sinh trưởng của nấm men trên các môi trường chứa dịch

thủy phân nồng độ khác nhau

126

Bảng 4.36 Khả năng chuyển hóa xyloza thành xylitol của các chủng

Bảng 4.39 Kết quả phân loại 47 chủng nấm men có khả năng chuyển

hóa xyloza thành xylitol bằng kỹ thuật Fingerprinting và giải trình tự D1/D2 của ARN ribosome 26 S

143

Bảng 4.40 Hiệu suất chuyển hóa xyloza thành xylitol của 24 chủng

nấm men được phân loại bằng phương pháp dọc trình tự vùng D1/D2 của ARN ribosome 26 S

145

Bảng 4.41 ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng chuyển

hóa xyloza thành xylitol

Danh mục các hình

Hình 7 Tác dụng của enzim α - amylaza lên tinh bột hoà tan tạo

maltotrioza

17

Hình 8 Sơ đồ tổng quát các con đường sản xuất các sản phẩm

hữu cơ từ nguồn nguyên liệu lignocelluloza

Hình 11 Quá trình thủy phân và hydro hóa xylan thành xylitol 37

Hình 13 Con đường sử dụng xyloza và mối quan hệ với các con

đường khác trong quá trình trao đổi chất của tế bào vi

sinh vật

41

Hình 14 Dectin-1 trung gian cho hiệu quả sinh học của β-glucan 48

Hình15 Một số hình ảnh về quá trình thủy phân lõi ngô thu hồi

dịch chứa xyloza

124

Hình 16 Sinh trưởng bằng nấm men trên môi trường dịch thủy 128

ph©n r¬m vµ lâi

H×nh 19 Phæ Fingerprinting sö dông måi MTS2 cña 47 chñng nÊm

men cã kh¶ n¨ng chuyÓn hãa xyloza thµnh xylitol

Danh mục các đồ thị

Đồ thị 2 Xác định nồng độ tinh bột thích hợp trong quá trình dịch

hóa

69

Đồ thị 6 ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới quá trình đường hóa 77

Đồ thị 7 ảnh hưởng của nồng độ enzim pullulanaza sử dụng đường

hóa

81

Đồ thị 12 Tốc độ sinh trưởng của chủng S cerevisiea 1 theo nhiệt

1 Mở đầu

Nâng cao giá trị của các sản phẩm nông nghiệp và các phụ phẩm của sản xuất công nghiệp bằng sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm Nước ta là một nước có kinh tế chủ yếu là nông nghiệp, để phát triển một nền kinh tế bền vững không gì hơn là áp dụng khoa học kỹ thuật chế biến các nông sản và phụ phẩm thành các sản phẩm có giá trị kinh tế cao

Một sản phẩm được sản xuất từ tinh bột là maltooligosacarit, nhờ có nhiều tính chất ưu việt như : có độ ngọt thấp (khoảng30% với sacaroza), khả năng duy trì độ ẩm cao, hạn chế sự hình thành màu trong quá trình chế biến, khả năng chống táo bón tốt khi hấp thụ vào cơ thể và đặc biệt có thể hấp thụ vào máu một cách từ từ do đó giữ

ổn định độ đường trong máu với thời gian dài nên maltooligosacarit giàu maltotrioza

được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như một loại đường chức năng

để chế biến các món ăn tráng miệng, kẹo cao su, bánh ngọt, kem bơ, mứt, các loại nước ép trái cây, soda, nước uống tăng lực, cà phê hòa tan, chế biến cá đông lạnh… Sản phẩm sản xuất từ phế phụ liệu nông nghiệp là xylitol Xylitol là loại đường đơn, hiện nay được sử dụng rộng rãi trong một số dạng thực phẩm cũng như trong y dược Xylitol có trong một số hoa quả và có vị ngọt nhẹ Lượng calo của xylitol chỉ bằng 40% so với sacaroza do vậy có thể dùng để chống béo Xylitol được hấp thụ và sử dụng trong cơ thể theo cơ chế khác so với glucoza nên được dùng cho người bị tiểu

đường Một trong những tính năng nổi trội là xylitol có khả năng chống sâu răng và một số bệnh răng miệng khác Chính vì lẽ đó xylitol được cho vào kẹo cao su, thuốc

đánh răng và được coi như một loại chất ngọt thế hệ mới Hiện trên thế giới có khoảng 28 nước sản xuất maltooligosacarit, xylitol, trong đó chủ yếu là Phần lan, Nhật bản, Trung Quốc, Thuỵ điển, Đức, Mỹ, Hàn Quốc Nấm men bia được loại ra trong quá trình sản xuất bia có thể sử dụng để sản xuất β-glucan β-glucan là một trong những polysacarit có nhiều nhất trong màng tế bào nấm men và tồn tại như một homopolyme của glucoza, liên kết với nhau qua cầu nối α -(1,3) hoặc α -(1,6)-D-glycosidic Những năm gần đây, β-glucan phân lập từ màng tế bào nấm men ngày càng được chú ý Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch, kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống

miễn dịch ở Việt nam việc nghiên cứu sản xuất maltooligosaccarit, β-glucan và xylitol còn rất mới mẻ Cho tới nay maltooligosaccarit, β - glucan và xylitol sử dụng tại Việt Nam hoàn toàn thông qua nhập khẩu từ nước ngoài Hiện nay chế biến tinh bột đang được Chính phủ quan tâm đặt lên hàng đầu Do vậy việc tiếp thu và tăng giá trị của sản phẩm dạng đường bột cũng như các phế phụ liệu của chúng sẽ là chìa khoá cho việc thúc đẩy sản xuất nông nghiệp cũng như phát triển bền vững của ngành công nghệ sinh học Để góp phần nâng cao giá trị kinh tế của nông sản, tạo ra

được sản phẩm mới theo kịp xu hướng phát triển công nghệ của thế giới, đề tài KC 04-28 được tiến hành với các nội dung sau:

- Nghiên cứu công nghệ sản xuất maltooligosacarit bằng phương pháp enzim

- Nghiên cứu công nghệ sản xuất xylitol bằng phương pháp lên men

- Nghiên cứu công nghệ sản xuất β - glucan từ nấm men

- ứng dụng maltooligosacarit, xylitol, β- glucan trong công nghiệp thực phẩm,

dược phẩm và mỹ phẩm

Với những tính chất chung như tiêu hóa từng phần và hấp phụ chậm ở ruột non của người, không làm tăng nhanh lượng đường glucoza trong máu, giúp cơ thể cân bằng được nhu cầu về hydratcarbon, lượng calo cung cấp trung bình khoảng 2,4kcal/g, quá trình lên men đường chức năng chủ yếu ở đại tràng Các axit béo mạch ngắn được tổng hợp từ đường chức năng, nhất là axit butyric làm ảnh hưởng

đến bacteria flora của ruột non nên có thể sẽ giúp ngăn ngừa các bệnh về tiêu hóa ở

đại tràng Do có những chức năng như vậy nên đường chức năng được nghiên cứu sản xuất rất nhiều

Xylitol là một đường chức năng, được cấu tạo bởi 5 cacbon (1,2,3,4,5 pentahydroxy pentane) Xylitol có độ ngọt tương đương với đường mía và có giá trị năng lượng bằng 1/3 giá trị năng lượng của đường mía [40] Xylitol tồn tại với hàm lượng nhỏ trong tự nhiên ở nhiều loại rau quả khác nhau Xylitol cũng được tạo ra với một hàm lượng nhỏ trong quá trình trao đổi chất thông thường của cơ thể [40]

Một số đặc tính lý hóa của xylitol:

Hình 1: Công thức cấu tạo của xylitol Trọng lượng phân tử: 152,15

Dạng tồn tại: Tinh thể trắng, không mùi

Nhiệt độ sôi: 126° C (ở 760 mm Hg)

Nhiệt độ nóng chảy: 92° tới 96° C

Độ tan ở 20° C: 169 g xylitol tan hết trong trong 100 g nước, ít tan trong ethanol và methanol

Maltooligosacarit giàu maltotrioza là hỗn hợp gồm các oligo mạch thẳng có từ 2

đến 10 gốc glucoza liên kết với nhau qua liên kết α -1,4 glucozit như: maltoza (G2), maltotrioza (G3), maltotetraoza (G4), maltopentanoza (G5), maltohexanoza (G6)… Maltooligosacarit giàu maltotrioza là sản phẩm có chứa hàm lượng maltotrioza cao được sản xuất từ tinh bột với sự tham gia xúc tác của enzim vi sinh vật Sản phẩm

được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì những tính chất sau[11,17, 22, 50,116]:

- Độ ngọt thấp chỉ bằng 30 % so với đường sacaroza ở dung dịch 10% nhiệt

độ 25 0 C, do đó có thể thay thế đường sacaroza trong các thực phẩm để giảm độ ngọt sản phẩm mà không ảnh hưởng đến hương vị vốn có của sản phẩm

- Tác dụng chống táo bón

- Đặc biệt maltooligosacarit giàu maltotrioza có thể hấp thụ từ từ trong máu cung cấp năng lượng cho cơ thể một cách đều đều, giữ ổn định độ đường trong máu trong thời gian dài

- Tác dụng làm giảm tích tụ máu, sự sản sinh axit lactic với một lượng lớn, phản ứng trong tuyến tuỵ và nhanh chóng tăng khả năng chịu đựng của cơ thể cũng như khả năng làm việc

- Được dùng để căn chỉnh kích thước màng, ổn định các tính chất của các sản phẩm thực phẩm và nguyên liệu

- Độ hòa tan giảm theo nồng độ dịch, maltooligosacarit giàu maltotrioza có khả năng hút ẩm rất cao và có độ nhớt trung bình Chính vì vậy maltooligosacarit giàu maltotrioza có khả năng duy trì độ ẩm cao, giữ

được độ ẩm phù hợp trong thực phẩm đặc biệt trong các loại bánh tươi

- Khi bổ sung vào thực phẩm, đồ uống maltooligosacarit giàu maltotrioza là tác nhân kìm hãm sự hình thành màu, vì nó thay thế một phần glucoza nên hàm lượng glucoza thấp Hơn nữa sẽ ngăn cản sự kết tinh đường sacaroza

và bảo vệ cấu trúc của sản phẩm trong thời gian bảo quản

Bảng 2.2 Các đặc tính của một số đường thành phần trong hỗn hợp maltooligosacarit[54]

maltoza (G2)

maltotrioza (G3)

maltotetraoza (G4)

maltopentanoza (G5)

maltohexanoza (G6)

Côngthức C12H22O11 C18H32O16 C24H42O21 C30H52O26 C36H62O31Trọnglượng

+176,0+

178.0 0

+182,0 + 184.0 0

+182,0 + 184.0 0

Khả năng hút ẩm là một trong những tính chất quan trọng của maltooligosacarit giàu maltotrioza, vì nó có tác dụng duy trì độ ẩm cao và giữ được độ ẩm phù hợp trong các sản phẩm thực phẩm đặc biệt trong các loại bánh tươi

Hình 2: Cấu trúc phân tử của maltotrioza

Phân tử maltotrioza ( 0- α– D – Glucopyranosyl- (1-4)- 0- α – D – Glucopyranosyl- (1-4) D – Glucopyranosyl ) gồm ba đơn vị glucoza kết hợp với nhau bằng liên kết α -1,4 glucozit [34] Tương tự như maltotrioza (G3), maltotetraoza (G4)

có 4 đơn vị glucoza kết hợp với nhau bằng liên kết α -1,4 glucozit, maltopentanoza (G5) có 5 đơn vị glucoza kết hợp với nhau, maltohexanoza(G6) có 6 đơn vị glucoza kết hợp với nhau …

β- glucan là một trong những polysacharit phong phú nhất trong thành tế bào nấm men và tồn tại như chất trùng hợp của đường glucoza liên kết qua β-1,3-D-glucosidic

hoặc β-1,6-D-glucosidic Trong nấm men Saccharomyces cerevisiae, thành tế bào

chủ yếu chứa β-1,3-D-glucan, β-1,6-D-glucan, chitin và mannoprotein, chúng liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Mannoprotein, với khối lượng protein khoảng 100 KDa liên kết với β-1,6-D-glucan qua gốc glycosyl-phosphatidyl-inositol chứa 5 gốc manosyl liên kết α Đầu khử của β-1,6-D-glucan liên kết với đầu không khử của β-1,3-D-glucan Chitin gắn thẳng vào nhánh β-1,6-D-glucan Mối liên kết này có vài trò trung tâm trong cấu trúc thành tế bào nấm men Phần lớn β-1,3 có cấu trúc xoắn, những sợi xoắn này gồm chuỗi polysacarit đơn hoặc ba chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết hydro Dưới kính hiển vi điện tử, các sợi có đường kính từ 10-30nm, luôn gắn với các chuỗi bên, mỗi chuỗi có đường kính 0,5-1nm Cho đến nay vẫn chưa có số liệu trực tiếp về chiều dài của các chuỗi bên Các chuỗi bên dài tạo ra các “polysacarit” với các đầu khử cuối [1, 21]

Hình 3 : Cấu trúc thành ngoài tế bào nấm men

% träng l−îng thµnh tÕ bµo

75-tinh bét ®Ëu xanh hµm l−îng amyloza chiÕm kho¶ng 50%[2,4, 7, 19,25 ] Ngoµi ra

tinh bét cßn cã nhiÒu trong c¸c lo¹i rau qu¶ vµ lµ nguån dinh d−ìng chÝnh cung cÊp

calo cho người và gia súc[7]

Tinh bột được cấu tạo từ nhiều gốc monosacarit kết hợp với nhau nên có khối lượng phân tử lớn và không có tính khử, dưới tác dụng của các chất khử tinh bột không có khả năng nhận oxy để tạo thành axit hoặc nhận hydro để tạo thành rượu[4] Tinh bột được cấu tạo bởi hai cấu tử : amyloza và amylopectin Amyloza thường chiếm 12-25% còn amylopectin chiếm 75-85% phân tử tinh bột Phân tử lượng của amyloza là 3.105-1.106 còn phân tử lượng của amylopectin là 5.104- 1.106 [17, 22, 30] Phân tử amyloza và phân tử amylopectin đều được cấu thành từ các monosacarit Phân tử amyloza có các gốc glucoza gắn với nhau bằng liên kết α - 1,4 glucoizit thông qua cầu oxi giữa các nguyên tử cácbon thứ nhất và thứ tư của glucoza tạo nên một chuỗi dài 200-1000 đơn vị glucoza, mạch tạo thành của phân tử amyloza là mạch thẳng Còn phân tử amylopectin, ngoài liên kết α- 1,4 glucozit còn có liên kết nhánh α- 1,6 glucozit, vì vậy ngoài cấu trúc mạch thẳng, amylopectin còn có cấu trúc mạch nhánh, thông thường có 20-30 gốc glucoza giữa 2 điểm phân nhánh [30,

33, 50]

Hai cấu tử của tinh bột là amyloza và amylopectin có tính chất hoá lý khác nhau Amyloza khi tác dụng với phân tử iot có màu xanh, còn amylopectin cho màu nâu Amyloza dễ tan trong nước ấm và tạo nên một dung dịch có độ nhớt không cao Dung dịch của amyloza không bền khi nhiệt độ hạ thấp, các dung dịch đậm đặc của amyloza nhanh chóng tạo gel tinh thể và kết tủa không thuận nghịch Khả năng thoái hoá này phụ thuộc vào pH, sự có mặt của các ion kim loại, nồng độ amyloza và khối lượng phân tử của amyloza Amylopectin có độ kết tinh thấp, là phân tử hấp thụ nhiều nước khi nấu chín tinh bột và là thành phần chủ yếu tạo nên sự trương phồng của hạt tinh bột Khi tinh bột được xử lý đồng thời bằng nước và nhiệt sẽ tạo ra hiện tượng hồ hoá Nhiệt độ hồ hoá của các loại tinh bột trong khoảng 55-700C, hạt tinh bột sẽ trương phồng lên hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyt phân cực, khi đó độ nhớt của dịch tinh bột tăng lên rất cao, các hạt tinh bột trương nở và kết dính vào với nhau tạo thành paste Nếu dịch tinh bột đặc khi làm nguội paste tinh bột sẽ tạo thành gel cứng [50, 68,114]

Về mặt cảm quan tinh bột là các hạt rất mịn, màu trắng Để bảo quản tốt, người ta giữ độ ẩm của tinh bột trong khoảng 12-14% nhằm ngăn ngừa sự phát triển của vi sinh vật [114] Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột được sử dụng để tạo sợi, tạo

các hạt tinh bột hòa tan và thủy phân một phần các cấu tử của tinh bột, hạ độ nhớt của dung dịch[109,113]

Tinh bột là nguồn nguyên liệu quan trọng đặc biệt để sản xuất maltooligosacarit, maltodextrin và glucoza và các sản phẩm thuỷ phân tinh bột khác Trước đây, thủy phân tinh bột nhờ xúc tác của axit, công nghệ này đòi hỏi các thiết bị chịu axit, không điều chỉnh để tạo thành các sản phẩm mong muốn và ảnh hưởng không tốt

đến môi trường Ngày nay với sự pháp triển của khoa học công nghệ đã nghiên cứu

và sản xuất ra nhiều loại enzim trong đó phải kể đến nhóm enzim thuỷ phân tinh bột amylaza Enzim amylaza xúc tác phản ứng thuỷ phân tinh bột triệt để, có tính đặc hiệu cao tạo ra các sản phẩm mong muốn Tùy thuộc vào mức độ thủy phân và bản chất, nguồn gốc của enzim sử dụng có thể thu được các sản phẩm khác nhau: siro

glucoza, glucoza bột, siro maltoza, siro fructoza, maltooligosacarit …

Hạt tinh bột sắn có nhiều hình dạng: hình tròn, bầu dục bề mặt nhẵn Dưới ánh sáng phân cực có thể thấy rõ các liên kết ngang với mật độ từ trung bình tới dày đặc Hàm lượng amylopectin, amyloza trong tinh bột sắn liên quan tới độ kết dính khi nấu chín và nhiều tính chất ứng dụng công nghiệp Tinh bột sắn có độ nở và độ hòa tan cao, ở dạng keo có độ trong lớn, có khả năng trương nở tốt và xu thế thoái hóa thấp Độ trong lớn và tính không vị của tinh bột sắn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm Khi làm nguội tinh bột sắn ở dạng keo, các phân tử polysacarit có thể tạo một dạng cấu trúc gel có độ bền cao được sử dụng trong các thực phẩm cần được bảo quản trong thời gian dài[9]

Tinh bột sắn về cảm quan có màu sáng trắng, khi hồ hoá độ nhớt tăng rất nhanh,

độ kết dính cao hơn các tinh bột khác như tinh bột khoai lang, khoai tây Tinh bột sắn không có mùi đặc trưng nhưng khi hồ hóa có mùi đặc trưng dễ phân biệt với các

loại tinh bột khác ở nước ta sắn được trồng nhiều nhất là ở những vùng đồi núi, chịu

được các điều kiện khí hậu khắc nghiệt và không đòi hỏi sự chăm sóc nhiều, tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền nhất, giá 1 kg bột sắn khô chỉ khoảng 3000- 3.500 đ Tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm (dùng trong sản xuất siro glucoza, đường glucoza, mì chính ) công nghiệp giấy và công nghiệp dệt [114]

Tình hình sản xuất và sử dụng sắn ở Việt Nam và trên thế giới

Hiện nay Việt nam sản xuất được trên 2 triệu tấn sắn tươi mỗi năm, đứng thứ 11 thế giới về sản lượng sắn và là nước xuất khẩu tinh bột sắn đứng thứ 3 trên thế giới sau Thái Lan và Indonexia[8]

Thái Lan là nước trồng sản và xuất khẩu sắn đứng đầu thế giới, có trên 55% sản lượng sắn của Thái Lan được sử dụng dưới dạng sắn lát phơi khô dùng làm thức ăn gia súc, trong đó 90% được xuất khẩu sang Châu Âu và chỉ có 10% tiêu thụ nội địa Gần 45% sản lượng còn lại được chế biến thành các sản phẩm, 60% sản phẩm loại này được xuất khẩu[8]

Trong chiến lược toàn cầu, sắn đang được tôn vinh là một trong những cây lương thực dễ trồng, thích hợp với những vùng đất nghèo, là cây công nghiệp triển vọng, có khả năng cạnh tranh cao với nhiều cây trồng khác ở Việt Nam cây sắn đang được chuyển đổi nhanh chóng vai trò từ cây lương thực truyền thống sang cây công nghiệp Sự hội nhập đang mở rộng thị trường sắn, tạo nên những cơ hội chế biến tinh bột, tinh bột biến tính, sắn lát, sắn viên để xuất khẩu và sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia súc, nguyên liệu cho các ngành công nghiệp

Theo niên giám thống kê năm 2003 cho thấy diện tích diện tích: 329,4 nghìn ha

và sản lượng đạt 4157,7 nghìn tấn[8]

Hiện nay Việt Nam đã có 41 nhà máy chế biến tinh bột sắn và đang được xây dựng với tổng công suất thiết kế khoảng 3.130 tấn bột/ ngày Nhiều nhà máy chế biến tinh bột sắn đã và đang được đầu tư xây dựng, trong đó nhà máy Vedan ở Đồng Nai với vốn đầu tư nước ngoài và công suất lớn nhất Đông Nam á Xây dựng công nghệ sản xuất các sản phẩm từ tinh bột sắn là một hướng đầu tư có tiềm năng lớn cho cây sắn nói riêng và cho ngành nông nghiệp nói chung [4]

Cây sắn đầu tiên mọc ở vùng hoang vu Trung và Nam Châu Mỹ, về sau được trồng lan rộng sang Châu Phi, Châu á Cho tới nay sắn được trồng ở hầu hết các

quốc gia trên thế giới như : Các nước nằm trong vĩ độ 300 Bắc và 300 Nam, các nước Châu Mỹ La tinh, Khu vực Đông Nam á ở Việt nam sắn được trồng vào cuối thế kỷ

19 và được coi là loại cây hoa mầu quan trọng

2.2.2 Enzim thuỷ phân tinh bột

2.2.2.1 α –amylaza

Theo danh pháp quốc tế, α-amylaza gọi là α-1,4 glucan–4 glucanohydrolaza

(EC 3.2.1.1), có khả năng phân cắt các liên kết α -1,4 glucozit trong phân tử polysacarit một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào Do đó α - amylaza có thể thuỷ phân được amyloza, amylopectin, glycogen và các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân Nhưng không có khả năng thủy phân liên kết α - 1,6 và α - 1,3 glucozit [2,5,11, 26] α - amylaza có trong nước bọt, tuyến tụy, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm như mầm hạt, mầm cây, hạt hoà thảo, đặc biệt

có rất nhiều trong chế phẩm nuôi cấy nấm mốc, vi khuẩn Nhưng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật như: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Amylaza là enzim thủy phân tinh bột, đồng thời là một chế phẩm sinh học được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất siro oligosacarit, maltoza và glucoza Enzim amylaza được dùng từ lâu đời theo phương pháp cổ truyền, để thủy phân tinh bột trong sản xuất mạch nha, rượu, bia… Việc sử dụng amylaza ngày càng trở nên rộng rãi hơn kể từ khi có α -amylaza sinh tổng hợp từ

một số chủng vi sinh vật như Bacillus lichemiformis được phát hiện là có tính bền

nhiệt [ 38, 91]

α - amylaza được phân bố rộng rãi trong các tế bào vi sinh vật Các vi sinh vật có

khả năng sinh tổng hợp α -amylaza là các chủng Bacillus (như Bacillus acidoaldarius, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus) và một số chủng Streptomyces aureofacien, Thermophilus vulgaris, Pseudomonas, aspergillus, Endomycosis….[ 9, 12, 26, 116, 118]

α -amylaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau có nhiều tính chất giống nhau nhưng cũng có các tính chất khác nhau Chúng giống nhau chủ yếu về tính năng tác dụng với cơ chất nhưng lại rất khác nhau về khả năng bền vững với nhiệt độ và pH

đồng thời các sản phẩm thuỷ phân cơ chất của chúng cũng rất khác nhau Vì vậy người ta chia α - amylaza của nấm mốc làm 2 loại : chịu axít và kém chịu axít còn α-amylaza từ vi khuẩn cũng có 2 loại kém bền nhiệt và bền nhiệt

Các α -amylaza thu nhận từ xạ khuẩn và nấm men có hoạt lực không cao, vì vậy phần lớn nghiên cứu được tập trung vào α -amylaza của nấm mốc và vi khuẩn Các

chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp α- amylaza như : Aspergillus, Rhizopus[12,20] Xạ khuẩn và nấm men Endomycopsis cũng có khả năng tổng hợp α

- amylaza, tuy nhiên hoạt lực α - amylaza của chúng không cao [104,118]

α -amylaza của nấm mốc được chia làm 2 loại: chịu axít và kém chịu axít, thường hoạt động ở pH axít α -amylaza của nấm mốc lần đầu tiên được phát hiện từ

chủng Aspergillus oryzae, sau này người ta tìm thấy A niger, A awamori, Rhizopus ulencer, R nevear cũng có khả năng tổng hợp α–amylaza[26, 68, 117]

α -amylaza của vi khuẩn có 2 loại: chịu nhiệt và kém chịu nhiệt, thường hoạt

động ở pH trung tính hoặc kiềm nhẹ α -amylaza của vi khuẩn là loại bền với nhiệt nhất so với các loại α -amylaza sinh ra từ các chủng vi sinh vật khác α -amylaza của

chủng Bacillus stearothermophilus ở nhiệt độ 60-70oC bị mất hoạt lực sau 24 giờ; ở

90oC giảm hoạt lực 17% sau 6 phút, trong khi α -amylaza của chủng Bacillus subtilis

bị mất hoạt lực hoàn toàn [117,118]

Trong công nghiệp, α -amylaza của vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất vì nó thường không có độc tố, có hoạt lực cao và chịu được nhiệt độ cao, trong khi α-

amylaza của nấm mốc bị mất hoạt tính ngay sau khi hồ hoá Vi khuẩn Bacillus có

khả năng sinh tổng hợp α - amylaza mạnh và có ý nghĩa trong công nghiệp như

chủng : Bacillus subtilis, B coagulans, B stearothermophilus, B licheniformis [73, 75]

α - amylaza có bản chất là protein nên tan trong nước và không bị phân hủy bởi proteaza α -amylaza còn được gọi là enzim kim loại vì trong phân tử của enzim có ít nhất 1 ion Ca++ nằm ở trung tâm hoạt động Số lượng ion Ca++ trong phân tử enzim, mức độ liên kết của các ion Ca++ với proein rất khác nhau và phụ thuộc vào nguồn gốc của từng loại α -amylaza Tất cả các enzim α -amylaza đều chứa từ 1-30 nguyên

tử Ca++/mol enzim Hoạt lực của enzim không thay đổi khi thay thế tất cả các ion

Ca++ bằng ion Mg++, loại trừ ion Ca++ ở trung tâm hoạt động Khi tách ion Ca++ ra khỏi enzim bằng EDTA thì enzim bị mất khả năng hoạt động, không còn khả năng thủy phân cơ chất và bị biến tính khi đun nóng, đặc biệt bị thủy phân bởi proteaza Vì vậy, ion Ca++ đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc phân tử cũng như khả năng hoạt động của enzim [2,3,20]

Phần lớn α - amylaza đều có trọng lượng phân tử tương đối gần nhau khoảng

50.000 đơn vị, nhưng với α - amylaza của B stearothermophilus trọng lượng phân tử

chỉ có 15.000 α - amylaza có nguồn gốc khác nhau hoạt động thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau Maining và Campell đã xác định được nhiệt độ tối ưu

cho α - amylaza từ chủng B stearothermophilus là 55-700C, của B subtilis là 600C,

của B licheniformis là 90-1050C [ 28, 39, 90] α - amylaza của nấm mốc có nhiệt độ tối ưu thấp hơn so với α- amylaza của vi khuẩn và chịu được pH axit hơn pH hoạt

động của α - amylaza từ nấm mốc là 4,5 -5,0; của vi khuẩn là 5,8 – 7,0 Nếu pH < 4,0 thì α- amylaza của vi khuẩn bị mất hoàn toàn hoạt lực [104]

Cơ chế tác dụng của α –amylaza lên phân tử tinh bột

Cơ chế chung của enzim α - amylaza là thủy phân không định vị các liên kết 1,4 glucozit của polysacarit enzim này thuộc loại endoenzim, có nghĩa enzim tấn công các liên kết nội phân tử Tác dụng của α - amylaza lên amyloza và amylopectin dẫn đến giảm độ nhớt , làm mất khả năng nhuộm màu với iốt và đường khử tăng Tuy nhiên α- amylaza thuỷ phân liên kết α-1,6 glucozit và không tấn công liên kết

α-α -1,4 glucozit gần kề với α-α -1,6 glucozit trong phân tử tinh bột và glycogen vì vậy sau khi thuỷ phân sẽ tạo ra một lượng các oligosacarit nhánh, panoza, α-dextrin phân

tử lượng thấp chứa liên kết α -1,6 glucozit [2,5]

Tất cả các α-amylaza đều có khả năng phân hủy nhanh chóng phân tử tinh bột, làm thay đổi màu của iốt và giảm độ nhớt của tinh bột một cách nhanh chóng Các sản phẩm thủy phân của α -amylaza là các oligosacarit, maltotrioza, maltodextrin và một lượng ít glucoza, maltoza α -amylaza tác động rất yếu đối với các oligosacarit phân tử thấp như maltotrioza, maltoza α-amylaza thuỷ phân amylopectin thành các dextrin có chứa nhiều hơn 4 đơn vị glucoza liên kết với nhau qua liên kết α -1,6 glucozit

Các α -amylaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau, khi thuỷ phân tinh bột tạo

thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau α -amylaza của chủng Bacillus subtilis tạo thành các dextrin có 9-10 cấu trúc glucoza, α -amylaza của Bacillus amyloliquefaciens tạo thành α-dextrin có chứa liên kết nhánh và không nhiều hơn 9

cấu trúc glucoza [103,114]

Phản ứng thuỷ phân của enzim dịch hoá

α - amylaza

Tinh bột + Nước G1 + G2 + G3 +G4 + G5+ G6+ các oligosacarit nhánh

Enzim α - amylaza tạo maltotrioza

α - amylaza tạo maltotrioza được Wako tìm thấy năm 1978, là α - amylaza

ngoại bào được sinh tổng hợp tù chủng Streptomyces griseus, đây là enzim ngoại bào

thứ 3 được tìm thấy sau các enzim α - amylaza tạo maltohexaoza và maltotetraoza

O-O-O-O* O-O-O + O*

O-O-O-O-O* O-O-O + O-O*

O-O-O-O-O-O* O-O-O + O-O-O*

Hình 7:Tác dụng của enzim α - amylaza lên tinh bột hoà tan tạo maltotrioza

Đặc biệt enzim này thuỷ phân cơ chất theo hướng từ ngoài vào và hình thành phân tử maltotrioza từ cuối đầu không khử của maltooligosaccarit và α-1,4-glucan Enzim này có thể thuỷ phân triệt để mạch amyloza ngắn (DP 20), đồng thời thuỷ phân tinh bột hoà tan, tinh bột ngô (Waxy) và glycogen với các mức độ tương ứng 55%, 51%, 40% Sự tác dụng tương tự như của β - amylaza, cắt từng đoạn của phân

tử cơ chất

Tính chất của enzim : enzim hoạt động ở pH=5,6-6 và nhiệt độ 45oC ở 6,5 enzim hoạt động với 80% hoạt lực Enzim bền nhiệt ở 40oC nhưng ở nhiệt độ >

pH=3,5-45oC enzim nhanh chóng mất hoạt lực Trọng lượng phân tử của enzim là 55.000

do bằng SDS disc electrophoresis Tác dụng của ion kim loại lên hoạt lực của enzim

Bảng 2.7: Tác dụng amylaza từ chủng S griseus lên các cơ chất khác nhau

là enzim thủy phân liên kết α -1,6 glucozit trong phân tử amylopectin, α- dextrin, glycogen, pullulan, tuy nhiên nó không có tác dụng đối với amyloza và các oligosacarit mạch thẳng

Pullulanaza có trong thực vật như : Đậu Hà lan, cây yến mạch, malt, gạo,… nhưng nguồn sản xuất dồi dào và phong phú nhất là các chủng vi sinh vật Pullulanaza lần

đầu tiên được tìm thấy từ Klebsiella pneumoniae (tên gọi khác Aerobacter aerogenes) [78], sau này người ta phát hiện thấy pullulanaza được sinh tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật rất đa dạng như : Encherichia intermedia, Streptococcus mitis, Bacillus acidopullulyticus, Streptomyces flavochromogenas, Oryza sativa, Hordeum valgare, Bacillus macerans, Bacillus polymyxa[38,56,118,116], Aerobacter aerogenes, Pseudomonas stutzeri, Bacillus amyloliquefaciens[ 71, 89,103, 118 ]… Pullulanaza từ chủng K pneumoniae được dùng trong nghiên cứu cấu trúc của

tinh bột và glycogen, thuỷ phân cấu trúc phân nhánh α -1,6 glucozit Trong sản xuất các loại đường glucoza, maltoza, maltotrioza từ tinh bột trên quy mô công nghiệp

người ta ứng dụng pullulanaza từ K.pneumoniae và B acidopullulyticus để tăng hiệu

suất chuyển hoá[22,36] Ví dụ trong công nghệ sản xuất maltoza nếu kết hợp

pullulanaza với α – amylaza và β - amylaza thì hiệu suất chuyển hoá tăng 97%

Ngoài ra pullulanaza còn được sử dụng để sản xuất cyclodextrin nhánh mà gốc

maltooligosyl liên kết với gốc hydroxyl ở vị trí C6 của phân tử cyclodextrin bằng

cách ủ hỗn hợp maltooligosacarit và cyclodextrin với pullulanaza Tất cả các

pullulanaza được biết đến ngày này đều không có khả năng thuỷ phân

cyclodextrin[36]

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật AND tái tổ hợp người ta đã

tách gen pullulanaza từ chủng Desulfurococcus mucosus DSM2162 ghép vào

B subtilis JA803 để sinh tổng hợp enzim pullulanaza[36]

Enzim pullulanaza từ các chủng vi sinh vật khác nhau, có những đặc tính kỹ thuật

giống và khác nhau Bảng dưới cho thấy một số đặc tính kỹ thuật của enzim

pullulanaza từ 2 chủng K.pneumoniae và B acidopullulyticus Hiện nay 2 chủng này

được sử dụng để sinh tổng hợp enzim trên quy mô công nghiệp của 2 hãng nổi tiếng

thế giới đó là Nhật bản và Đan mạch

Bảng 2.8 : Một số tính chất của enzim pullulanaza[116]

(1) Sử dụng cơ chất pullulan, (2) Sử dụng cơ chất là amylopectin

Phần lớn pullulanaza đều có trọng lượng phân tử tương đối gần nhau khoảng

90.000- 100.000, nhưng với pullulanaza của Bacillus polymyxa trọng lượng phân tử

chỉ có 48.000[116] Trọng lượng phân tử được xác định bằng điện di gel của 2

chủng K pneumoniae và B acidopullulyticus là 66.000 – 90.000[117]

Pullulanaza có nguồn gốc khác nhau hoạt động thích hợp ở các điều kiện nhiệt

sp 202-1 là 550C[9], chủng Streptococcus mitis là 300C[20] Pullulanaza từ chủng B

acidopullulyticus hoạt động thích hợp nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55 0C, tuy nhiên

nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzim từ chủng này là 350C[51, 73] pH tối ưu

cho hoạt động của pullulanaza từ K pneumoniae là 6,0 –7,0 và enzim duy trì đựơc

80 % hoạt lực khi pH 5-10 [76], nhiệt độ hoạt động thích hợp là 55 0C và nhiệt độ

enzim ổn định 40- 55 0C

Enzim pullulanaza có tác dụng thủy phân liên kết -1,6 glucozit của pullulan để

sản xuất ra maltotrioza Độ nhớt của dịch pullulan giảm dần và hàm lượng đường

khử tăng theo thời gian thuỷ phân Giai đoạn đầu của phản ứng enzim là sự tạo

thành hex- và nona- oligosacarit, sau đó maltotrioza được hình thành ở giai đoạn

sau[116]

Pullulanaza có tác dụng thủy phân liên kết α -1,6 glucozit của phân tử

amylopectin, các oligosacarit mạch nhánh nên giá trị DE tăng theo thời gian phản

ứng Khả năng thuỷ phân của pullulanaza từ chủng Streptococcus mitis trên cơ chất

amylopectin và glycogen là 50% và 30%[113] Pullulanaza không thuỷ phân các

liên kết α -1,6 glucozit trong isopanoza, isomaltoza và một số mạch nhánh ngắn

Bảng sau cho thấy tốc độ thuỷ phân mối liên kết α-1,6 glucozit trong các oligosacarit

phân nhánh

Bảng 2.9 Tốc độ thuỷ phân liên kết -1,6 glucozit trong các oligosacarit phân

nhánh bởi enzim pullulanaza từ 2 chủng A aerogenes và S mitis[116 ]

Pullulanaza từ 2 chủng A aerogenes và S mitis thuỷ phân pullulan với tốc độ

100 Tuy nhiên với cơ chất là các oligosacarit mạch nhánh, pullulanaza từ các nguồn

khác nhau có tốc độ thuỷ phân khác nhau, ví dụ với cơ chất là 63- α -

maltotriosylmaltotetraoza thì tốc độ thuỷ phân của pullulanaza từ chủng A

aerogenes là 112 và pullulanaza từ S mitis là 283, nếu cơ chất là 62- α -

maltosylmaltotrioza thì tốc độ thuỷ phân của pullulanaza từ chủng A aerogenes chỉ

đạt 23 và pullulanaza từ S mitis là 3.8[ 113, 116 ]

Pullulanaza kết hợp enzim α -amylaza trong thuỷ phân tinh bột để sản xuất ra

một loạt các maltooligosacatit khác nhau như : maltoza, maltotrioza, maltotetraoza,

maltopentaoza, maltohexaoza, maltoheptaoza… và làm tăng đường khử theo thời

gian thuỷ phân

Pullulanaza từ chủng K pneumonia tác dụng lên mối liên kết α-1,6 glucozit

(điểm phân nhánh) trong các cơ chất khác nhau được thể hiện trong bảng

trên[116,118 ] enzim pullulanaza thuỷ phân liên kết α-1,6 glucozit trong tinh bột và

glycogen sản xuất ra một loạt các maltooligosacarit và làm tăng cường độ màu xanh

với dung dịch iốt Đặc biệt pullulanaza thuỷ phân liên kết α -1,6 glucozit trong các

oligosacarit mạch nhánh tốt như với pullulan, tinh bột và glycogen

Bảng 2.10 : ảnh hưởng của enzim pullulanaza từ chủng K pneumonia trên

Sau khi thuỷ phân nhánh với xúc tác của enzim pullulanaza thì hầu hết cơ chất có

mạch nhánh (α- amylolysis) đều chuyển thành dạng mạch thẳng (α- amylolysis) Ví

dụ trước khi thuỷ phân amylopectin là 50%, sau khi thuỷ phân chỉ còn 5% , hiệu suất

chuyển hoá đạt 90% Trước khi thuỷ phân glycogen thì phần trăm α - amylolyis là

38%, sau khi thuỷ phân phần trăm α - amylolysis tăng lên 46% Với α - limit dextrin

trước khi thuỷ phân thì phần trăm α - amylolyis là 0%, sau khi thuỷ phân phần trăm

α - amylolysis tăng lên 97%[116]

2.2.3 Nguyên liệu dùng trong sản xuất xylitol

Xylitol được sản xuất trực tiếp từ xyloza theo con đường tổng hợp hóa học hoặc lên men nhờ vi sinh vật Nguồn xyloza dùng trong tổng hợp hóa học hoặc lên men nhờ vi sinh vật thường được lấy từ dịch thủy phân gỗ, rơm rạ, bẹ ngô và các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật giàu xylan khác Các nguyên liệu thực vật này được thủy phân bằng enzim hoặc axit dưới các điều kiện khác nhau, kết quả là thu được một hỗn dịch có chứa các đường, chủ yếu là xyloza, và các sản phẩm phụ khác sinh ra trong quá trình thủy phân như axit acetic, lignin, phenol Sơ đồ trong hình dưới nêu

ra con đường tổng quát để sản xuất các sản phẩm sinh học từ nguồn nguyên liệu sinh khối thực vật

Hình 8 Sơ đồ tổng quát các con đường sản xuất các sản phẩm hữu cơ từ nguồn nguyên liệu lignocelluloza

Lignocelluloza được cấu tạo từ celluloza, hemicelluloza, lignin và các thành phần phụ khác Thuật ngữ holocelluloza thường được dùng để chỉ các loại carbohydrat có

Sinh khối thực vật(Thủy phân bằng axit, enzim)

Axit acetic Axit butyric

GlycerolArabitol

Xylitol

Erythritol