NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

NS hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH



VÕ THỊ BÍCH VÂN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn Cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong Khoa Sinh và Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Xin gởi lời cảm ơn đến Phòng Khoa học Công nghệ- Sau đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

MỞ ĐẦU

NS hay cịn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nĩng ẩm Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vịng tuần hồn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn

Một trong những đặc điểm nổi bật của NS là cĩ hệ enzym ngoại bào rất phong phú Trong

đĩ, protease là một trong những enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất nhờ protease của chúng cĩ tính chất bền vững rất cao và cĩ khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease từ động vật, thực vật và vi khuẩn [22]

Trong cơ thể động vật, thực vật quá trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể Vì vậy, muốn thu được enzym cần phải phá bỏ tổ chức đĩ, nguồn thu enzym thường phải tươi và quá trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên Bên cạnh đĩ, thời gian thu họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym là khơng kinh tế và khơng đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzym của con người

Hiện tại và tương lai gần, NS vẫn là một trong những đối tượng quan trọng nhất, kinh tế nhất trong sản xuất enzym ở qui mơ cơng nghiệp vì:

- Chúng cĩ hệ enzym vơ cùng phong phú với hoạt tính cao hơn các sinh vật khác

- Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên cĩ thể sản xuất lượng lớn enzym trong thời gian ngắn

- Cĩ thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền trong nuơi cấy NS sinh enzym

- Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp

Các enzym từ NS được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), trong CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để phục vụ chăn nuơi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ơ nhiễm MT [4]

Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế các tác hại do NS gây ra, con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến NS Trước đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu NS phân bố ở đất liền Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST cĩ năng suất sinh học cao nhất trong các HST Với điều kiện sinh thái của RNM con người cĩ thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các

tổ hợp gen Từ đây, cĩ thể tìm được các chủng NS cĩ hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính cĩ lợi cho con người

Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm, bền vững và cĩ khả năng chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Đây là nơi cĩ hệ VSV vơ cùng phong phú

và đa dạng như NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., trong đĩ NS chiếm số lượng rất lớn Cĩ thể thấy RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng NS cĩ hoạt tính enzym cao chưa được khai thác

Thảm thực vật và các hệ động vật cĩ trong RNM Cần Giờ thật sự là các nguồn thức ăn tốt nhất cho VSV sống trong RNM đặc biệt là hệ NS NS cĩ khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose cĩ trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng Ngồi ra, NS cịn cĩ thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase… phân hủy xác, vỏ tơm, cua,

ốc, xác chết các lồi động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng cĩ thể hấp thu Vậy hệ NS là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển hĩa vật chất ở RNM Cần Giờ

Ở Việt Nam các cơng trình nghiên cứu về NS sinh protease khá nhiều và chỉ tập trung trên đất liền Các cơng trình khoa học chính thức nghiên cứu về NS sinh protease từ RNM Cần Giờ đã

cĩ song cịn nhiều hạn chế

Để gĩp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ NS chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”

Mục tiêu của đề tài:

Phân lập và tuyển chọn một chủng NS cĩ khả năng sinh protease cao từ RNM Cần Giờ

TP Hồ Chí Minh

Nhiệm vụ đề tài

- Phân lập NS từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh

-Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính protease cao nhất

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng NS được chọn

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của chủng NS từ

đĩ xác định động thái quá trình tổng hợp protease của chủng NS nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm protease thơ từ NS

- So sánh hoạt độ enzym của chủng NS nghiên cứu với chế phẩm enzym trên thị trường Thời gian, địa điểm làm đề tài

- Thời gian: từ tháng 9/2008- 7/ 2009

- Địa điểm thí nghiệm: PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh

Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đơng hiện hữu một khu RNM đan xen với hệ thống sơng rạch dày đặc chứa đựng các HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều lồi động thực vật đặc hữu của miền duyên hải Việt Nam Đĩ là khu RNM Cần Giờ nằm gọn trong địa giới huyện Cần Giờ và rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm ở cửa ngõ Đơng Nam thành phố Hồ Chí Minh Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đĩ, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha

RNM Cần Giờ giới hạn bởi các đoạn sơng, rạch, tắc như sơng Sồi Rạp, sơng Vàm Sát, rạch Đơn, tắc An Nghĩa, sơng Lịng tàu, tắc Rổi, sơng Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sơng Thị Vải, sơng

Gị Gia , sơng Cái Mép và biển Đơng, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đơng sang Tây dài 30km Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sơng Sài Gịn và sơng Đồng Nai mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hố và quá trình nhiễm mặn

Khí hậu Cần Giờ nĩng ẩm và chịu chi phối của qui luật giĩ mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt

Lượng mưa: thấp nhất TP Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9.[35]

- Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35].

- Độ ẩm khơng khí: cao hơn các nơi khác trong TP Hồ Chí Minh Mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khơ độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khơ nhất vào tháng 4 [36].

- Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều khơng đều, hai lần nước lớn và hai lần nước rịng trong ngày Các tháng cĩ đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4

và tháng 5 [36].

- Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực cĩ thể lên đến 18% lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém Nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và tháng 10 [13]

* Khu hệ thực vật

Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế

Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại

đậu, dừa và các vườn cây ăn trái [34]

* Khu hệ động vật

Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho thấy:

+ Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài

có vú Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia

mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)…[34]

+ Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau [35]

Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần

Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [35]

* Khu hệ VSV

- Vi khuẩn

VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34] Nhiều loài sống trên các giá thể

bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển

- Nấm

Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá TV (Fell và cộng sự 1975) Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên [33]

Nấm đĩng một vai trị rất quan trọng trong HST bởi vì NS tham gia các chu trình sinh địa hĩa

ở nhiều lưới thức ăn Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vơ cơ, rồi sau đĩ những chất này sẽ được đồng hĩa ở TV hay những SV khác [46] Bản thân NS từ RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều lồi ĐV nhỏ và ấu trùng của một số lồi (Odum, 1980; Alongi, 1989)

VSV ở RNM ngồi VK và NS cịn cĩ nấm men, xạ khuẩn,… chúng đĩng vai trị hết sức quan trọng đối với chu trình tuần hồn vật chất trong hệ sinh thái nơi này Chúng tham gia bảo vệ MT sinh thái RNM nĩi riêng và MT sinh thái nĩi chung, cũng như vai trị to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các lồi SV Từ đĩ, đĩng gĩp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này

 Vai trò của RNM

Một số lồi TV ở RNM cĩ thể xếp vào nhĩm cơng dụng chủ yếu: 30 lồi cây cho gỗ, than, củi,

14 lồi cây cho tannin, 24 lồi cây làm phân xanh, 21 lồi cây dùng làm thuốc, 9 lồi cây chủ thả kiến cánh đỏ, 21 lồi cây cho mật nuơi ong, 1 lồi cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2] Ngồi ra, RNM cịn cĩ nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 lồi lưỡng cư, 22 lồi bị sát, 67 lồi chim, 21 lồi thú,… Các SV ở nước rất phong phú gồm 64 lồi cá thuộc 35 họ, 25 lồi tơm, 66 lồi TV phiêu sinh, 26 lồi ĐV phiêu sinh và 22 lồi ĐV đáy [2]

Ngồi ra các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái RNM đã phát hiện

trong đất RNM cĩ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và chủng NS Paecilomyces farinosUIs Các

loại vi sinh vật này tạo được protein tinh thể độc, cĩ khả năng tiêu diệt một số lồi cơn trùng gây hại

cho người và động thực vật như các lồi sâu rĩm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles

minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi

Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM cịn đĩng vai trị quan trọng trong việc điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xĩi lở và quá trình xâm thực bờ biển RNMcung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuơi của nhiều lồi hải sản cĩ giá trị kinh tế cao như tơm, cua, cá,…

Mặt khác, RNM cịn cĩ tác dụng làm chậm dịng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sĩng khi triều cường Hạn chế tác hại của sĩng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch MT nước khi cĩ lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18]

1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ

1.2.1 Vị trí phân loại

Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và Eumycota Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina và Basidiomycotina [41]

Ngành phụ Deuteromycotina được chiatheo 3 lớp: [42]

+ Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm

men và có sự nảy chồi

+ Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống,

không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT

+ Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT:

Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales Theo C J Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới

mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ protista) và giới Protista Giới nấm có 4

ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota Phần của nấm trong giới Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota Bốn ngành khác của nấm được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota Lý do của sự phân chia này là từ những bằng chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học Các bằng chứng chứng minh sự tồn tại của

3 nhóm nấm khác nhau Gần đây, sau khi hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu trúc và sắp xếp lại Tất cả các phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới nấm Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần còn lại [43]

1.2.2 Hình thái, cấu trúc

Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn Ngược lại, các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại các bộ phận sợi nấm bị thương tổn Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ

cơ thể [5]

Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều

tế bào

Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao

đó tiến dần vào trong và lấp kín lại Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng Các lỗ

có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể chuyển động, đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm)

Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi nấm Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm [4] [44]

Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có hạch nhân (nucleolus) Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể golgi [4], các giọt lipid, các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitô đường kính 40-70 nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome)

Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn

Ribosome của nấm thuộc loại 80S đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S [45]

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL Vì BT của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu

Ngoài những đặc điểm chung thì NS từ RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau:

Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14] Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS từ RNM Do đó, phần lớn các NS từ RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzym, nhất là các enzym ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng của NS trong quá trình cạnh tranh ở MT sống Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc

Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này bằng khả năng sinh tổng hợp được hệ enzym phân giải các chất độc hại

RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm

là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13] Nhờ có những đặc tính sinh học

(a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm

Hình 1.2: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi

(b) Cấu trúc của sợi nấm

Vách tế bào

Màng tế bào Nhân

Thể golgi Không bào

Ti thể Luới nội chất Nhân

đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại mà NS có thể cải thiện MT sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật

Đa số các NS từ RNM đều có khả năng chịu mặn cao Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 1,5 % - 2,5% Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13] Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM

Tóm lại, NS ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục

vụ nhu cầu và lợi ích của con người Tuy nhiên, những nghiên cứu về NS RNM còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng,

Bào tử kín: được tạo thành từ đỉnh một sợi nấm được phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản

Bào tử trần: là loại bào tử vô tính thường gặp nhất ở nấm Chúng có hình dạng, kích thước,

kết cấu hết sức phong phú Tế bào sinh bào tử trần gọi là giá (hay cuống) bào tử trần (conidiophore)

Hình 1.3 Bào tử kín (a) và bào tử trần ( b) của NS Sinh sản hữu tính

Xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:

 Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử

 Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid)

 Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân

từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội)

Hình 1.4: Sự tiếp hợp của NS 1.2.4 Vai trò của NS

NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất cĩ họat tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất cĩ khả năng phân giải nguồn cacbonhydrat [5],[9]

 Họat tính enzym thủy phân ngoại bào

Enzym là những protein cĩ khả năng xúc tác cho các phản ứng hĩa học trong và ngồi cơ thể [22] Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đĩ phần lớn là enzym từ thực vật và VSV NS cĩ tiềm năng lớn nhất sinh các lọai enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hĩa các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khĩ tan trong tự nhiên Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: xellulase, protease, amylase, pectinase và kinase [5]

 Enzym cellulase: Cellulase là một nhĩm nhiều enzym xellulase C1( endo cellulase), cellulase Cx(exoxellulase) và xellobiaza cĩ tác dụng thủy phân cellulose tạo thành glucose Các VSV cĩ hoạt tính cellulase cao là các lồi vi khuẩn, xạ khuẩn chịu nhiệt và NS Trong đĩ, các

chủng NS thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,….cĩ khả năng sinh enzym cellulase

được sử dụng trong chăn nuơi để nâng cao sự tiêu hĩa cellulose ở động vật Ngồi ra chúng cịn được dùng trong sản xuất glucose từ bã và sản phẩm thải ở của cơng nghiệp rừng, làm phân bĩn,

xử lí rác thải[17],[18]

 Enzym protease: Protease là nhĩm enzym thủy phân protein thành peptit và axit amin

bằng cách cắt đứt các liên kết peptid Protease gồm cĩ proteinaza và peptidaza chúng cĩ tính đặc hiệu tương đối rộng Protease NS cĩ khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi khuẩn, người ta chia protease NS thành ba nhĩm: protease axit, protease kiềm và protease trung

tính NS cĩ khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus…

Protease NS thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy

….[8], [10],[20]

 Enzym amylase: Xúc tác quá trình phân giải glycogen và các polysacarit thành đường

glucose Nhiều loại NS cĩ khả năng sinh amylase Tổ chức phức hệ enzym amylase của NS gồm α

amylase, γ amylase (glucoamylase), α- glucozidaza (mantaza) và dextrinaza sẽ cắt đứt các liên kết α- 1,4- glucoside và α- 1,6 glucoside trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysacarit tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là các chủng thuộc chi

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma Rhizopus, Mucor,… Amylase được dùng trong sản xuất siro,

sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, …[20], [21]

 Enzym kitinase: Kitinase phân giải kitin, kitin là các biopolyme chứa các gốc N- acetyl-

glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β- 1,4- glucoside Trong RNM, lượng kitin trong vỏ

tôm, cua, ốc …rất nhiều NS thuộc chi Trichoderma, Chaetominum,… sinh enzym kitinase phân

giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin,

chống các loài côn trùng có vỏ kitin

Như vậy, NS còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông – lâm – ngư – nghiệp [16]

Các chủng NS thuộc các chi Acremoium, Penicillium, Aspergillus còn có khả năng sinh

enzym phân giải dầu mỏ là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lí ô nhiễm dầu Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ, các loài NS có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó

 Khả năng sinh kháng sinh của NS

KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác

Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephaco- sporin- C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch hầu, uốn ván… Trong phẫu thuật , KS dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương

Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS Những vấn đề về chất kháng có nguồn gốc từ VSV của RNM đang được quan tâm nghiên cứu hàng đầu và ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực hiện nay [14]

 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ từ VSV ngày càng nhiều Các axit hữu cơ như axit acetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất

axit citric bằng A niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng F monoforme và F oxysporum

[19], [20]

1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay, có khoảng 800 - 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại Sự hiểu biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy

đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998) Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950

Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ

Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2 loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7 loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài Qua đó, có thể thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của ngành VSV học [35]

Năm 1988, Agate A.D, Subramania C.V và Vanuci M đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV học RNM cần được các nhà khoa học giải quyết Trong đó, có lĩnh vực phân loại

và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới

Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM Ông đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao,

bao gồm 23 loài thuộc Ascomycetes, 17 loài thuộc Deuteromycetes và 3 loài thuộc Basidiomycetes

Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới Trong đó, bao gồm 87 loài

thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes

Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới

Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994)

Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài

cây ngập mặn Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là các loài Alternaria alternate,

Rhizopus nigricans, Aspergillus sp [41]

Một số NS còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị đối với sinh học và y học (theo Mai Thị Hằng và cộng sự ) [11]

Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng NS

có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng Với đặc tính này NS góp phần quan trọng giúp phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ [1]

Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu,

xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay [20] NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống và với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13] Bên cạnh đó chúng còn có chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường

Kết quả nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có hoạt tính đối kháng với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, cùng với khả năng chịu mặn Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ [18] Năm 2009 công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương đã tuyển chọn được các chủng

NS có hoạt tính amylase cao Với đặc tính này của NS người ta có thể sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền như bã mía, bã khoai mì để sản xuất rượu, bia cho năng suất cao

Cùng năm 2009 Võ Thị Bích Viên đã khảo sát tính đối kháng của một số chủng nấm sợi thuộc

chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh Đây là một

nguồn gen quí, rất có giá trị trong y học

1.3 Protein và enzym protease

1.3.1 Protêin

Protein là một loại hợp chất hữu cơ cao phân tử có kết cấu hoá học phức tạp Protein được cấu thành từ 4 nguyên tố chính là cácbon, hiđro, oxy và nitơ. Các loại prôtêin đơn giản gồm các axit amin nối nhau nhờ các liên kết peptit bền vững Các loại prôtêin phức tạp hơn có liên kết thêm với

các nhóm bổ sung Prôtêin chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của

tế bào

Cấu trúc của prôtêin

Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi pôlipeptit Đầu mạch pôlipeptit là nhóm amin (của axit amin thứ nhất), cuối mạch là nhóm cacbôxyl (của axit amin cuối cùng) Một phân tử prôtêin đơn giản có thể chỉ được cấu tạo từ vài chục axit amin nhưng cũng có những phân tử prôtêin bao gồm nhiều chuỗi pôlipeptit với số lượng axit amin rất lớn

Chức năng của protein

Prôtêin là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống Chúng đóng vai trò cốt lõi của cấu trúc nhân, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học Các enzym có bản chất là prôtêin đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học

Một số prôtêin có vai trò như những “xe tải” vận chuyển các chất trong cơ thể (ví dụ

hêmôglôbin)

H 2 O

Tham gia cấu thành các kháng thể có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm hại của vi

khuẩn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể

Điều tiết áp lực thẩm thấu: Nếu trong bữa ăn bị thiếu protein lâu ngày, hàm lượng protein

trong huyết tương sẽ hạ thấp, thành phần nước trong máu sẽ thấm quá nhiều vào các mô xung

quanh, gây ra phù nề do thiếu dinh dưỡng

Các hoocmôn - phần lớn là prôtêin – có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất trong tế bào

và trong cơ thể (ví dụ insulin điều hoà lượng đường trong máu) Nhiều loại prôtêin tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể (ví dụ miozin trong

cơ, các prôtêin cấu tạo nên đuôi tinh trùng)

Lúc thiếu hụt cacbohiđrat và lipit, tế bào có thể phân giải prôtêin dự trữ cung cấp năng lượng

cho tế bào và cơ thể hoạt động

Tham gia cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể: là công dụng sinh lý chủ yếu nhất của

protein thần kinh, cơ bắp, nội tạng,…Sự sinh trưởng phát triển của cơ thể, sự đổi mới của các tổ

chức suy lão, sự phục hồi các tổ chức sau tổn thương đều cần đến protein [40]

Ngoài ra, một số prôtêin còn có vai trò là giá đỡ, thụ thể… Sự đa dạng của cơ thể sống do tính

đặc thù và tính đa dạng của prôtêin quyết định

1.3.2 Đặc điểm của protease từ NS

Enzyme protease là nhóm enzym xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit

(-CO-NH-)n trong phân tử protein hoặc các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài

ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.5 : Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid

Protease cần thiết cho các sinh vật sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật

(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease

động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết, hệ protease VSV

là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình

dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Protease VSV được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid : pH 2- 5

- Protease trung tính : pH 7-8

- Protease kiềm : pH 9.5 - 10.5

Phần lớn những protease acid thương mại được thu từ NS Các NS được nghiên cứu kỹ nhất

và được sử dụng nhiều nhất để thu enzym là Asperillus saitoi, Asperillus niger, Asperillus oryzae ( Keay etal) Khá nhiều protease acid khác được thu từ Rhizopus sp ( Wang và Hesseltine ) đã được

nghiên cứu

1.3.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng protease NS trên thế giới và Việt Nam

Protease VSV được nghiên cứu và thu nhận đầu tiên vào năm 1884 do người Nhật tên là

Takamine Đó là chế phẩm được tách từ chủng nấm mốc Asperillus oryzae (Kretovitch) Tiếp theo

đó, vấn đề nâng cao khả năng tạo protease của các chủng nấm mốc ứng dụng cho công nghiệp rượu bia đã được nghiên cứu ở Nhật (Yosida, ) và ở Mỹ ( Matsushima, )

Đến những năm 70, chế phẩm protease của các chủng nấm mốc Asperillus oryzae có tên

thương mại là Proteorizin Px đã được dùng nhiều ở Liên Xô (Iarovenko, 1973) Protease của các NS

có tính chất bền vững rất cao và tùy thuộc vào từng chủng giống và điều kiện nuôi cấy mà nó mang tính chất kiềm, axit hay trung tính (Harigara, 1971)

Trong công nghệ thực phẩm người ta sử dụng protease NS để sản xuất phomat ( Mohanty et

al, 1999), sản xuất bánh mì (Hozova et al, 2003) hay chế biến các sản phẩm từ đậu tương (Ghazi et

al ,2003; Ma et al, 2004)

Ở Việt Nam, năm 1993- 1994 TS Trương Thị Hòa và các cộng sự Viện Công nghiệp thực

phẩm đã nghiên cứu và ứng dụng enzym protease của A.oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ

cốc tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn

Từ năm 2000-2001 nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh cùng các cộng sự phòng

vi sinh, Viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu cải thiện quy trình công nghệ sản xuất nước tương

bằng phương pháp sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae Quy trình mới này

rút ngắn được thời gian sản xuất, cho chất lượng nước tương ổn định, mùi vị thơm ngon tự nhiên Năm 2003, Lê Thị Cẩm Tú tiến hành chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao

và chịu mặn Luận văn thạc sĩ sinh học Trường ĐHKHTN – TP.HCM

Năm 2007 Th.S Phan Thị Thanh Quế sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus

oryzae để thủy phân protein thịt cá trong chế biến nước mắm

Ngoài những nghiên cứu về protease của NS còn có những công trình nghiên cứu về các chất

có hoạt tính sinh học từ NS như:

Các chế phẩm từ NS được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loại côn trùng, VSV gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau ( Harman và Kubicek, 1998)

Từ NS RNM người ta đã thu được một số chất kháng sinh mới có khả năng chống các VSV gây bệnh đã nhờn các loại thuốc kháng sinh hiện có ( Isaka M, Suyarnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002)

Năm 2007 Phan Thanh Phương khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh

Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân lập được một số chủng NS phân giải các thành phần hydrocacbua thơm và các hợp chất mạch vòng benzen trong dầu mỏ

Năm 2007 Phạm Thị Thanh Thuý đã nghiên cứu khả năng phân giải carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ

 Một số ứng dụng của protease [39], [28]

Trong chế biến thực phẩm

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một

phần protein trong thịt Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được

chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng Muốn vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thời gian chế biến thường dài, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử dụng chế phẩm protease thực vật (bromelain và papain) và từ VSV để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ

sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B mesentericus,… được

dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn bột, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của

bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ

cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [6]

Công nghiệp dệt

Trong công nghiêp dệt, protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ

tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

Công nghiệp thuộc da

Protease được sử dụng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi colagen Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông

Ở Mỹ, chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Kết quả

đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ

quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B mesentericus, B

subtilis), nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công

nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [4]

Chế biến các loại bột giặt

Ngày nay, enzyme được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ

Hương mỹ phẩm

Chế phẩm protease có thể pha chế trong mỹ phẩm như xà bông, dầu gội, kem xoa, dầu chải tóc,

có tác dụng làm da, tóc mềm mại, tách biểu bì đã chết, tạo sự phát triển lớp da non

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong số ngành khác như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản

xuất một số thức ăn kiêng

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, KS

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của NS a Nguồn cacbon

Trong MT nuôi cấy NS sinh protease nhất thiết phải có protein làm chất cảm ứng và nguồn cacbon NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Nguồn cacbohydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình

chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [24],[25] Nguồn cacbon cho sinh trưởng của NS thường dùng là glucose

b Nguồn nitơ

Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của NS Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất là NH4+ và NO3- , chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm imin

và amin

Các muối amon của axit hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của NS hơn là muối amon vô

cơ Cơ chất dùng để cảm ứng NS sinh protease thường là bột đậu nành, cám, ngô, casein, cao

thịt,…[28]

c Độ ẩm

Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30-80% (Moo-Young, 1983) Trong quá trình nuôi cấy NS thu protease, độ ẩm tối ưu là 50-60% Nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho VK phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở NS, hoạt tính enzym sẽ giảm.[25]

d pH

Sự sinh trưởng của NS sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất Cơ chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra axit hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH Ngược lại, sự giải phóng amonium qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH pH tối ưu cho các loài NS khác nhau từ 3-8 ( Prior, 1992) tùy vào từng chủng Nhưng đa số NS pH tối thích

là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 [26]

e Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh protease Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số NS từ 30-320C [26] Nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được

là 35 - 400C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 00C và ở 600C Nếu nhiệt độ xuống dưới

240C NS phát triển chậm , sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzym Nếu nhiệt độ quá cao có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym bị ức chế [25]

f Thời gian

Thời gian nuôi cấy NS thu enzym trong khoảng 36-60 giờ Tùy từng chủng và tùy loại enzym

mà thời gian nuôi cấy có thể ngắn hơn hay dài hơn Đối với A.oryzae và A awamori nuôi trên MT cám để sản xuất amylase khoảng 36-40 giờ, nhưng nuôi A oryzae để thu protease khoảng 48 – 52

giờ [25]

1.3.5 Nuôi cấy và thu nhận enzym từ NS [20]

Nuôi cấy

Nuôi cấy NS để thu enzym người ta thường dùng MT bán rắn

Môi trường bán rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như: cám, ngô, bột đậu tương,… Môi trường bán rắn hay dùng nhất là cám Chất lượng cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzym, muốn nâng cao hoạt tính một số enzym cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bột đậu tương giàu protein, bã khoai mì giàu tinh bột, củ cải đường giàu pectin và xelullose,….Ngoài ra, cần

bổ sung thêm khoảng 15 – 20% trấu, rơm băm vụn, mùn cưa…để tạo độ xốp.cho MT

Môi trường bán rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60 – 65% rồi đem thanh trùng Môi trường được tãi mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2-2.5cm hoặc trong các bình tam giác, để nguội tới 300C thì tiến hành cấy giống

Quá trình nuôi cấy NS trên môi trường bán rắn được chia làm 3 thời kì:

Khoảng 10-14 giờ đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kì này chưa hình thành enzym Thời kì giữa kéo dài khoảng 14-18 giờ, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát thấy bằng mắt thường

Thời kì thứ ba kéo dài trong khoảng 10-20 giờ ,thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục

Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng NS, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm

mà lượng enzym tạo thành tối đa

Các phương pháp thu nhận enzym [20], [24]

* Chiết rút enzym từ MT bán rắn :

Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym

Các bình tam giác đã cấy giống sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem nghiền mịn bằng cách giã trên cối với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thủy tinh đã được rửa sạch và sấy khô Cát hay bột thủy tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của VSV mà không làm thay đổi bản chất enzym

Sau khi nghiền MT, cho vào đó lượng nước (ở nhiệt độ 25- 28 0C) gấp 4-5 lần khối lượng MT

để hòa tan enzym Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác Dịch chiết thu được có màu sẫm , khá trong, chứa 10-15% chất khô hoà tan Tiến hành lọc hoặc quay ly tâm 3000 vòng/ phút /15 phút, thu và bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 40C Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô

* Thu nhận enzym từ dịch nuôi cấy chìm:

Dịch nuôi cấy chìm sau khi lọc sinh khối NS và các tạp chất rắn không tan để thu nhận enzym

Về nguyên tắc tách enzym từ dịch lọc nuôi cấy chìm cũng tương tự như tách từ dịch chiết từ MT bán rắn

Tinh sạch enzym

Tiến hành:

Tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp Thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút Đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng

- Các chủng nấm sợi phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây ở 4 xã RNM Cần Giờ TP HCM: Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Long Hịa, Lý Nhơn

- Bột đậu tương ,mua ở chợ Tân Định – TP HCM

-Cám gạo, trấumua ở Vĩnh Long

- Các VSV kiểm định: E.coli, B subtilis được cung cấp từ viện Pasteur – TP HCM

- Chế phẩm enzym protease của Cơng ty TNHH dinh dưỡng Á Châu (VN) tỉnh Đồng Nai

2.1.2 Hĩa chất – thiết bị

 Hĩa chất

- Glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactosse, pepton, cazein, kitin, tinh bột tan, agar, cồn

- K2HPO4, KCl, NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO47H2O, HgCl2, NH4NO3

 Thiết bị, dụng cụ

- Các thiết bị:

Nồi hấp vơ trùng Huxley (Đài Loan)

Tủ cấy vơ trùng ( Việt Nam)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Tủ ấm Binder (Đức) KHV quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)

Tủ lạnh (National - Nhật)

Máy đo pH Hana (Nhật) Máy li tâm Heraeus( Đức) Cân điện tử Scientech ( Mỹ)

KCl 0,5g FeSO4 0,1g Glucose 20g Agar 20g Nước biển 1000ml

pH = 6,5 Khử trùng 1 atm/30 phút

 MT2: Glucose Yeast Agar (YEA) MT nuôi cấy NS [32] Cao nấm men 4g

Agar 20g Glucose 20g Nước biển 1000ml

pH = 6,5 Khử trùng 1 atm/30 phút

 MT 4: thử họat tính protease [14]

K2HPO4 1.5g

MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 7H2O 0,01g Cazein 10g Agar 20g Nước biển 1000ml

pH = 6,5 Khử trùng 1 atm/30 phút

 MT 5: thử hoạt tính amylase [30]

NaNO3 3,5g

K2HPO4 1.5g

MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 7H2O 0,01g Tinh bột tan 15g Agar 20g Nước biển 1000ml

Casein 1% (R55) Tyrosine (R57) Thuốc thử Folin- Ciocalteu (R56)

 MT9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [21]

KH2PO4: 3.3g MgSO4: 0.4g KNO3 : 3g

Na2HPO4 : 0.7g

Nước biển : 1000ml Dầu DO: 5ml

pH = 5.5 -6.0.Khử trùng ở 1atm/30 phút

 MT10 : Meat peptone agar ( MPA): MT nuôi cấy giữ giống VK kiểm định [19]

Pepton : 5g NaCl: 5g Cao thịt: 5g Agar : 20g nước cất: 1000ml pH: 7,5 khử trùng 1atm/30 phút

Phân lập các chủng NS từ các mẫu lá vàng trên cành (Ký hiệu là L), lá mục (LM), cành khô

Với mục đích thu được nhanh các chủng có khả năng sinh protease như mong muốn, chúng tôi chuẩn bị sẵn MT có chất cảm ứng sinh protease ( ghi ở mục 2.1.3) trong bình tam giác đặt ở nhiều vị trí khác nhau như : ở mặt đất, thân cây, cành cây tại RNM Cần Giờ Sau một tuần thu các bình tam giác lại để phân lập

Hình1.6 Bản đồ RNM Cần Giờ và địa điểm lấy mẫu

2.2.1.2 Phân lập NS theo phương pháp pha lỗng mẫu (theo F Uyenco (1988) [32], [37]

Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của NS [32], [43]

c Yêu cầu

Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết

2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch cĩ lớp dầu khống

a Nguyên tắc: Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của

2.2.1.4 Quan sát hình thái NS

* Quan sát đại thể NS

NS sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít BT của NS từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm trên chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2, 3 hộp Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch

- Nuôi cấy NS trong tủ ấm 3-7 ngày rồi quan sát.và mô tả các đặc điểm KL:

+ Hình dạng, kích thước KL

+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc

+ Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT

+ Đặc điểm của mép KL

+ Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5]

* Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J.T.Dunean )

Chuẩn bị MT thích hợp (YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2

Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước vô trùng

Đặt khối thạch lên phiến kính Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C

Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái NS Quan sát dưới vật kính 40, 100 và mô tả các đặc điểm:

+ Giá BTT, thể bình và cuống thể bình

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai

2.2.1.5 Hoạt tính enzym ngoại bào của NS [30]

a Nguyên tắc

Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzym của NS phân hủy

sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt quanh KL

b.Tiến hành

 Phương pháp cấy chấm điểm

Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT6, MT7, MT8, MT9, MT10

Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT ( 3 điểm/ hộp)

Ủ các hộp petri trên trong tủ ấm 300C trong 3-5 ngày

c Kiểm tra kết quả

Kiểm tra họat tính xellulase, amylase, kitinase Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:

- Nếu NS có hoạt tính xellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL do cellulose bị phân giải

Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt

- Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL Vùng tinh bột chưa bị

phân giải có màu xanh tím đậm

- Nếu NS có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giả có màu nâu đỏ nhạt

Kiểm tra hoạt tính protease : Dùng HgCl2 10% nhỏ lên bề mặt thạch Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2 Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2

protein bị kết tủa

d Đánh giá khả năng tạo enzym

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d)

(D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh

(D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu

2.2.1.6 Khả năng chịu mặn của NS [6]

a Nguyên tắc

Mỗi loài NS thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính protease khác nhau

b Tiến hành

Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%

Cấy 3 điểm các chủng NS nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối khác nhau

Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl

c Kết quả

Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng

Thử hoạt tính enzym ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 ứng với từng nồng độ muối

2.2.1.7 Khả năng phân giải dầu [21]

Cấy NS trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8 Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của NS, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải của NS

Sau khi nuôi cấy 15 ngày, tiến hành quan sát bình tam giác Nếu NS sinh trưởng được có nghĩa NS đó có khả năng phân giải dầu, ngược lại NS chết thì NS đó không có khả phân giải dầu 2.2.1.8 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh (Egorov và cộng sự, 1969) [19]

c Kiểm tra kết quả

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d)

(D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh

(D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Xác định hoạt độ protease [16]

Định nghĩa

Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35,5 0 C, pH 7.6)

Nguyên tắc:

Cho protease tác dụng với cơ chất là casein( hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt độ protease

Hóa chất:

Dung dịch Na2HPO41/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4 12H2O trong nước thành 250ml

Dung dịch KH2PO4 1/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml

Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177mldung dịch Na2HPO41/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng

Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm Sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml

Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml

Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml

Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 500ml

Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosine trong dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml

Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml

Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆ OD) theo lượng tyrosine ở các ống

Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu:

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1%(ml) 5 5

TCA 10%(ml) 0 5

K V X

.

.

m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g)

1UI (Anson) = 1 micromol tyrosine/ml/ phút

hoặc = 1 micromol tyrosine / g /phút

2.2.2.2 Phân loại NS bằng Di truyền phân tử

K V X UI HT

.

)

Thêm 500 µl Phenol Buffer và 500 µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC trong 15 phút

Sau đó cho thêm 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 10 phút

Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendoff mới Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol Giữ tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 – 2 giờ

Ly tâm 14.000 vòng / phút ở 4oC trong 15 phút Đổ bỏ dịch nổi

Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3 – 4 lần Ly tâm 14.000 vòng / phút trong 15 phút rồi đổ bỏ dịch nổi

Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10 – 15 phút

Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X Lấy 5 µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR

- Bước 1 ( biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao thường khoảng 950C, trong vòng 30 giây đến 1 phút

- Bước 2 (lai) : nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30 giây đến 1 phút

- Bước 3( tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài khoảng

30 giây đến 1 phút

 Giải trình tự gen

Nhằm xác định trình tự nucleotit dựa vào 2 phương pháp:

- Phương pháp hóa học: ( phương pháp Maxam và Gilbert) : dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotit

- Phương pháp enzym học ( phương pháp Sanger và phương pháp cải biên):

Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzym DNA polymerase Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotit cùng với các deoxynucleotit thông thường Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotit Phân tích kết quả: Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% hoặc điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer Sản phẩm PCR có độ dài là

260 bp

Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và tiến hành giải trình tự gen 28 S

rARN và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu

Hình sau đây minh họa kết quả Fungi PCR được điện di trên gel agarose 2%

2.2.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng NS

a Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ [18]

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của chủng NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 trong đó glucose lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon khác như: lactose, sucrose, maltose, sorbitol Trọng lượng các chất thay thế được lấy bằng lượng cacbon trong MT1 Mẫu đối chứng là MT1

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, chúng tôi dùng MT1, thay NaNO3 bằng các nguồn nitơ khác : bột đậu, cao thịt, casein, NH4NO3 với lượng tương tự Mẫu đối chứng là MT1

d= 11- 30 mm : mọc rất tốt

b Ảnh hưởng của pH [18]

Để xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của NS nghiên cứu, chúng tôi sử dụng MT1 và điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 7.0, 7.5, 8.0 Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm NS, nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng của chủng ứng với từng pH khác nhau

c Ảnh hưởng của nhiệt độ[18]

Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các chủng NS, nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C,

350C, 400C, 450C, 500C Khi NS đạt đến độ trưởng thành tiến hành đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng

1 2 3 4 5 6 7

MK

d Ảnh hưởng của thời gian [18]

Sử dụng MT1, cấy chấm điểm các giống NS nghiên cứu sau đó ủ trong tủ ấm ở các thời gian khác nhau: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ Đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng

2.2.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng NS [4][18]

a Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nhằm chọn MT thích hợp nuôi NS sinh protease, chúng tôi chọn các MT ký hiệu M1, M2, M3, M4, M5 để khảo sát quá trình nuôi cấy chủng NS

- Môi trường M1 (MT đối chứng) gồm: Cám : trấu : đậu nành

tỉ lệ :70 : 25 : 5%

- Môi trường M2 gồm: Cám : trấu : casein - tỉ lệ 70: 25: 5%

- Môi trường M3 gồm: Cám : trấu - tỉ lệ 70: 30%:

- Môi trường M4: cám : trấu : cao nấm men - tỉ lệ 70: 25: 5%

- MT5: Cám: trấu: cao thịt –tỉ lệ 70: 25: 5%

Độ ẩm các MT 60%, nhiệt độ 300C

Chủng NS được nuôi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng loại MT trên bằng phương pháp Anson

b Ảnh hưởng của thời gian

Để xác định thời gian thích hợp cho quá trình tổng hợp protease, tiến hành nuôi chủng NS trên

MT đã chọn trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60giờ, 72 giờ Sau đó, xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson

c Ảnh hưởng của pH

Để xác định pH thích hợp cho quá trình tổng hợp protease Chúng tôi nuôi chủng NS trên MT

đã chọn dùng HCL 5% hoặc NaOH 5%, điều chỉnh pH MT về các độ pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng pH bằng phương pháp Anson

d Ảnh hưởng của nhiệt độ

Để xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình tổng hợp protease Nuôi chủng NS trên MT đã chọn ở các nhiệt độ khác nhau: 200C , 250C, 300C, 350C, 400C, 450C khi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson

e Ảnh hưởng của độ mặn

Để xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease Chúng tôi nuôi chủng NS trên

MT đã chọn với các nồng độ muối khác nhau: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% 5%, 6%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson

f Ảnh hưởng của độ ẩm

Để xác định độ ẩm thích hợp cho quá trình tổng hợp protease Chúng tôi nuôi chủng NS trên

MT đã chọn điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ các dịch nuôi cấy bằng phương pháp Anson

2.2.3 Động thái quá trình tổng hợp protease

Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt lực của enzym protease

2.2.4 Khảo sát một số đặc tính của enzym thô thu được từ chuûng NS

a Tách và thu nhận protease

Tiến hành tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh

 Tác nhân tủa là aceton và ethanol 960

Nguyên tắc:

Dung môi hữu cơ bổ sung vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm protein mất nước và tạo tủa

Tiến hành:

Bước 1: Thu dịch enzym từ canh trường nuôi cấy NS giữ lạnh dịch enzym và dung môi hữu

cơ ( aceton, ethanol 960) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C Khảo sát với tỷ lệ

Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzym: cồn)

Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzym : aceton)

Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzym và khuấy đều, giữ ở

nhiệt độ lạnh 30 – 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ <

500C, bảo quản lạnh

 Tác nhân tủa là muối sulfate amon (NH4)2SO4

Nguyên tắc:

Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa

Tiến hành:

Bước 1: Thu dung dịch enzym từ dịch nuôi cấy

Bước 2: Tiến hành tủa: Cho muối vào dung dịch enzym tỉ lệ 1:3 rồi khuấy đều, giữ ở nhiệt độ

phòng 45 – 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa

Bước 3: Chế phẩm enzym thô thu được còn lẫn nhiều muối Thẩm tách qua màng thẩm tách

là phương pháp dùng để tách các phân tử muối ra khỏi protein Màng này chỉ cho các chất có phân

tử lượng nhỏ ( muối, đường ) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzym) Màng thẩm tách thường làm bằng collodion hay celophan

Bước 4: Sấy khô chế phẩm enzym ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh

Hiệu suất thu nhận H = m/v

Trong đó: m là khối lượng enzym thu được sau khi tủa

V là thể tích dung dịch có chứa enzym trước tủa tính bằng ml

b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzym

Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu,sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50 ,60, 70, 800C

c Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym

Dịch enzym thu được xử lí ở các nhiệt độ khác nhau 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100oC trong pH thích hợp Sau đó xác định hoạt độ Độ bền enzym được tính bằng số % hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, đối chứng là hoạt độ của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở nhiệt độ

4oC

d Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của enzym

Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng thời gian khác nhau:10’, 20’,30’, 40’, 50’, 60’, 70’, 80’, 90’, 100’

e Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzym

Tiến hành nuôi chủng NS trên MT tối ưu, sau đó thu enzym và đo hoạt độ theo phương pháp Anson ở các khoảng pH khác nhau: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0

2.2.5 So sánh hoạt độ protease của chủng A oryzae với chế phẩm protease trên thị

trường

Tiến hành khảo sát với 0,1g chế phẩm enzym protease của A oryzae và enzym protease ngoài

thị trường, mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất Đo hoạt độ enzym protease bằng phương pháp Anson trong cùng một điều kiện nhiêt độ, pH, thời gian phản ứng

2.3 Phương pháp toán học

Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản

- Phương pháp tính giá trị trung bình

 : Giá trị trung bình n lần thí nghiệm

tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía

Sn+2(X) là phương sai mẫu

Sn+2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2

a =  ± tα S + 2n (X)

√n

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ

Chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo hai cách: truyền thống và sử dụng MT có chất cảm ứng để phân lập NS Kết quả thu 333 chủng và được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1 Kết quả phân lập NS từ RNM Cần Giờ

Nguồn cơ chất Số lượng chủng NS Tỷ lệ %

NS sống trên lớp đất mặt, trên lá mục và trên thân mục nhiều hơn lớp đất sâu Điều này có thể giải thích vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc Hơn nữa, đây là những nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào nhất do xác lá, thân, cành cây, xác các động vật như tôm, cua, giáp xác,….đang bị phân hủy [22] Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả khi phân lập NS tại RNM như Mai Thị Hằng ( 2000), Khưu Phương Yến Anh (2007), Phan Thạnh Phương (2004) Võ Thị Bích

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)