Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học. Nó có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 8 - 2010 THƯ

VIỆN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn này

Tôi xin ghi nhớ công ơn tất cả Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh, và trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành công việc nghiên cứu thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khóa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luôn yêu thương và ủng hộ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010 NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu, kết quả trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Bình

MỞ ĐẦU

Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong công nghệ sinh học Nó

có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm tăng tốc độ đường hóa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chóng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm

Amylase thu nhận từ VSV nói chung, từ NS nói riêng có nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian thu enzym nhanh, giá thành rẻ, có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất enzym Do đó, trong vòng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ

NS đã dần thay thế enzym từ động vật Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus,

Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng NS sinh amylase cao luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luôn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt

Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ có môi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với điều kiện sống Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của vùng ven biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV

Hơn nữa, Việt Nam là nước có nguồn tinh bột và phụ phẩm nông nghiệp khá dồi dào là điều kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm

Có thể nói cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trò của chúng trong hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn enzym từ các NS, cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.

 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-amylase và glucoamylase cao từ RNM Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh

 Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được

- Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát

- Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn

- Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn

- Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase

- Thu nhận chế phẩm amylase thô và so sánh với enzym thương mại trên thị trường

- Khảo sát các đặc tính sinh học khác

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ

- Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý

Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ

 Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài

- Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010

- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP HỒ CHÍ MINH

1.1.1 Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản

RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn có vai trò và vị trí đặc biệt quan trọng đối với

MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu

Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa dạng sinh học cao [34], [39]

Hình 1.1 Rừng ngập mặn Cần Giờ

Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp Hồ Chí Minh Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông Cách trung tâm Tp Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đông sang Tây là 30 km [39]

Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 –

70C Khí hậu nóng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật gió mùa xích đạo Nhiệt độ không khí có ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 200C, và biên độ dao động theo mùa không quá 100C [36], [34], [39]

Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng Ở đây, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 1 đến tháng 4 Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm hàng năm Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa

khô là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4 Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/ ngày và 1204mm/tháng [34]

Ngoài ra, gió cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng tới độ thoát hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36]

Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá, quá trình nhiễm mặn đồng thời nó được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn

Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như gió mùa, thuỷ triều, mưa, nước dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ Độ mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%

Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các loài cây ngập mặn và phân bố của RNM Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước có độ mặn từ 25% đến 50% độ mặn nước biển Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thông qua quá trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36]

RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển Đông Mỗi tháng

có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39] Chế

độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng

so với vùng có nhật triều Các dòng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm

và SV dọc theo các vùng ven biển

1.1.2 Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ

RNM Cần Giờ có hệ SV vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài đem lại những giá trị kinh tế cao

Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 150 loài thực vật, các loài chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đôi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang, Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ôrô, dừa lá, ráng… Thảm cỏ

biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66]

Động vật: bao gồm động vật thủy sinh không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên

130 loài, 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách

đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ [66]

Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, các động vật có xương sống và hệ VSV

Vi sinh vật rất đa dạng gồm có: vi khuẩn, nấm, tảo

 Vi khuẩn

VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này Số lượng VK trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36]

 Nấm

Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975) Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai

MT trở lên [36]

Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidomycetes và Deuteromycetes Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R mangle) khi còn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium [36]

Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây

chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora Hầu hết các loài nấm trên đất liền

đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước

mặn Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36]

Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải cellulose, lignin Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập

mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium, Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và

cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác thực vật Chúng còn góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn Những loài này chịu được điều kiện mặn của RNM [36]

 Tảo

Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát

triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên Trong đó trên bề mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục Người ta liệt kê có khoảng 41

loài tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng không hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy thuộc vào độ ngập triều [36]

Tảo bùn có tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nó làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ quá trình quang hợp Tảo còn tạo ra độ thoáng khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm [36]

Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ

1.1.3 Vai trò của RNM đối với hệ sinh thái

RNM có liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần

xã cửa sông khác Dòng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dòng nước triều từ biển lên xuống các vùng cửa sông đều đi qua RNM Các dòng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong phú về thành phần SV cho nơi này [36]

Hệ thực vật RNM bao gồm các loài thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng nước mặn, hệ rễ của cây góp phần vào việc làm giảm tốc độ dòng chảy của thủy triều, tạo điều kiện lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng góp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đó, hệ thực vật còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34]

RNM còn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá, Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các loài cá sống ở cửa sông Khi so sánh thành phần các loài cá và tôm trong một vùng có RNM vào các mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các loài này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở ngoài đầm Từ đây cho thấy RNM là nơi nuôi dưỡng chính cho con non của nhiều loài hải sản [36]

Các loài động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau thông qua các quá trình trao đổi chất và đồng hóa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái này Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰ [36]

Tuy nhiên, hiện nay RNM đang có những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá, tôm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuôi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý không tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thoái và không thể tồn tại lâu bền

1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI

1.2.1 Đặc điểm sinh học của NS

NS là VSV có nhân chuẩn Hệ nấm có cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những ống dài phân nhánh hay không phân nhánh, có hay không có vách ngăn ngang (septum), đường kính

sợi từ 3-3,5 µm Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay còn gọi là khuẩn ty thể [58]

Cấu trúc sợi nấm gồm có thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân Thành tế bào NS chứa kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58]

Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm Khuẩn lạc NS thường có dạng hình tròn hoặc gần tròn

Bề mặt KL có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm không đều Mép KL trơn, răng cưa [60]

Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm Các đặc điểm hình thái khác có tính đặc trưng cho loài như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hòa tan [58],

Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, không có cơ quan tiêu hóa, không có khả năng quang hợp Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật

Hình1.2 Cấu trúc sợi nấm

NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính Bào tử vô tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đó bào tử trần là phổ biến nhất Trong sinh sản hữu tính, NS có các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59]

NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao Bên cạnh đó, từ NS còn có các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng dụng trong xử lý ô nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lòng đất [1], [57], [59]

 Khả năng sinh các enzym ngoại bào

NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym Hiện nay, từ NS người

ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đó có 10 enzym được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29]

 Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose

Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%),

hemi-cellulose và lignin (15-30%) Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…có khả năng

sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bón, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21]

 Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide

ngắn NS có khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp

thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease còn được sử dụng nhiều trong công nghiệp bột

giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp dược, công nghiệp thuộc da, công nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải [29]

 Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực

vật thành đường glucose Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase)

sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là những tác nhân không thể

thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng

dụng rộng rãi trong sản xuất sirô, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong công nghiệp dệt [21]

 Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi

mối liên kết β-1,4-glucoside Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tôm, cua, ốc rất nhiều Nhiều

loài NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… có khả năng sinh chitinase, giúp tăng

cường khả năng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và chống các loài côn trùng có vỏ kitin [21]

Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium còn có khả năng sinh các

enzym phân giải dầu góp phần xử lý ô nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM Cần Giờ [35]

 Khả năng sinh KS của NS

KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác

Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván Trong phẫu thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11]

Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS Những vấn đề về chất KS được sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [11]

Ngoài ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong công nghệ thực phẩm, công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học Axit hữu cơ sản xuất từ NS được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS

Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F monoforme và F oxysporum [29]

Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều loài NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học, Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc có thể gây ung

thư Ví dụ: A flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan Một số NS gây bệnh cho người và động

vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bông ở lúa…[6], [7]

1.2.2 Vị trí phân loại

Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 loài Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài Riêng các loài nấm thuộc lớp Nấm bất toàn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 loài thuộc

306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004) Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phương thức sinh sản [6]

Về phân loại nấm, hiện nay có hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là:

Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khóa phân loại được sử dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng

sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995) Trong luận văn này, chúng tôi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57]

Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới cho việc nghiên cứu phân loại học Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nói chung và NS sinh amylase ở RNM nói riêng

Hiện nay có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ; Jones, 1995), trong khi đó một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại Sự hiểu biết về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu hệ sinh thái này còn quá ít và chưa đầy đủ Có thể nói đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C V and Anuci, V, 1998) [43] Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950 Những năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM còn rất lẻ tẻ, nhưng sau này các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn thế giới trong đó có nấm biển ở RNM

Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hóa các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông 170 loài, Đài Loan 7 loài, Singapore 156 loài, Nhật 26 loài, Úc 67 loài, Mexico 94 loài, Đức 4 loài, Thái Lan 83 loài,…[49]

Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 loài vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina và Basidiomycotina

Năm 1987, Hype và cộng sự công bố phát hiện được 89 loài nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48]

Năm 1988, Agate A D., Subramania C V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong

đó có sự phân loại, hệ thống hóa cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới [43]

Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới Trong đó bao gồm 87 loài

thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes

Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các loài nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục

ở RNM, có khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đó

Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đóng vai trò quan trọng đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM

Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ có một thông báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên cứu khả năng diệt côn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình [52]

Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đó Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ

khác nhau Đó là các loài NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh [69].

Theo nhóm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hoàng Trí, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông

ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm

trong sạch nước biển Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho

MT vùng ven biển” [69]

Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus

phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8]

Đến năm 2007 mới có tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng

sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1]

Năm 2009, có tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số

chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41]

Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta còn nghiên cứu các đặc tính

sinh học của chủng này Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus Một

số loài của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits,

Butova 1965, Fennkxova Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951 Corman Lanalu-ke, 1948) [17]

Một số công trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới glucose [17]

Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính

chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A cacbonarius

Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình “Nghiên cứu

về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa

việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15]

Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A niger Năm 1977, tác giả L V Chứ, Đ T T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với đối tượng A awamorii

Đến năm 1984, N B Ngà và N L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A oryzae, A niger, A awamorii có hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột

sắn

Năm 1993, có công trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp niger TH3 – 19K của Nhật

Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D V Hợp và cộng

sự

Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu

nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2]

Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII,

BioIII… có dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào

thức ăn cho cá, heo, bò Chế phẩm có tác dụng phòng chống chứng rối loại tiêu hóa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57]

Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng có những khảo sát về khả năng sinh enzym amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10]

Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15]

Có thể nói những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, còn những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn còn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm năng

1.3 TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE

1.3.1 Tinh bột

Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin [5]

 Thành phần cấu trúc của amylose

Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết α−1,4 glicozit

Hình1.6 – Phân tử Amilose

 Thành phần cấu trúc của amilopectin

Amilopectin là polyme có mạch nhánh, ngoài mạch chính có liên kết α-1,4 glucozit còn có nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit

Cấu tạo của amilopectin còn lớn và dị thể hơn amilose nhiều Trong tinh bột tỉ lệ amiloza/amilopectin khoảng ¼ Tỉ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm sóc

glycogen Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31], [44]

Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là:

1.3.2.1 α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase

Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose Còn amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21]

α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp không tạo màu với iod Chúng có ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV

α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu loãng Tất cả các α – amylase đều chứa

từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol Nếu tách hoàn toàn Ca

khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia

hình thành và ổn định enzym Ca còn tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực

lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21]

α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường không giống nhau

+ pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy

mầm và thóc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6 pH tối thích của α – amylase từ A oryzae là

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

* Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hóa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17] Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

1.3.2.2 β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase

α-amylase

Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch Chỉ phổ biến ở thực vật, nhiều ở hạt nảy mầm Vi khuẩn không có enzym này, còn NS chưa được chứng minh hoàn toàn

về sự hiện diện của enzym này [5], [21]

β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 700C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt

độ tối thích là 60 – 650C Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4 Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt

tính khi không có canxi

Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như không tác dụng

lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose [26]

1.3.2.3 Glucoamylase hay amyloglucozidaza, còn gọi là γ-amylae

Đây là enzym đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44]

Trong số các VSV có khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus

là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger

Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0 Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH

kiềm Ví dụ glucoamylase của loài Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44]

Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 600C Tuy nhiên, cũng có trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 700C, ví dụ như glucoamylase của loài C thermosaccharolytium

Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích

sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29]

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS

a Giống nấm sợi

Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và hàm lượng amylase Không phải tất cả các chủng nấm đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng loài cũng rất khác nhau về lượng enzym

do chúng sản sinh ra Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS có khả năng tạo nhiều amylase là điều vô cùng quan

trọng [26], [31]

Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS có khả năng sinh amylase cao, cần

phải đồng thời tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất Sau đó, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để giữ được hoạt tính ban đầu

b Nguồn dinh dưỡng

Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym của NS Vì vậy, trong MT nuôi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất

dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]

 Nguồn dinh dưỡng cacbon

Trong MT nuôi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải có nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và nguồn cacbon NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau Nguồn cacbonhydrat

dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26]

Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzym riêng biệt của hệ amylase Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột, còn với glucoamylase là 2% [26]

Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác Trong đó cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [26]

 Nguồn dinh dưỡng nitơ

Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuôi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vô cơ chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% có hiệu quả cao hơn các loại muối khác Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên

liệu giàu đạm như: cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô dầu,…[21], [26]

Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT có thể kích thích tổng hợp

amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức

chế tổng hợp α-amylase

Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT có ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase Chỉ khi nào trong MT có đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn Trong MT Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO3 là 18:1 [21]

 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Cu…có vai trò quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym, điều hòa các chất trong tế bào…[26]

Một số chất khoáng có vai trò rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như: Canxi là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nó cần cho quá trình tổng hợp và

ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05%

Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT có nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21]

c Điều kiện nuôi cấy

Ngoài các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuôi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-320C Chu kỳ sinh trưởng của

NS có thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt

độ cần ở 23-300C Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hô hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phóng ở 28-290C Và ở thời kì

sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-290C [26]

- Ảnh hưởng của độ ẩm

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng 70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thoáng khí của MT, còn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV

- Ảnh hưởng của pH

Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà

còn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp Ví dụ, A oryzae khi MT có pH=6,5 thì ưu thế

tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5

- Ảnh hưởng của độ mặn

Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngoài tác dụng cung cấp nguồn ion Cl- còn có tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho việc tiết các chất ra MT [26]

Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều có khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5% (Mai Thị Hằng, 2001) Một số chủng có nguồn gốc tại RNM là có khả năng chịu mặn thì sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 10% Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS có thể sống được nhưng mọc rất yếu [12]

- Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym Trong quá trình nuôi cấy NS,

sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử Thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong khoảng từ 40 đến 50 giờ [21]

1.3.4 Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận amylase

 Phương pháp nuôi cấy chìm – MT nuôi dạng lỏng

NS được nuôi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột có bổ sung nguồn nitơ vô cơ (NaNO3) Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô,… Phương pháp này đòi hỏi phải có cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ôxy cho NS phát triển Để thu nhận enzym, dịch enzym được cô đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28] Phương pháp này có ưu điểm:

-NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp xúc với dịch dinh dưỡng

- Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa và tự động hóa

Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau:

- Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Trong quá trình nuôi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục

- Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

- Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất

cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa

 Phương pháp nuôi cấy bề mặt – MT bán rắn

Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT Nguyên liệu chính thường

là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thoáng khí MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60% Hấp thanh trùng ở 1-1,5

atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào MT đã cấy giống được tãi lên các khay sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuôi ở các điều kiện thích hợp Sau khoảng thời gian nuôi cấy, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ Đây chính là chế phẩm enzym dạng thô [26]

Phương pháp này có nhược điểm là:

- Tốn diện tích mặt bằng

- Khó cơ khí hóa và đặc biệt là khó tự động hóa được toàn bộ quá trình

- Chi phí nhân công, điện nước cho một đơn vị sản phẩm cao

Trong hai phương pháp trên, thì nuôi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì

NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đó nuôi trên MT này thì độ thoáng khí cao Nồng độ enzym tạo thành cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm MT không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính enzym Là phương pháp sử dụng trong điều kiện không cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị [28]

 Phương pháp thu nhận amylase

- Từ phương pháp nuôi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn không tan

còn khoảng 1-3% chất khô hòa tan, trong đó có enzym Thu dịch lọc, sau đó cô đặc cho giảm thể tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân không ở 25 – 300C, rồi tiến hành tách enzym

- Từ môi trường nuôi cấy bề mặt: Chế phẩm enzym thô được bổ sung lượng nước gấp 4 – 5

lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-120C Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong

Dịch chiết được cô đặc chân không tới 50-55% chất khô hòa tan, dịch đậm đặc này có thể bảo quản lâu dài mà không mất hoạt lực và rất dễ hòa tan

- Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ

từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh Sau 15 –

24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa Sấy khô nhẹ ở nhiệt

độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26]

1.3.4 Ứng dụng của enzym amylase

Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng trong nhiều lãnh vực khác nhau [29]

a Trong công nghệ rượu, cồn, bia

Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ NS A oryzae hay A awamori, B subtilis để thay thế malt trong việc đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ

nguyên liệu có chứa tinh bột Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình

đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm Người Trung Quốc thì

đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31]

Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang

mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29]

b Sản xuất bánh mì

Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp Nhiệt độ vô hoạt α-amylase của NS tương đối cao (700C) nên có thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà không có hiện tượng dextrin hóa khi nướng Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên có thể đạt đến độ đường hóa cần thiết rất nhanh chóng, sau đó bị vô hoạt ngay Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường

là một phức hệ enzym, trong đó protease có thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29]

c Công nghiệp dệt

Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trong vải thô thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác Để làm vải mềm, có khả năng nhúng nước, tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc) khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 900C Phương pháp này không làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh

Ngoài ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp [29]

d Trong sản xuất thức ăn gia súc

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành phần tinh bột rất cao Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử

dụng chế phẩm amylase của A oryzae, A owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của

động vật, nhất là động vật

non làm tăng khả năng đồng hóa dẫn đến tăng trọng nhanh [31]

e Nghiên cứu sinh học, y học

Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng

của amylase Chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao

Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng chuyển hóa chất, bệnh về tiêu hóa, tim, thần kinh,…

Ngoài ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuôi VSV phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31]

 Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam

Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21]

STT Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất

1 α-amylase vi khuẩn

Tenase Optiamyl BAN

Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk

2 α-amylase vi khuẩn

chịu nhiệt

Termamyl Opti-therm Maxamyl

Novo-nordisk Miles Kali-chemie Gist-brocades

3 Amyloglucosidase

Diazym AMG Spezym

Miles lab Novo-nordisk Fiun Biochemical

4 β-amylase Dextrozym (chứaAMG)

Promozym

Novo-nordisk Novo-nordisk

5

Biozym MKC Fugal amylase Fungamyl clarase

Amano Novo-nordisk Miles lab

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

- Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ

- Các VSV kiểm định: E coli, B subtilis từ viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh

- Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh

- Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trấu, bột ngô, đậu tương mua từ chợ Tân

Bình

 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

* MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: dùng để phân lập NS [9], [22], [43]

NaNO3 3.5g; KH2PO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.01g (vết); glucose

20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT

*MT2 - MT cao nấm men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Dùng để nuôi cấy và giữ giống NS [15] , [54]

Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 – 6.0; khử trùng 1atm/

30 phút

*MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54]

Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 – 6; khử trùng 1amt/30 phút

*MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh amylase[11], [13], [21]

NaNO3 3.5g; K2HPO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.1g (vết); tinh bột tan

10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút

*MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC

*MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26]: Tương tự MT4 nhưng không sử dụng NaNO3

và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein

*MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g

tinh bột tan bằng 10g chitin

Pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cất 1000ml; pH = 7.5; khử trùng 1atm/ 30

phút

*MT10 – MT thử khả năng phân giải dầu [1],[11], [35]:

KH2PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3g; Na2HPO4 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử trùng 1atm/ 30 phút

 Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase

*MT11 [1], [11], [26]: Cám mì 65g; trấu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO3 2g; MgSO4 0,05g;

KH2PO4 0,2g; KCl 0,05g; urê 0,2g; độ ẩm 50 - 60%, pH = 5 – 6, khử trùng 1atm/ 30 phút

*MT12 [21], [26]: Trấu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH4)2HPO4 0,1g; ure 0,2g; CaCl20,1g; KCl 0,05g; HCl 0,05g; độ ẩm 50 – 60%; khử trùng 1atm/45 phút

*MT13 [21], [26]: 90% bã khoai mì; 10% trấu, bổ sung dung dịch khoáng (KH2PO4 0,1%;

NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút

*MT14 [15]: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH 5-5,5; khử trùng

- Cồn, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl,

- Glucose, cao nấm men, nước chiết khoai tây, tinh bột tan, agar, peptone,

cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl2, Dinitrosalysilic, lactophenol…

kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ ẩm Startorius (Đức),

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ (Theo A D Agate, 1988) [42]

Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thôn Hiệp, xã

An Thới Đông, xã Long Hòa…Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 290C; pH 7,02

Lấy các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất

Cách lấy: Dùng dao, kéo vô trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lông vô trùng buộc kín,

đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 24 giờ [43]

2.3.2 Phương pháp vi sinh

2.3.2.1 Phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu (F Uyenco, 1988)

* Lấy mẫu và pha loãng

Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vô trùng Sau

đó dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngoài Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1

Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2

Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4…

* Cấy mẫu

Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nông độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch Sau đó sử dụng que trang đó trang tiếp hai đĩa tiếp theo

Hình 2.1 Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và các vị trí lấy mẫu

* Ủ mẫu

Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày Chọn khuẩn lạc riêng

rẽ cấy chuyền vào ống thạch nghiêng

* Làm thuần

Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước cất, trải

đều trên mặt đĩa lần 2 Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển

vi đều có 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết

Sau đó chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

2.3.2.2 Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khoáng (Lumiere và Chevrotier – 1914)

Chuẩn bị ống giống đã nuôi ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp Dầu khoáng chứa trong ống eppendorf hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khô ở 1700C trong 1-2 giờ, để nguội Dùng que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khoáng vô trùng Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 40C

Phương pháp này có thể bảo quản trong 1-3 năm

2.3.2.3 Quan sát đại thể NS [6], [7]

NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm Lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm

vào mặt thạch ở giữa hộp petri Làm 2-3 hộp

- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL Hàng ngày lấy ra quan sát

- Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

+ Hình thái, kích thước KL + Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra

+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt Kl……

2.3.2.4 Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8]

- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri

- Dùng khoan nút chai vô trùng có d = 8mm, khoan các khối thạch

- Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông thấm nước, nước cất vô

- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mô tả các đặc điểm

+ Hình dạng cuống sinh bào tử

+ Hình dạng thể bình

+ Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn

+ Đặc điểm bào từ đính, màu sắc, kích thước bào tử…

2.3.2.5 Định danh NS bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR).[40]

 Nguyên tắc:

Dùng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn ADN dài 260 bps có chứa các trình tự đặc hiệu giống Các phân đoạn ADN sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2% Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS [40]

 Các bước tiến hành:

- Nuôi cấy chủng NS trong ống nghiệm từ 2-3 ngày rồi lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo

cho vào một tube eppendorf

- Cho thêm 180µl TE1X và 20µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm

- Thêm 500µl Phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 1000C trong

- Ly tâm 14,000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Đổ bỏ dịch nổi

- Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500µl Ethanol 70% vào, úp ngừa tube 3-4 lần

- Ly tâm 14,000 vòng/phút trong 15 phút Đổ bỏ dịch nổi

- Làm khô cặn DNA ở 560C trong 10 – 15 phút

- Hòa tan cặn DNA trong 50µl TE1X Lấy 5µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR nấm

- Lấy 5µl DNA của NS sau khi ly trích của vào PCR mix

-Tiến hành điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer Sản phẩm PCR có độ dài 260 bps

- Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA

và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và loài của chủng nghiên cứu [40]

2.3.2.6 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào: bằng khuyếch tán trên MT thạch (William, 1983)

 Nguyên tắc:

Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu

mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc

 Cách tiến hành:

Dùng MT định tính đo khả năng phân giải các hệ enzym

+ Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính

enzyme tương ứng (MT4, MT5, MT6, MT7, MT8) cấy chấm điểm (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28-30oC, 3-4 ngày

+Phương pháp đục lỗ trên thạch:

- Thu dịch nuôi cấy NS: dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng que cấy NS vào bình tam giác chứa 50ml MT lỏng vô trùng Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), 4 ngày, 25-28oC

- Ly tâm dịch nuôi cấy 3000 tốc độ vòng/phút trong 20 phút

- Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng là dịch

enzym thô, bổ sung 0,04% NaNO3 để khử trùng; có thể giữ dịch ly tâm 1 tháng

- Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulose, kitinase; dung dịch 10% HgCl2 cho protease, nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo

KL

 Kiểm tra kết quả

- Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase:

+ Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm

+ Nếu NS có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt

+ Nếu NS có hoạt tính kitinase sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa

dịch enzym Vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt

- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch Nếu NS có hoạt tính protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym Vùng chứa protein chưa

bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa

 Đánh giá kết quả

- Đặt sấp hộp petri Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d = 8mm)

- Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS

Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzym mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzym khá mạnh; D-d ≥

15 mm: hoạt tính enzym trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzym

 Cách tiến hành (Phương pháp khối thạch) :

+ Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất)

-Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm) Trong đó D: đường kính vòng phân

giải, d: đường kính KL (lỗ thạch)

- Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính KS rất mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính KS mạnh; D-d ≥ 15

mm : hoạt tính KS trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính KS yếu

2.3.2.8 Khảo sát khả năng phân giải dầu

 Cách tiến hành:

Cấy NS trong bình tam giác 250ml chứa 50ml dầu khoáng (MT10) Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi để đánh giá khả năng phân giải dầu của NS [35]

 Cách đo sinh khối NS:

- Cấy bào tử NS vào bình tam giác

- Sau 15 ngày nuôi cấy, lọc lấy sinh khối NS và đem sấy khô ở 1050C

- Cân trọng lượng của tờ giấy thấm, sau đó cân sinh khối NS trên tờ giấy Lấy kết quả sau trừ kết quả trước ta thu được kết quả sinh khối NS [32]

2.3.2.9 Phương pháp nuôi cấy NS trên MT lên men bán rắn (MT11)

 Mục đích: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu

 Cách tiến hành:

- Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng 1atm/ 30 phút

- Cho 10ml nước cất vô trùng vào mỗi ống nghiệm nuôi NS Dùng que cấy cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, lắc đều cho bào tử ở dạng huyền phù

- Lấy 3ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT) cho vào MT xốp đã chuẩn bị Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

2.3.3 Phương pháp hóa sinh

2.3.3.1 Phương pháp tách chiết dịch amylase thô từ canh trường nuôi cấy

 Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong nước của amylase, dùng nước cất vô trùng hòa

tan tạo dịch enzym amylase thô

 Cách tiến hành:

Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác chứa MT xốp đang nuôi NS Lắc đều, giữ ở nhiệt độ

3 – 40C trong 30 - 45 phút để enzym khuếch tán Sau đó, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc 5000vòng/ 15phút Thu dịch ly tâm, định mức 100ml Ta thu được enzym thô và đem xác định hoạt

độ amylase

2.3.3.2 Phương pháp thu enzym bán tinh khiết

Chế phẩm enzym thô được nuôi cấy theo phương pháp bề mặt được giã bằng cối, chày sứ với

sự trợ giúp của cát thạch anh hay bột thủy tinh Sau đó, bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan enzym Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 40C

Dùng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch lọc enzym Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh

Sau 15 – 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa Sấy khô nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết

2.3.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ α - amylase (Phương pháp Henkeil, 1956)

 Nguyên tắc:

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iod Đơn vị hoạt độ của enzym là lượng enzym có khả năng thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30oC, pH = 6,0

 Hóa chất:

+ Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl vào nước thành 100ml

+ Dung dịch iod: hòa tan 1g iod vào 5ml dung dịch chứa 2g KI thêm nước cất đến 100ml Khi dùng pha loãng dung dịch này 500 lần

 Đường chuẩn tinh bột:

Từ dung dịch tinh bột 1,0%, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tinh bột có nồng độ 0 – 10mg/ml Xây dựng đường chuẩn tinh bột (mg/l)

Nồng độ tinh bột (mg/l) 0 2 4 6 8 10 Dung dịch tinh bột (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0

- Vẽ đồ thị sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ tinh bột (mg/ml) ở bước sóng 560nm

- Tính kết quả:

Hoạt độ (UI/g) = Trong đó

X: số mg tinh bột bị thủy phân (mg/ml) n: độ pha loãng

V: thể tích enzym ban đầu (ml) 10: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) M: khối lượng canh trường (g)

2.3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller)

 Nguyên tắc:

Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

 Hóa chất:

Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất

và 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml

Dung dịch glucose mẫu (500μg/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít

 Cách tiến hành:

Lấy 3 ống nghiệm, dùng pipet cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%, thêm vào 0,5ml nước cất rồi đặt vào nồi cách thủy (t=300C) Sau 10 phút ta cho vào mỗi ống 0,5ml dịch chiết enzym (đã pha loãng 100 lần), khuấy nhẹ và giữ ở 300C trong 30 phút Tiếp theo, lấy ngay ống nghiệm ra và cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml dung dịch HCl 1N để ngừng hoạt động của enzym

Bảng xác định hoạt độ đường khử

Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose + Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn

Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng

 Tính kết quả:

Hoạt độ (UI/g) = Trong đó

X: số mg glucose (µg/ml) n: độ pha loãng

V: thể tích enzym ban đầu (ml) 3,5: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) M: khối lượng canh trường (g)

2.3.3.5 Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ amylase của

- Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri Quan sát sự

phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày Đo đường kính mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng của KL các chủng NS

- Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuôi trong tủ ấm ở các

thời gian khác nhau: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ Sau đó tiến hành thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định thời gian sinh enzym tối ưu của từng chủng

b Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa

Để các đĩa petri trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C Ủ sau 3 ngày thì đo đường kính khuẩn lạc d (mm)

- Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuôi trong các điều kiện

nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C Ủ trong tủ ấm theo thời gian đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định nhiệt độ sinh enzym tối ưu của từng chủng

c Ảnh hưởng của pH

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay

HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8 Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri Sau đó, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm) Mẫu đối chứng là có pH 6,5

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl

10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8 Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định pH sinh enzym tối ưu của từng chủng Mẫu đối chứng là có pH 6,5

d Ảnh hưởng của độ ẩm

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được

độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70% Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm)

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các lượng nước biển khác nhau

để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70% Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo

OD xác định độ ẩm sinh enzym tối ưu của từng chủng

e Ảnh hưởng của độ mặn

- Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT2 không dùng nước biển, bổ sung các nồng độ muối khác

nhau: 1, 3, 5, 10, 20% Thanh trùng MT đổ đĩa petri, rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên

MT với các nồng độ muối Ủ ấm 3 ngày

Đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0%

Quy ước: d = 0 mm : Không mọc, d = 1÷ 2 mm: Mọc yếu, d = 2,1 ÷ 5 mm: Mọc trung bình, d = 5,1 ÷ 10 mm: Mọc tốt, d = 11 ÷ 30 mm: Mọc rất tốt

- Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1,

3, 5, 10, 20% Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH, độ ẩm đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ mặn sinh enzym tối ưu của từng

chủng Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0%

2.3.4 Phương pháp toán học

- Các kết quả thu được là trung bình của ba lần lặp lại thí nghiệm

Phương pháp tính giá trị trung bình

Trong đó : : Giá trị trung bình kết quả n lần thí nghiệm

: Giá trị lần thí nghiệm thứ i

n : Số lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính khoảng ước lượng :

Trong đó : tra bảng phân phối Student với n-1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng 2 phía

Là phương sai mẫu

- Số liệu được xử lý bằng các hàm Avegare (Giá trị trung bình), Stud (Phương sai), Var (Sai số) trong excel

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh amylase từ RNM Cần Giờ

3.1.1 Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ

Tiến hành lấy mẫu từ lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục, đất mặt và đất sâu 5-10 cm, chúng tôi đã phân lập được 409 chủng NS khác nhau (xem phụ lục1) và trình bày tóm tắt trong bảng 3.1 dưới đây

(Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 1)

Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy, hệ NS ở RNM Cần Giờ vô cùng phong phú Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, cành, trên đất và có cả trong đất sâu 5-10 cm

Các chủng NS phân lập tập trung nhiều trên nguồn cơ chất lá (152/409 chủng) chiếm 37,2% tổng số chủng NS phân lập được, còn ở cành là (140/409 chủng) chiếm 34,2%, trên đất là (117/409 chủng) chiếm 28,6% Kết quả này cho thấy, có lẽ hầu hết các chủng NS ở RNM là các chủng du nhập từ đất liền (Nguyễn Hoàng Trí, 1999) Còn các loài nấm biển chủ yếu có trên rễ cây hoặc phần

gỗ ngâm

trong nước mặn Đây là những nấm góp phần phân hủy xác thực vật ở RNM Cần Giờ [36]

Đặc biệt, trên cơ chất lá mục, thân cành mục số lượng NS nhiều hơn, vì đây là những nguồn

hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ

nhất Kết quả này thống nhất với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khảo sát sự phân bố của các chủng NS

Ngoài ra, trên lớp đất mặt số chủng NS chiếm (15,6%) nhiều hơn lớp đất sâu (13%) vì NS là VSV hiếu khí mà lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào (xác lá, cành, động vật,

STT Kí hiệu

chủng

D-d (mm)

Từ các chủng phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng NS dựa trên khả năng sinh amylase của chúng

3.1.2 Tuyển chọn những chủng NS có khả năng sinh amylase

+ Chủng sinh enzym mạnh : 0/261 chiếm 0%

+ Chủng sinh enzym khá mạnh : 3/261 chiếm 1,15%

+ Chủng sinh enzym trung bình : 43/ 261 chiếm 16,48%

+ Chủng sinh enzym yếu : 156/261 chiếm 59,77%

Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập