Tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

Tài liệu về các phương pháp cố định tế bào nấm men rượu vang

SVTH : Phạm Thị Hồng Nga

GVHD: ThS Tôn Nữ Minh Nguyệt

Keo tụ tế bào ( tạo hạt)

Nhốt trong khung mạng xốp

(tạo gel)

Nhốt bên trong màng chắn

Cố định trên bề mặt chất mang rắn

NHỐT TRONG KHUNG MẠNG

XỐP (TẠO GEL)

• Chất mang

Alginate Polyvinyl alcohol

Cố định nấm men trong

gel alginat

Cơ chế tạo gel:

Kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao

2 cơ chế tạo gel:

Cơ chế tạo gel từ bên ngoài

Cơ chế tạo gel từ bên trong

Ưu, nhược điểm:

• Ưu điểm Dễ thực hiện

Điều kiện ôn hòa

Trơ

B n ền

• Nhược điểm Độ bền giảm Nhạy với các chất tạo chelate.

Không bền trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao

Nấm men

Tạo huyền phù Dung dịch PVA 10% Tạo hạt

Giữ lạnh Rã đông Rửa

Tế bào cố định

Cố định nấm men trong

cryogel PVA

Phương pháp

thực hiện

Ưu nhược điểm

• Ưu điểm Đàn hồi và bền cơ cao, có cấu trúc bền chắc

Thao tác đơn giản Hiệu suất được cải thiện đáng kể

• Nhược điểm Giá thành cao

Không phân hủy Ảnh hưởng hoạt tính tế bào

Đk nhiệt độ thấp

NHỐT BÊN TRONG MỘT

MÀNG CHẮN

Màng membrane alginate

Màng vi bao sinh học

(biocapsule)

Thiết bị phản ứng membrane

Màng membrane alginate

Cố định tế bào:

PHƯƠNG PHÁP TẠO MEMBRANE ALG(PEG)

Hiệu quả của phương pháp cố định

Tế bào có thể tăng trưởng với mật độ cao hơn, không có sự thoát ra cục bộ khi tế bào tăng trưởng quá mức trở thành một khối lớn

Lượng alginat nhỏ

Màng vi bao sinh học (biocapsule)

• Phương pháp thực hiện

Hiệu quả của phương pháp cố định

So với tế bào tự do: nồng độ sinh khối cao hơn và khả năng chống lại áp suất thẩm thấu của môi trường tốt hơn

Cấu trúc của biocapsule không thay đổi trong suốt quá trình lên men

Cố định trong thiết bị phản

ứng membrane

Thiết bị phản ứng sinh học membrane loại một bình

(1) Bình chứa môi trường; (2) Bơm cung cấp môi trường; (3) Thiết bị lên men; (4) Bơm lưu thông; (5) Bộ phận membrane; (6) retentate; (7) permeate; (8) Cảm biến mức độ; (9) Van solenoid.

• Thiết bị phản ứng sinh học membrane loại hai bình

(1) Bình chứa môi trường; (2) Bơm cung cấp môi

trường; (3) Bình 1; (4) Bình 2

CỐ ĐỊNH TRÊN BỀ MẶT

CHẤT MANG RẮN

Cố định trên miếng táo

Cố định tế bào

Hiệu quả sản xuất rượu vang

Thể tích miếng táo giảm, còn lại là 94,4% thể tích ban đầu

• KHI LÊN MEN GIÁN ĐOẠN Ở NHIỆT ĐỘ

PHÒNG VÀ NHIỆT ĐỘ THẤP:

Sau khoảng thời gian lên men 7 tháng, hoạt

tính xúc tác không bị mất

Ở nhiệt độ thấp hơn năng suất cao hơn so với quá trình lên men truyền thống.

• LÊN MEN LIÊN TỤC:

Thiết bị phản ứng vận hành liên tục

trong 95 ngày mà không có sự giảm

bớt hoạt tính xúc tác sinh học

Chất xúc tác sinh học bền về động

học và hoá học

Mùi và vị của rượu sản xuất bằng quá trình lên men liên tục với tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trên miếng táo (A) so sánh với rượu thương mại (B)

Giá trị có nghĩa : 0 là không chấp nhận,

10 là tuyệt vời

Cố định trên vật liệu cellulose đã loại lignin (DCM)

Sự chuẩn bị DCM và cố

định tế bào

Mùn cưa Loại lignin

Đun nóng Lọc qua phễu

NaOH

Môi trường tăng trưởng

Phối trộn

Rửa với nước

Tiệt trùng

Nuôi cấy Nấm men

Lên men

Rót dịch Rửa

Tế bào cố định

Hiệu quả sản xuất của tế bào nấm men

rượu vang cố định trên DCM

Tốc độ lên men tăng ít nhất 3 lần khi so sánh với tế bào tự do

Vận hành ổn định cao

DCM làm giảm năng lượng hoạt hóa

Cố định trên DEAE- cellulose

Chất mang khô

Hydrat hoá Chuyển vào reactor

Khử trùng Rửa và trung hoà Cố định tế bào Nấm men

Tế bào cố định

Phương pháp

chuẩn bị cột và

cố định tế bào

Hiệu quả của phương pháp cố định

Cố định dễ dàng hơn, sự khởi động nhanh hơn, cải thiện về khả năng tái sinh và thời gian sử dụng chất mang

Tiếp xúc tốt giữa nấm men và cơ chất

Tăng về năng suất Nhiều tế bào trên một đơn vị diện tích bề mặt có thể lên men

•Ưu nhược điểm chất mang của các pp cố

định tế bào

•Yêu cầu về chất mang

•Ưu nhược điểm của tế bào cố định

Keo tụ tế bào (tạo hạt)

– Ưu điểm

• Đơn giản, dễ thực hiện.

• Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối.

– Nhược điểm

• Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung

dịch cho nên các tế bào dễ bị tách ra, làm tăng

hàm lượng tế bào tự do trong dung dịch.

Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel)

mạng gel

– Chất mang

• Polysaccharide: alginates, -carrageenan, agar, chitosan carrageenan, agar, chitosan

và polygalacturonic acid.

polyvinyl chloride

Nhốt bên trong một màng chắn

– Ưu điểm

• Sản phẩm tạo thành có thể không cần lọc

– Nhược điểm

• Khả năng truyền khối kém

• Màng membrane có thể bị bám bẩn do sự hấp phụ

cơ chất lên bề mặt màng

– Chất mang

• Membrane làm bằng vật liệu cellulose acetate,

cellulose nitrat, polyamide

Cố định trên bề mặt chất mang rắn

– Ưu điểm

• Ít hoặc không nguy hiểm đến tế bào

• Đơn giản, dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố định

• Không ảnh hưởng truyền khối

• Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố định và chất mang lớn

• Có thể phục hồi

– Nhược điểm

• Tế bào dễ bị tách ra

• Sự quá tải trên bề mặt chất mang  giảm hoạt tính xúc tác

• Sự thiếu không gian giữa tế bào và chất mang  cản trở

– Chất mang

• Các vật liệu cellulose: DEAE-carrageenan, agar, chitosan cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa

đã tách lignine, …

• Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica,

sứ xốp, thủy tinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất

titanium, …

Có bề mặt lớn với nhóm chức năng

Dễ điều khiển và tái sinh

ảm bảo khả năng sống của tế bào

Đảm bảo khả năng sống của tế bào

Độ xốp của chất mang phải đồng đều và có thể kiểm soát, cho phép sự trao đổi tự do của cơ chất, sản phẩm, cofactor, chất khí.

Ổn định cơ học, hóa học, nhiệt, sinh học và không dễ dàng bị giảm giá trị bởi enzim, dung môi, sự thay đổi áp suất hoặc lực uốn cắt.

Không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

Ưu điểm của tế bào cố định hơn tế bào tự do

Hoạt động kéo dài và sự ổn định

Mật độ tế bào cao hơn

Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiện Có thể thực hiện được với quá trình liên tục

Khả năng chịu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng, và giảm sự ức chế của sản phẩm cuối

Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp

Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn

Tái sinh và tái sử dụng

Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại

Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm

• Nhược điểm của tế bào cố định

Hiện tượng rò rỉ hay rửa trôi tế bào

Hiện tượng phân huỷ sản phẩm

Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất, … có thể gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào

Ch t mang ất mang

Cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate,

(b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố các block

Cơ chế tạo gel

• Phương pháp tạo gel từ bên ngoài

• Phương pháp tạo gel từ bên trong

Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều

kiện tạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men

Khối lượng phân tử   không ảnh hưởng đến tốc độ lên men +  độ bền gel.

Tỷ lệ M/G   tốc độ lên men  + độ bền gel .

Nồng độ alginate  (1 – 10%)  tốc độ lên men  + độ bền gel .

pH tạo gel: 6,0 – 8,0 Nhiệt độ tạo gel: < 25oC Mật độ tế bào trong hạt.

Tỷ lệ S/V   năng suất lên men .

Chất mang

Thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu

Phân tử polyvinyl alcohol có cấu trúc hoá học tương đối đơn giản với các nhóm hydroxyl (-carrageenan, agar, chitosan OH) nằm đối

xứng nhau trong phân tử

Công thức phân tử polyvinyl alcohol

CH2 CH

OH n

CH O

Bền trong các loại dung môi, dầu thực vật và cả mỡ động vật,có khả năng hình thành một màng mỏng với lực căng bề mặt lớn

Tính chất phụ thuộc vào khối lượng trung bình của phân tử polyvinyl acetate ban đầu, mức độ thuỷ phân cũng như mức độ trùng hợp hoá của phân tử đó

Độ nhớt: Độ nhớt của dung dịch polyvinyl alcohol

tăng tỉ lệ với mức độ thuỷ phân và mức độ trùng hợp của phân tử Tính chất này phụ thuộc nhiều vào mức độ trùng hợp hơn là phụ thuộc vào mức độ thuỷ

phân

Tính keo:Polyvinyl alcohol có khả năng bám dính cao hơn so với các polymer tự nhiên tan trong nước khác Khi mức độ trùng hợp và mức độ thuỷ phân tăng,

tính bám dính của phân tử polyvinyl alcohol trong

nước cũng tăng

Khả năng chịu nhiệt: Polyvinyl alcohol sẽ chuyển

sang màu vàng dưới tác dụng của nhiệt độ

Ứng dụng của polyvinyl alcohol:trong công nghiệp,

đặc biệt là trong ngành dược, hoá sinh học, trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật …

Nguyên tắc:

Dung dịch CaCl 2 chứa tác nhân tạo đặc, nh vào ỏ vào dung dịch natri alginate

M chất tạo đặc lớn  làm lõi lỏng nhớt

M chất tạo đặc thấp  gây ra áp suất thẩm thấu lớn

So sánh phương pháp cố định bằng cách nhốt trong mạng

gel và phương pháp bao gói.

Đặc điểm kỹ thuật Phương pháp

Vi bao Nhốt Kích thước hạt (mm) 2,3 (2,1) 1 2,0  2,5

Nồng độ tế bào trong hạt (g/l) 1,73  253

(g/l)

1 Giá trị tính trên không gian bên trong.

2 30 hạt tạo huyền phù trong 50 ml dung dịch và được làm ấm.

Cố định trong thiết bị phản ứng

membrane

Phương pháp thực hiện:

Thiết bị phản ứng sinh học membrane loại một bình:

•Môi trường được cung cấp vào bằng bơm nhu động

(peristaltic pump) để cung cấp một tốc độ xác định

•Dung dịch lên men được dẫn vào từ bình chứa vào

trong thiết bị vi lọc dòng chảy ngang bởi bơm nhu động.

• Dòng permeate không chứa tế bào thấm qua được

tháo ra khỏi hệ thống và tập trung trở về bình chứa

•Để điều chỉnh việc cân bằng giữa cung cấp môi

trường và thu hồi phần nước lọc, bình được đặt một cảm biến mức độ loại điện cực để dò mực chất lỏng

•Việc thu hồi phần nước lọc được thực hiện đều đặn

bởi van điện từ được điều chỉnh bởi cảm biến mức độ

•Nhiệt độ được giữ ở 25oC bởi sự nhúng bình vào

trong bồn nước giữ nhiệt

•Ở giai đoạn đầu quá trình lên men gián đoạn được

thực hiện trong 24 giờ trong bình của thiết bị phản ứng sinh học membrane, và sau đó thì lên men liên tục

• Thiết bị phản ứng sinh học membrane loại hai bình.

•Bình thứ nhất là một thiết bị phản ứng khuấy liên

tục, và bình thứ hai là thiết bị phản ứng sinh học membrane

•Quá trình lên men liên tục được thực hiện như sau

Trong bình một, quá trình gián đoạn được thực hiện trong 48h, sau đó môi trường mới được cung cấp vào cho bình 1 từ bồn chứa ở một tốc độ nhất định, và dịch lên men được chuyển từ bình 1 vào bình 2 Ở trong bình

2, quá trình lên men liên tục được thực hiện trong 100 giờ với tốc độ pha thêm là 0,3/giờ sử dụng môi trường mới, sau đó dịch lên men của bình một được cung cấp thay vì môi trường mới và một phần dịch lên men trong bình 2 được trở về bình một với bơm nhu động.

Hiệu quả của phương pháp cố định

Khi so sánh với lên men gián đoạn, thiết bị phản ứng sinh học membrane đạt được nồng độ tế bào và năng suất cao hơn rõ rệt

Thiết bị phản ứng sinh học membrane một bình:

o Mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và tốc độ pha là mối

quan hệ tuyến tính

o Tốc độ tiêu thụ đường được điều chỉnh bằng tốc độ pha

Thiết bị phản ứng sinh học membrane hai bình: sản xuất vang khô, năng suất của hệ thống này gấp 28 lần so với lên men gián đoạn

Cố định trên bề mặt chất mang rắn

Phương pháp cổ điển

Ngâm chất mang trong dd huyền phù vsv Vsv sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó

Phương pháp cổ điển có cải tiến bằng cách sử dụng cánh khuấy

Tế bào vi sinh vật và chất mang phân bố đều khắp trong dung dịch

Diện tích tiếp xúc giữa chất mang và vi sinh vật là cực đại  hiệu suất gắn được cải thiện đáng kể

Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang

Ly tâm Phối trộn

Vỏ nho Tiệt trùng Môi trường

Nấm men cố định

Rửa Lên men

Hiệu quả sản xuất của tế bào nấm men rượu

vang cố định trên vỏ nho

Hình: năng suất sản xuất cồn ở những nhiệt độ lên men khác nhau.

Hình: năng suất riêng sản xuất cồn ở những nhiệt độ khác nhau.

Hiệu quả sản xuất của tế bào nấm men rượu

vang cố định trên vỏ nho

So sánh với tế bào tự do, về đặc điểm chuyển

hóa, Saccharomyces cerevisiae khi liên kết trên

vỏ nho có tốc độ hấp thu glucoza, fructoza, và

khả năng sản xuất cồn nhanh hơn ở tất cả nhiệt

độ

Chuyển đường thành ethanol nhanh và hiệu quả

hơn, thậm chí ở nhiệt độ cao hơn lượng đường

hướng vào tăng trưởng hoặc hoạt động duy trì

thì gần như không đổi.

Phương pháp thực hiện đơn giản , nhanh, rẻ và

không có hoá chất

So sánh với chất mang khác

Cho vị tốt hơn, giảm lượng độc tố khi so sánh với

gluten pellet và chất mang vô cơ kissiris

Giảm một lượng lớn chất bay hơi như rượu bậc cao

và rượu amyl.

DCM không đắt và dễ dàng điều khiển trong lĩnh

vực công nghiệp.

• Nguyên tắc

• Hạt DEAE-carrageenan, agar, chitosan cellulose (trao đổi ion yếu) là chất mang

không nén và có thể tiệt trùng được, kết tụ lại với

polystyrene

• Sự cố định tế bào nấm men được thực hiện sau khi

tiệt trùng chất mang Nó được thực hiện bằng cách

bơm huyền phù nấm men hoạt động vào trong thiết

bị phản ứng

Mineral kissiris

a Giới thiệu về chất mang:

• Mineral kissiris được hình thành từ lớp bọt dày của dung nham núi lửa Khoáng rắn chứa SiO2 vào khoảng 70% về khối lượng

• Kissiris có độ gồ ghề và tính xốp cao

• Nhược: Nguyên liệu có thể bị rã ra trong quá

trình nuôi cấy vi sinh vật.

b Phương pháp chuẩn bị Kissiris:

Kissiris Ngâm

Làm khô Rửa

Kissiris đã được chuẩn bị

c Hiệu quả của phương pháp cố định:

Phù hợp với quá trình sản xuất rượu vang liên

tục ở nhiệt độ thấp (5-16oC)

Năng suất sản xuất ethanol ở 5oC bởi quá trình lên men liên tục thì bằng với năng suất quan sát

ở nhiệt độ 22-25oC bởi quá trình lên men tự

nhiên

Thiết bị lên men liên tục hoạt động trong 75

ngày mà không có sự giảm bớt năng suất sản

xuất ethanol

Vấn đề bảo quản chất mang liên tục ở

nhiệt độ thấp:

Tăng tính ổn định của chất xúc tác sinh học và

tăng năng suất sản xuất ethanol và rượu

Thêm vào đó năng suất sản xuất rượu và

ethanol cao hơn ít nhất là năm lần khi so với tế bào cố định trên chất mang tương tự mà không

bảo quản ở nhiệt độ thấp