Nghiên cứu khả năng phân giải Cacbuahydro cùa một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

Hệ sinh thái RNM là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm. Do đặc trưng của vùng đất không ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, nên vi sinh vật ở đây có nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với môi trường. Nhiều tài liệu đã nghiên cứu về hệ động-thực vật ở hệ sinh thái này. Nhưng ít tài liệu nghiên cứu về VSV phân hủy-một mắt xích quan trọng trong chu trình sinh thái, trong đó có nấm sợi phân giải cacbuahydro.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

PHẠM THỊ THANH THÚY

Chuyên ngành : Vi sinh vật

Mã ngành : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS TRẦN THANH THỦY

TS VÕ THỊ HẠNH

Thành phố Hồ Chí Minh- 2007

Lời cảm ơn

Luận văn này được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ và góp ý chân thành của quí thầy cô và bạn bè khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thuỷ, TS

Võ Thị Hạnh - Người đã trực tiếp định hướng và hướng dẫn giúp tôi hoàn

thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Dương Thị Bạch Tuyết, TS Trần Thị Thanh cùng toàn thể các thầy cô tổ Vi sinh- Sinh hoá, khoa Sinh Trường ĐHSP TP Hồ Chí Minh hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn đến Sở Giáo dục và Đào tạo Bình Dương, trường THPT Phước Vĩnh đã động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Cuối cùng, tôi xin gởi đến gia đình, các bạn cùng khoá - Những người luôn bên tôi khi thực hiện luận văn này

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2007

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ được đánh giá là nơi có giá trị kinh tế

và độ đa dạng sinh học cao trong khu vực đông nam Á Bao gồm hệ sinh thái đất liền và vùng ven biển Áp lực từ những hoạt động kinh tế, do phải đáp ứng nhu cầu phát triển của đất nước trong những năm gần đây, dẫn đến tình trạng

ô nhiễm môi trường trầm trọng Đặc biệt là môi trường ven bờ [45]

Hệ sinh thái RNM là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm Do đặc trưng của vùng đất không ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, nên vi sinh vật ở đây có nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với môi trường Nhiều tài liệu đã nghiên cứu về hệ động-thực vật ở hệ sinh thái này Nhưng ít tài liệu nghiên cứu về VSV phân hủy-một mắt xích quan trọng trong chu trình sinh thái, trong đó có nấm sợi phân giải cacbuahydro

Ngày nay cùng với sự gia nhập vào WTO, sự phát triển và hội nhập của nền kinh tế đất nước với thế giới Các ngành đặc biệt là ngành khai thác, chế biến dầu khí, vận tải biển làm nguy cơ ô nhiễm MT do sự cố tràn dầu gây ra càng lớn Ngành công nghiệp dầu mỏ đã và đang đem lại nguồn lợi lớn cho các quốc gia có tài nguyên này Tuy nhiên, nó cũng đưa vào môi trường một lượng cacbuahydro khó phân hủy.Đặc biệt là môi trường biển và khu vực gần

bờ ở mức độ khác nhau Do rửa tàu chở dầu, khai thác, vận chuyển gây sự cố tràn dầu làm nguy hại đến thực vật, động vật và cả con người Thành phần dầu chủ yếu làm ô nhiễm môi trường là cacbuahydro no, cacbuahydro thơm đơn nhân, đa nhân Nhiều công trình nghiên cứu nhằm xử lí ô nhiễm nguồn nước do dầu với các biện pháp như: gạn vớt cơ học, lí học, hoá học nhìn chung không mang lại hiệu quả cao và an toàn cho môi trường Ngay cả thiết

bị tách dầu tốt nhất cũng còn khoảng một vài mg/lit Vì vậy, sau khi xử lí

bằng phương pháp trên vẫn còn 1 lượng dầu nhỏ trên mặt biển Hơn nữa, khi lượng dầu tràn bị sóng đánh vào bờ, nhanh chóng thấm vào đất liền dẫn đến suy thoái vùng sinh thái nơi này [42], [47]

Sử dụng VSV phân giải dầu là biện pháp hiện nay đang được thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng quan tâm để loại bỏ phần dầu còn sót lại ảnh hưởng đến vùng ven bờ [43] Biện pháp này với tính ưu việt của nó là xử lí triệt để lượng dầu mà không gây ô nhiễm môi trường, ngay ở cả môi trường nước, cát, đá Đồng thời, trong quá trình phân giải dầu các VSV này tạo sinh khối, cung cấp dinh dưỡng cho chu trình trong hệ sinh thái Nhiều công trình nghiên cứu về VSV phân giải dầu ở các khu vực có nhiễm dầu khác nhau [1],[17],[20],[21],[23],[24],[26], nhưng về VSV có khả năng phân giải dầu của hệ VSV ở RNM còn ít đề tài quan tâm, đặc biệt là nấm sợi Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng nấm sợi thích hợp trong khu hệ VSV đa dạng tự nhiên RNM, tiềm năng ứng dụng của chúng trong công nghệ sinh học làm sạch môi

trường là cần thiết Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng phân huỷ các hợp chất cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”

2 Mục đích nghiên cứu

Tìm hiểu khả năng phân giải cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ

3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM Cần Giờ có khả năng phân giải hợp chất cacbuahydro

4 Phạm vi nghiên cứu

Đất, lá cây, thân cây là nguôn phân lập nấm sợi ở RNM thuộc bảy xã:

An Thới Đông, Bình khánh, Cần Thạnh, Lý Nhơn, Long Hoà, Tam Thôn Hiệp, Thạnh An của huyện Cần Giờ

5 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập nấm sợi từ đất, lá cây, thân cây ở một số khu vực RNM Cần Giờ

- Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng phân giải cacbuahydro cao

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại các chủng được tuyển chọn Định danh đến loài

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi tuyển chọn

7 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường ĐHSP TP Hồ Chí Minh và PTN viện Sinh học Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh

8 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 04 năm 2006 đến tháng 08 năm 2007

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm khu bảo tồn sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ

Rừng ngập mặn (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài thực vật hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng-ẩm Theo đánh giá của GS Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000

ha Trong đó, khu vực châu Á có diện tích lớn nhất Theo thống kê ban đầu của FAO, diện tích RNM ở Việt Nam khoảng 320.000 ha chiếm một phần khá lớn so với các nước trong khu vực [3]

Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển RNM thế giới đầu tiên ở Việt Nam được UNESCO công nhận vào 21/01/2000 Nằm ở phía đông nam Thành phố

Hồ Chí Minh ở vĩ tuyến 10o22’14” đến 10o40’09”, kinh tuyến 106o46’12” đến

107o00’59” Diện tích khoảng 75.750 ha với diện tích rừng là 38.664 ha trên nền đất phù sa chủ yếu do sông bồi đắp[3],[42]

RNM Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn

và Đồng Nai mang đến, lắng đọng thành nền đất Theo thuyết khô hạn sinh lý học của Schimper thì đây là yếu tố chính hình thành RNM Đất RNM được tạo bởi quá trình trầm tích sét, phèn hoá và nhiễm mặn: Lớp đất sâu chưa ổn định, đất chứa nhiều muối Bốn loại đất chính: Đất mặn, đất mặn- phèn ít, đất mặn-phèn nhiều, đất cát mịn có pha một ít bùn ven biển; nhưng diện tích đất mặn chiếm ưu thế Đất RNM có nồng độ muối cao, vào mùa nắng 4‰ - 18‰, còn mùa mưa độ mặn cao hơn từ 24‰- 30‰, độ pH trung bình khoảng 6.8- 7.2, nhiệt độ trung bình 26oC – 29oC, độ ẩm 74% - 83% Cũng giống như các RNM khác, đất RNM Cần Giờ có độ ẩm cao Nhờ sự vào ra của thuỷ triều và được che phủ bởi các tán lá cây ngập mặn nên đất ở đây hiếm khi trải qua thời

kì khô hạn kéo dài Khí hậu RNM Cần Giờ mang đặc tính nóng ẩm, chịu chi

phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với 2 mùa mưa nắng rõ rệt Có chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày [3], [44], [45]

Hệ sinh thái ở RNM cũng mang các nét đặc trưng của các hệ sinh thái khác: Dòng năng lượng, chuỗi thức ăn, đặc trưng phân hoá theo không gian

và thời gian, vòng tuần hoàn vật chất Trong hệ sinh thái này, thực vật chủ yếu là các loại như: Mắm, Sú, Bần, Đước, Trang, Dừa nước, Đưng, Dà … có

157 loài thực vật thuộc 76 họ Sinh vật tiêu thụ gồm: 63 loài phiêu sinh vật,

130 loài tảo thuộc 3 ngành: Tảo Khuê, Tảo Giáp, Tảo Lam 100 loài động vật đáy như: Tôm, cua, sò, ốc Ngoài ra, còn có 120 loài cá trong đó có các loài

có giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chếm 31 loài bò sát như: Cá Sấu Hoa cà, trăn, rắn, kì đà nước 19 loài hữu nhũ như: khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim như: Ác là, Bồ Nông chân xám [44] Vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn là các tác nhân quan trọng trong quá trình phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các loài sinh vật khác trong hệ sinh thái RNM Các VSV này có thể sống hoại sinh trong đất, lá mục, thân mục, một số sống kí sinh hoặc cộng sinh trong cây hay côn trùng Phức hợp quần xã VSV phân giải protein, xenlulose, cacbuahydro, kitin… cung cấp mạnh vật chất và năng lượng cho chu trình tuần hoàn trong suốt cả hai pha của chu kì thủy triều Hệ sinh thái RNM nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần cacbon phức tạp do thuỷ triều đưa vào VSV đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất độc có tính bền vững cao, trong

đó có dầu Với dầu, VSV không chỉ có khả năng phân hủy cacbuahydro mạch thẳng, cacbuahydro thơm đơn nhân hay đa nhân mà còn có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh Vì vậy, hệ VSV ở đây góp phần rất lớn trong quá trình làm sạch các hợp chất này Đặc biệt là nấm sợi phân giải các chất hữu cơ trong thảm thực vật, động vật ở RNM Góp phần làm

giảm sự ô nhiễm MT trong đó có ô nhiễm dầu Khu hệ VSV ở RNMcó khả năng phân giải các chất hữu cơ cho điều kiện không có oxi, trong suốt mùa lũ lụt và điều kiện có oxi trong suốt kì phơi ải [37]

Đây là hệ sinh thái có năng suất sinh học cao nhất trong các hệ sinh thái, nơi hội tụ sự đa dạng của cả sinh vật biển và đất liền Vì vậy, nó chính là phòng thí nghiệm sống, để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống Đặc biệt là năng suất sinh sản của các quần thể nấm sợi phân giải cacbuahydro sau khi môi trường bị đảo lộn bởi con người do nhiễm dầu [44],[47]

1.2 Tổng quan về nấm sợi

1.2.1 Đặc điểm sinh học

1.2.1.1 Điểm hình thái, cấu trúc

Nấm sợi thuộc nhóm vi nấm (filamentous fungi), có kích thước hiển

vi Chúng là một hệ sợi phức tạp, đa bào có màu sắc phong phú (hình 1.1a) Nấm sợi có cấu tạo cơ quan sinh sản với nhiều hình thức sinh sản khác nhau Đây là một trong những tiêu chuẩn chủ yếu để phân loại chúng [7],[8]

Cơ thể nấm là một tản (thallus) Tản nấm được cấu tạo từ hệ sợi nấm hay thể khuẩn ty (mycelium) do các sợi nấm hay khuẩn ty (hypha) phân nhánh

tập hợp lại Những sợi này sinh trưởng ở đỉnh [7],[11],[12] Khuẩn lạc của nấm sợi thường tròn, cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc của xạ khuẩn, nhưng khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn (hình 1.1b) Bề mặt len xốp hoặc mịn Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5- 10 μm, trong khi đó khuẩn lạc của xạ khuẩn chỉ 0.5- 2 μm

 Khuẩn ty: Là những sợi nấm phân nhánh, phát sinh từ bào tử mà ra

Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn ngang (septum), các sợi nấm không có vách ngăn ngang gọi là sợi cộng bào (coenocystic) Một số sợi nấm

có thể tiết sắc tố vào môi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm Đa số sợi nấm phân nhánh nhiều lần nhưng cũng có sợi nấm không phân nhánh Nấm sợi không có diệp lục do đó không có khả năng tiến hành quang hợp, chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khuẩn ty

Có 2 loại khuẩn ty:

- Khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt cơ chất, từ đây sẽ có một số sợi phát triển thành các cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử

- Khuẩn ty cơ chất phát triển sâu vào cơ chất, giúp nấm sợi bám chặt vào

cơ chất và hấp thụ các loại thức ăn chứa trong đó

 Bào tử: Là cơ quan sinh sản chủ yếu của nấm sợi Khi nấm sợi

trưởng thành sẽ xuất hiện khuẩn ty khí sinh, từ khuẩn ty khí sinh sẽ sinh sản

ra bào tử

Nấm là VSV có nhân chuẩn thành tế bào nấm cấu tạo chủ yếu là kitin- glucan, kitozan, rất ít nấm có thành tế bào là xenluloza [7],[12],[16]

1.2.1.2 Đặc điểm sinh lí, sinh hoá

Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp thụ qua màng nên không có

cơ quan tiêu hoá Nấm sợi không có diệp lục nên không có khả năng quang hợp Chúng thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ, sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau Phần lớn nấm sợi là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh gây bệnh cho người và động vật

Các loại nấm sợi thường có nhu cầu khác nhau về nguồn nitơ, photpho Chúng có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ Ngoài ra, sự sinh trưởng của nấm sợi ở RNM liên quan đến các nguyên tố vi lượng, các vitamin, độ mặn trong môi trường nuôi cấy Tuỳ thuộc vào chủng nấm ưa mặn cực đoan hay ưa mặn tuỳ ý, mà nồng độ muối thích hợp dao động từ 0%- 3%

Ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm sợi còn có yếu tố độ ẩm, nhiệt độ môi trường Nấm sợi tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25-30o Đa số nấm sợi sinh

trưởng tốt ở pH=7 Riêng loài Trichoderma thích hợp ở môi trường axit

1.2.1.3 Đặc điểm sinh sản

Nấm sợi là một trong những VSV có nhiều kiểu sinh sản khác nhau, nhưng chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc

hữu tính

 Sinh sản sinh dưỡng:

 Phát triển bằng khuẩn ty: Những đoạn nấm riêng rẽ có thể phát triển thành khuẩn ty Trong lòng khuẩn ty này có thể thấy xuất hiện một hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ Khi gặp điều kiện thuận lợi, các tế bào này lại tiếp tục phát triển thành một sợi nấm mới

 Sinh sản bằng hạch nấm: Một số nấm lại có khả năng tạo thành hạch nấm Đây là một khối có hình tròn không đều, màu tối Bên trong là một

tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng Hạch nấm có thể giúp cho cơ thể nấm vượt qua những điều kiện khó khăn Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng lại phát triển bình thường

 Sinh sản vô tính bằng bào tử:

Các bào tử vô tính khác nhau về hình dạng và cách phát sinh, căn

cứ vào đặc điểm phát sinh chia làm 3 loại bào tử vô tính:

 Bào tử động (zoospores): Gặp ở các lớp ngành phụ mycotina, bào tử vô tính có roi, phát sinh trong nang bào tử động Nang có thể

Mastigo-do toàn bộ sợi nấm đơn giản biến đổi thành Nang khi chín sẽ mở nắp cho các

BT chui ra Hình 1.2a

 Bào tử kín (gymnospores): Gặp ở ngành phụ Zygomycotyna Các BT kín không có roi, tạo ra trong nang kín Khi nang chín sẽ nứt ra và phóng thích BT ra ngoài Hình 1.2b

 Bào tử trần (conidi, angiospores): Là loại BT phát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội sinh, nhưng đều được giải phóng ra phía ngoài của tế bào sinh bào tử Bào tử trần (BTT) có nhiều loại: Loại không có vách

ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp…), loại có một vách ngăn ngang (Trichothecium spp, Arthrobotrytis spp…), có từ hai vách ngăn ngang trở lên (Fusarium spp, Helmilthosporium spp…), có cả vách ngăn ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽ hoặc nối tiếp nhau (Alternaria spp…) Hình 1.2c

Hình 1.2: Các dạng BT vô tính [Nguồn:sinhhocviet.com.vn]

(a: BT động; b: BT kín; c: BT trần)

 Sinh sản hữu tính

Nấm sợi cũng có hình thức sinh sản hữu tính giống các sinh vật bậc cao, đó là quá trình chất giao (plasmogamy) nhân giao (caryogamy) và quá trình giảm phân (meiosis)

* Lớp nấm roi thực hiện bằng cách đẳng giao, dị giao và noãn giao

 Đẳng giao: Sợi khuẩn ty sinh ra các túi giao tử trong có chứa giao tử Các giao tử sau khi ra khỏi túi kết hợp với nhau tạo thành hợp tử Hợp tử phân chia giảm nhiễm thành các BT Mỗi BT khi được giải phóng ra

từ hợp tử có thể phát sinh thành sợi nấm Các giao tử và túi giao tử hoàn toàn giống nhau giữa cơ thể “đực” và cơ thể “cái”

 Dị giao: Là trường hợp các giao tử và túi giao tử ở cơ thể

“đực” và cơ thể “cái” khác nhau

* Lớp nấm tiếp hợp: Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (zygospore), hình 1.3c Từ hai khuẩn ty khác nhau gọi là sợi âm và sợi dương mọc ra hai mấu lồi gọi là nguyên phối nang Các nguyên phối nang mọc hướng vào nhau, mỗi nguyên phối nang sẽ xuất hiện một vách ngăn phân tách hai phần đầu của hai nguyên phối nang thành hai tế bào đa nhân (đơn bội) Hai tế bào đa nhân tiếp hợp với nhau tạo thành hợp tử đa nhân lưỡng bội, có màng dày bao bọc gọi là bào tử tiếp hợp Ngoài ra, nấm tiếp hợp còn có dạng sinh sản chỉ phối sinh chất không phối nhân, do đó tạo thành hợp tử có nhiều nhân nhưng đơn bội

* Nấm đảm: Sinh sản bằng bào tử đảm (basidiospore)- hình 1.3b, là BT thực hữu tính được tạo thành bên ngoài tế bào sinh bào BT đặc biệt gọi là đảm (basidium) Khi chín phát tán bằng cách rụng khỏi đảm

* Nấm túi: Sinh sản bằng bào tử túi (ascospore)- hình 1.3a, các bào tử này được hình thành trong túi bào tử Bào tử chỉ phát tán khi túi già và mở ở đỉnh hoặc khi vỏ túi bị phân huỷ

a) b) c) Hình 1.3: Các dạng BT sinh sản hữu tính [Nguồn: sinhhocviet.com]

+ Chu trình hai thế hệ: Giai đoạn giao tử thể xen kẽ với giai đoạn bào

tử thể, hai giai đoạn này tương đương nhau

+ Chu Trình đơn bội: Sự giảm phân nối tiếp ngay sau khi phối nhân để tạo thành giao tử thể đơn bội Giai đoạn lưỡng bội chỉ tồn tại trong một trạng thái và thời gian ngắn

+ Chu trình đơn bội song nhân: Đây có thể là biến dạng của chu trình đơn bội, giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế hơn so với giai đoạn song nhân

+ Chu trình vô tính: Đây là đặc trưng của nhóm nấm bất toàn, hoàn toàn không có giai đoạn sinh sản hữu tính [10],[11],[12],[13]

1.2.2 Phân loại nấm

Nhiều tác giả đã đưa ra những hệ thống phân loại khác nhau Mỗi hệ

thống đều có ưu, nhược điểm nhất định Nhưng đều theo hai hệ thống phân loại chung

Hệ thống phân loại hình thái: dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một

số đặc điểm sinh lý sinh hoá và phương thức sinh sản

Hệ thống phân loại dựa trên các phương pháp sinh hoá và sinh học phân

tử Nhưng hệ thống phân loại này được sử dụng rất ít Các khoá phân loại phổ

biến hiện nay thường dùng là: Khoá phân loại hình thái của Saccardo (1880, 1886), Barnett (1960), Ainsworth (1973), Bùi Xuân Đồng (2004), Đặng Vũ Hồng Miên, Robert A.Samson, Ellen S.Hoekstra and Jens C Frisvad (2004) Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khoá phân loại: Bùi Xuân Đồng , Đặng Vũ Hồng Miên, đây là khoá phân loại được rất nhiều nhà nấm học Việt Nam thường dùng

VSV không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới Chúng bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước nhỏ Vì vậy, khi quan sát phải dùng kính hiển vi Ngoài ra, muốn nghiên cứu phải sử dụng phương pháp nuôi cấy vô khuẩn [26],[36],[37],[38]

Nấm sợi là loại nấm hiển vi thuộc ngành nấm (Fungi) Chúng thuộc các nhóm phân loại như ghi trong bảng 1.1.Đa số thuộc các ngành phụ Zygomy-cotina, Deuteromycotina và Ascomycotina Ở đây, chúng tôi chỉ khái quát những nhóm phân loại chính của nấm sợi

Nấm sợi có nhân tế bào hoàn chỉnh, không có diệp lục, thành tế bào có kitin, có chất dự trữ là glycogen, dinh dưỡng kiểu hấp thu, dạng cộng bào đặc biệt, sinh sản bằng bào tử vô tính hoặc hữu tính Gồm ngành nấm nhày (Myxomycota) và ngành nấm thực (Mycota)

Bảng 1.1: Khái quát một số nhóm phân loại chính [8]

Ngành nấm nhày (Myxomycota)

Giai đoạn dinh dưỡng là thể nguyên hình hoặc thể nguyên hình giả, dinh dưỡng bằng hấp thụ hoặc thực bào

Ngành nấm thực (Eumycota)

Giai đoạn dinh dưỡng là dạng sợi điển hình, dinh dưỡng bằng cách hấp thụ qua màng

Nhóm phân loại Đặc điểm chung

Ngành phụ nấm tiếp hợp

(Zygomy-cetina)

Lớp: Zygomycetes

Lớp: Tricomycetes

Sợi nấm không ngăn vách Sinh sản

vô tính bằng bào tử kín (một ít loài

có BTT) Sinh sản hữu tính bằng bào tử tiếp hợp

1.2.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học

1 2.3.1 Khả năng sinh enzym

Nấm sợi là một trong nhóm VSV có khả năng sinh nhiều loại enzym

có hoạt tính sinh học cao Vì vậy, giúp chúng có thể sống được trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng, cũng như có thành phần hidrocacbon khó hấp thu

Enzym là những phân tử protein, được sản xuất tự nhiên từ sinh vật, hết sức cần thiết cho sự sống Chúng là những chất xúc tác thúc đẩy phản ứng sinh hoá học ở cả trong và ngoài cơ thể sống, nhưng không làm thay đổi tính chất của chúng Vì vậy việc nghiên cứu hoạt tính enzym có thể tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm Các loại enzym trên thị trường hiện nay

được trích từ vi khuẩn hoặc nấm như: Bacillus, Aspergillus, Tricoderma

Ngày nay, người ta đã biết được khoảng 3500 loại enzym Trong đó, phần lớn là ở thực vật và VSV Những enzym tham gia quá trình dị hoá ngoài

tế bào được gọi là enzym ngoại bào (exoenzym) Những enzym tham gia quá trình dị hoá trong tế bào được gọi là enzym nội bào (endoenzym) Enzym nội bào còn bao gồm các loại enzym tham gia tổng hợp, enzym tham gia quá trình oxi hoá và các enzym tham gia quá trình chuyển hoá vật chất có trong tế bào Phần lớn, các enzym ngoại bào thuộc enzym cảm ứng Đó là các enzym thường được tạo thành do trong môi trường có chất cảm ứng (cơ chất đặc hiệu) tác dụng đặc hiệu lên tế bào Enzym này thường tham gia phân hủy cơ chất

Nấm sợi là nhóm VSV có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym thủy phân ngoại bào như: Ligno-xenlulaza, proteaza, amilaza, kitinaza, pectinaza, oxigenaza…Trong tự nhiên nhờ hệ enzym ngoại bào mạnh, chúng

có mặt ở khắp mọi nơi Đồng thời, chúng có khả năng thích nghi với mọi hoàn cảnh môi trường Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có thể tồn

tại trong những môi trường khắc nghiệt nhất (chẳng hạn khi môi trường bị nhiễm dầu) Trong quá trình đấu tranh sinh tồn đó, VSV đã tiến hoá dần và trong các loài có những cá thể VSV có thể tổng hợp được những enzym có hoạt tính cao

- Xenlulaza: Xúc tác phân giải hợp chất ligno-xenluloza thành glucoza Ligno-xenluloza là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật, bao gồm: Xenluloza chiếm (30-40%), hemi-xenluloza và lignin (15-30%) Trong RNM, nguồn dinh dưỡng và năng lượng chủ yếu từ sự phân giải xác thực vật Nên vai trò của enzym xenlulaza rất lớn Nhiều loại nấm sợi có hoạt tính ligno-

xenlulaza như: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma.`

- Amilaza: Xúc tác quá trình thuỷ phân tinh bột, glucogen và các polyxacarit tương tự thành đường Nấm sợi là nhóm có nhiều chủng có khả năng sinh enzym này Do đó, chúng không thể thiếu trong những hệ sinh thái RNM-nơi chiếm ưu thế là quần thể thực vật Các loài nấm sợi có hoạt tính

phân giải cơ chất này là: Aspergillus, Penicillum

- Proteaza:Xúc tác quá trình thủy phân protein thành các chuỗi polypep-tit ngắn, peptit hay axit amin Nấm sợi là một trong những loại VSV

có khả năng phân giải proetin mạnh, điển hình như các loài thuộc chi

Aspergillus, Trichoderma, Penicillium…

- Kitinaza: Xúc tác phân giải các biopolyme tạo ra các glucozamin Nấm sợi có hệ kitinaza mạnh giúp chúng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và côn trùng có thành kitin

- Oxygenaza: Oxi hoá các cacbuahydro trong dầu tạo ra các axit cacboxylic Hệ enzym này đã giúp nấm sợi có thể tồn tại và phát triển ngay trên cả môi trường nhiễm cacbuahydro khó phân huỷ như dầu mỏ Thêm vào

đó sản phẩm phân giải của enzym này là cacbon dioxit, nước và sinh khối tế

bào - nguồn thức ăn dễ đồng hoá cho sinh vật ở những vùng dễ nhiễm dầu như vùng RNM [41],[44],[50]

1.2.3.2 Khả năng sinh kháng sinh

Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh được phát hiện đầu tiên nên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học Nhiều CKS đã được phát hiện như penicillin, cephalosporin, grisoefulvin, glytoxin

Từ các chủng nấm sợi Penicillium notatum, Penicillium chrysogesrum, Cephalosporium sp, Trichoderma viride…đã có hàng ngàn kháng sinh được

tìm thấy sử dụng trong y học, nông nghiệp Thực tế trong sản xuất, nhiều nước đưa vào đất các loài VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh mà không hại cây trồng Đặc biệt chúng có khả năng ức chế các VSV gây bệnh đã nhờn thuốc Trong những năm gần đây, người ta phát hiện thấy nấm ở RNM

có tiềm năng sinh các kháng sinh mới Trong môi trường sống đặc biệt này các VSV tạo CKS mới chống hiện tượng lờn thuốc

1.3 Cacbuahydro và khả năng phân giải dầu của nấm sợi 1.3.1 Sơ lược về cacbuahydro

Cacbuahydro là hợp chất của các nguyên tố hydrogen và cacbon Các

cacbuahydro ở dạng khí (methan, ethylen và acethylen) trong điều kiện nhiệt

độ và áp suất bình thường Đa số các cacbuahydro còn lại ở dạng lỏng hoặc rắn Chúng ít tan trong nước, tan nhiều trong dầu và các dung môi hữu cơ (Walker et al., 1996) Chúng là một trong những nguồn gây ô nhiễm MT của nền văn minh hiện đại

Dầu mỏ là hỗn hợp lỏng sánh của các chất hữu cơ tích tụ thành mỏ trong vỏ trái đất, giữa các lớp đá Thường có mùi đặc trưng, màu sẫm đen và không tan trong nước Dầu thô là dầu mỏ được khai thác lên và đã qua xử lí

sơ bộ Hợp phần chính của dầu mỏ là các cacbuahydro lỏng tan vào nhau ở

dạng dung dịch Phần định tính và định lượng của dầu mỏ khác nhau tuỳ từng

mỏ, tầng Thành phần cơ bản của dầu mỏ gồm:

Thành phần hoá học của dầu mỏ được chia tách bằng phương pháp chưng cất phân đoạn Các sản phẩm thu được từ việc lọc dầu có thể kể đến xăng, dầu hoả, dầu diesel, paraphin, dầu bôi trơn nhựa đường…

Các chuỗi cacbuahydro từ C5-C7 là các sản phẩm dầu mỏ nhẹ, dễ bay hơi Chúng được sử dụng làm dung môi, chất làm sạch bề mặt và các sản phẩm làm khô nhanh khác Nhưng chúng lại rất độc đối với VSV Các chuỗi cacbuahydro từ C6-C12 bị trộn lẫn vào nhau được sử dụng trong đời sống với tên gọi là xăng Dầu hoả được tạo thành từ chuỗi cacbuahydro từ C10-C15 Dầu Diesel (DO) gồm các cacbuahydro từ C15–C20 DO nặng có thể có được tạo từ

cả những C20+ thậm chí đến C30 Các sản phẩm này ở nhiệt độ phòng đều là chất lỏng

Dầu thô của Việt Nam thuộc dầu trung bình nặng, nhiều parafin (20%- 30%) và ít lưu huỳnh Khoảng nhiệt độ sôi của các sản phẩm dầu mỏ trong chưng cất phân đoạn ở điều kiện áp suất khí quyển tính theo độ C là:

Tóm lại, người ta coi dầu mỏ là hỗn hợp 3 loại chất của cacbuahydro:

Hợp chất mạch thẳng-alphatic, hợp chất mạch vòng thơm-aromatic và hợp

chất nhựa đường-asphatic là những hợp chất độc đối với sinh vật (Atlas, 1995) [5]

1.3.2 Tình hình ô nhiễm dầu

Dầu là tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và không có khả năng phục

hồi, là năng lượng cho sản xuất lớn nhất trên thế giới hiện nay Số lượng mỏ

dầu được phát hiện và đưa vào khai thác hàm lượng dầu trên thế giới ngày

càng tăng Kéo theo sự rạn nứt, rò rỉ ở các dàn khoan đổ ra bên ngoài tới 1%

số lượng dầu khai thác (hình 1.4) Thêm vào đó, sự thấm tự nhiên ở các kho

chứa hàng, vận chuyển, rửa tàu bừa bãi Đặc biệt, các tai nạn tràn dầu gây ô

nhiễm dầu nguy hại đến con người và hệ sinh thái biển Trong đó, ảnh hưởng

nặng nề nhất là các hệ sinh thái vùng ngập mặn nằm dọc bờ

Sự ô nhiễm bởi dầu chủ yếu là do vận chuyển ở biển và chất thải bị

nhiễm xăng dầu Theo điều tra của các nhà khoa học khoảng 1 tỉ tấn dầu được

chở bằng đường biển mỗi năm Một phần khối lượng này (khoảng 0,1 – 0,3%)

được ném ra biển một cách hợp pháp: Đó là sự rửa dầu bằng nước biển Các

tai nạn đắm tàu chở dầu tương đối thường xuyên

 Trên thế giới

Theo thống kê đã có 129 tai nạn tàu dầu từ 1973 - 1975, làm ô nhiễm biển bởi 340.000 tấn dầu (Ramade, 1989) Ước tính có khoảng 3.6

triệu tấn dầu thô thải ra biển hàng năm (Baker, 1983) Một tấn dầu loang rộng

12 km2 trên mặt biển, do đó biển luôn luôn có một lớp mỏng dầu trên mặt

(Furon, 1962) [4]

Hình 1.4: Tai nạn tràn dầu ở dàn khoan[51]

Một trong những sự cố tràn dầu nghiêm trọng nhất là vụ đắm tàu chở dầu Exxon Valdez ngày 24/03/1989 làm tràn 11 triệu gallon dầu ra bờ biển bang Alaska Khoảng 300.000 con chim, 3.500 con rái cá và 200 con hải cẩu

đã bị chết [4], [42] Tai nạn tràn dầu gần đây nhất ở phía nam bờ biển Trung Quốc vào đầu năm 2007, dầu tràn trên diện tích rộng khoảng 656 feet, dài 9 hải lí Gần đây nhất vào 11/11/07 vụ đắm tàu của Nga tại cảng ở Biển đen làm tràn 4.000 tấndầu ra biển [50]

 Tại Việt Nam

Theo báo cáo thống kê của cục môi trường, Bộ khoa học-Công nghệ và môi trường cho biết: ừ năm 1987 đến nay đã xảy ra hơn 90 vụ tràn dầu, làm nhiều vùng biển và cửa biển bị ô nhiễm dầu Khoảng 200 tấn dầu được vận chuyển hàng năm ở vùng biển Việt Nam từ Trung đông đến Nhật Bản và Triều Tiên Các vụ tràn dầu ở Việt Nam đều có đặc điểm chung : Có nơi lặp lại nhiều lần Khối lượng dầu tràn lớn, diễn ra trên diện rộng Dầu ô nhiễm từ nhiều nguồn gốc khác nhau Từ năm 1994 đến nay (2007) đã có 37

sự cố tràn dầu Riêng thành phố Hồ Chí Minh có 8 vụ, với lượng dầu tràn ước tính khoảng 2.520 tấn [48] Ở Cần Giờ 2 vụ vào năm 1994, 1998 làm tràn tổng số 170 tấn Tại Cát Lái-TP Hồ Chí Minh 4 vụ (1994, 1996, 2001, 2005) Đến tháng 6-2003 tàu Hồng Anh đụng vào cầu cảng chìm, làm tràn hàng chục tấn dầu tại vùng ven biển Cần Giờ (hình 1.5) Ngày 21/1/2007 tàu chở dầu

mang tên Kasco chở khoảng 30.000 tấn dầu DO Do va chạm vào cầu cảng tại

xí nghiệp lọc dầu SaiGon Petro (Phường Thạnh Mỹ Lợi, Q.12- tp HCM) khiến tàu bị thủng, dầu tràn ra trên đoạn đường 1km sông Đồng Nai về phía cầu phà Cát Lái Gần đây nhất tai nạn nổ kho chứa xăng- dầu ở Đà Nẵng vào tháng 4/2007.Theo các nhà khoa học, mỗi năm nước ta có khoảng 5-6 vụ tràn dầu Hằng ngày có khoảng 110.000 thùng dầu khai thác ở mỏ Bạch Hổ có 1%

bị rò rỉ Thêm vào đó 70% nước thải từ các vùng công nghiệp khai thác dầu khí không hề được xử lí đổ ra biển Ở một số bãi biển và cảng lớn tại Hải Phòng, Vũng Tàu, Quy Nhơn…nồng độ dầu đã vượt quá mức cho phép (trên 0,05% mg dầu/l) [42], [45], [47], [49], [51]

Hình 1.5 :Tàu Hồng Anh chìm vào tháng 6-2003 gây tràn dầu tại

vùng ven biển Cần Giờ-TPHCM (Nguồn: Báo SGGP, 2003)

Dầu và các sản phẩm của dầu khi tràn ra nước tạo ra lớp bao phủ trên mặt nước, ngăn cản sự trao đổi nhiệt, oxy giữa pha nước và pha khí gây ảnh hưởng đến sinh vật Ô nhiễm dầu sẽ làm giảm hiệu quả trạng thái của đất về

vi sinh vật, về động thực vật đặc biệt ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

1.3.3 Cơ chế phân giải dầu của vi sinh vật

Con đường trao đổi chất từ cơ chất là cacbuahydro của dầu mỏ khá phức tạp Mức độ phân giải sinh học của từng loại dầu tuỳ thuộc vào bản chất và kích thước phân tử của từng cacbuahydro tạo nên chúng Khả năng phân giải các cacbuahydro trong dầu tuỳ theo sự khác biệt về chiều dài mạch cacbon

của ankan Các ankan có số C10 – C14 thường phân giải mạnh nhất Các ankan chuỗi ngắn hơn hầu hết có độc tính với vi sinh vật, nhưng lại dễ mất do quá trình bay hơi Các vi sinh vật không có khả năng phân giải các mạch cacbon

có khối lượng hơn 500 đvC [27], [28] Sự phân giải cacbuahydro hai hướng sau:

- Oxi hoá hợp chất cacbuahydro phức tạp có khối lượng lớn thành những chất đơn giản có khối lượng nhỏ hơn để làm giảm hoặc mất độc tính tạo khí thoát ra

- Sử dụng cacbuahydro để sinh tổng hợp tạo sinh khối VSV sử dụng vào các mục đích khác nhau

Hiện nay các nhà khoa học đã làm sáng tỏ cơ chế phân giải cacbuahydro mạch hở Sự phân giải cacbuahydro có thể diễn ra trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí Trong điều kiện hiếu khí sự phân giải ankan no mạch thẳng thường theo con đường oxy hoá hoàn toàn đầu tận cùng, diễn ra như sau:

- Đầu tiên dưới tác dụng của enzym hydroxylase (monooxygenase) n- ankan sẽ bị oxy hoá thành rượu bậc một:

CH3-R-CH3 + O2 + NAD(P)H + H+ → CH3-R-CH2-OH + NAD(P) + H2O Một số trường hợp giai đoạn đầu này được tác động bởi enzym dioxygenase Khi đó quá trình oxy hoá diễn ra theo cách sau:

CH3-R-CH3 + O2 → CH3-R-CH2- COOH + NAD(P)H + H+ → CH3R-CH2-OH + NAD(P) + H2O

Tiếp đến rượu bậc một tiếp tục được oxy hoá thành andehyt rồi thành axit cacboxylic:

CH3-R-CH2-OH → CH3-R-CHO → CH3-R-CH2-COOH

- Axit cacbonxylic được sinh ra có thể theo quá trình ω-oxidation rồi đến quá trình β-oxidation hoặc trực tiếp quá trình β-oxidation

- Sản phẩm quá trình β-oxidation là Acetyl CoA sẽ đi vào chu trình TCA và giải phóng CO2 và H2O

Ngoài ra, sự phân giải cũng có thể đi theo con đường phụ (subterminalo- xidation), oxi hoá cacbon giữa mạch: Từ cacbuahydro sẽ tạo ra rượu bậc 2, rồi tạo xêton tạo axit béo và cuối cùng giải phóng CO2 và H2O

Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên hexan vòng phải thực hiện tất cả các phản ứng phân huỷ trên Nhưng trong thực tế, thường gặp các vi sinh vật có khả năng chuyển vòng hexan thành vòng cyclo hexanol (hình 1.6) nhưng không có khả năng lacton hoá và mở mạch vòng Sau đó, các hợp chất hữu cơ vòng thơm bị hydroxyl hoá nhờ cắt ở vị trí octo tạo ra axit muconic và

bị oxi hoá tiếp thành xetoadipic Oxi hoá tiếp theo thành axit succinic và axetyl CoA Sau cùng vào con đường β–oxi hoá thành axit formic, piruvic và axetaldehyd [5]

Một số loại nấm sợi thường gặp có khả năng oxi hoá các hợp chất có

chứa nhân thơm như Aspergillus niger, có khả năng phân huỷ hợp chất là dẫn suất của phenol chủng Fusarium lini, Fusarium solani oxi hoá được một số

dẫn suất của steroids, terpenoids, alkaloid [28], [43], [49]

Hình 1.6: Phân giải hiếu khí benzen (ảnh nguồn của Brauner, 1998)

1.3.4 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH, độ mặn…có ảnh hưởng trực tiếp đến trạng thái lý học của dầu Thêm vào đó, thành phần chất dinh

dưỡng như cacbon, nitơ, photpho trong MT cũng ảnh hưởng đến mức độ phân giải dầu

1.3.4.1 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phân giải dầu của VSV vì nó ảnh hưởng đến tính chất vật lý, hoá học của dầu cũng như khả năng sinh trưởng của VSV Mỗi loài nấm sợi đều có khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định, phần lớn nấm sợi có khoảng nhiệt độ 15- 30oC Nhiệt độ này còn phụ thuộc vào độ ẩm và tuỳ vào nhóm nấm ưa nhiệt hay ưa lạnh Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình phân giải dầu diễn ra mạnh nhất

ở khoảng 30- 40oC Đối với VSV ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho quá trình phân giải có thể cao hơn khoảng 45- 75oC (Klug và Markovet, 1992)

1.3.4.2 Ảnh hưởng của độ pH

Mỗi nhóm VSV có độ pH thích hợp riêng để sinh trưởng Điều kiện

pH thích hợp của môi trường sẽ kích thích quá trình phân giải dầu của VSV Đối với nấm sợi pH có thể chịu được 3,5-8 và pH tối ưu từ 5,5-6,5 Trong môi trường có nồng độ axit hay kiềm mạnh đều ức chế sự sinh trưởng của nấm sợi Tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, độ pH thay đổi liên quan đến sự có mặt của gốc H+, OH- của các chất hoà tan [8]

1.3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Môi trường ô nhiễm dầu nặng chủ yếu là vùng nước lợ ven biển Nồng

độ muối khác nhau ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của VSV vì vậy, tác động đến quá trình phân giải dầu của chúng Tùy vào từng khu vực, thời điểm

mà có sự thay đổi về nồng độ muối khác nhau Đối với vùng ven biển và vùng RNM thì nồng độ muối dao động từ 0.1-5% [15], [16] Vào mùa mưa thì độ mặn ở RNM Cần Giờ tăng lên do hiện tượng xả lũ của các hồ chứa nước Theo nghiên cứu của Ward và Brock (1990) khi độ mặn tăng từ 3.3-28.4% quá trình phân giải cacbuahydro giảm đi [31]

1.3.4.4 Các chất dinh dưỡng

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính phân giải dầu của VSV Trong môi trường tự nhiên, thành phần này không ổn định Nấm sợi thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu

cơ lẫn nguồn nitơ vô cơ Nhiều loài nấm sợi có khả năng đồng hoá cả muối amôn lẫn nitrat Đôi khi ta thấy có những loài nấm sợi không phát triển trên môi trường chứa nguồn nitơ là muối amôn nhưng nguyên nhân không phải là

do gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lí do các muối amôn tạo ra Trong quá trình phân giải dầu tỉ lệ C/N; C/P là một yếu tố quan trọng quyết định hoạt tính phân giải dầu của VSV Khi có dầu tràn, lượng cacbuahydro lớn làm tăng tỉ lệ C/N; C/P dẫn đến hạn chế khả năng phân giải dầu Vì vậy, điều chỉnh tỉ lệ C/N/P nhằm kích thích khả năng phân giải dầu của VSV là hết sức cần thiết

Để giải quyết vấn đề ô nhiễm dầu do sự cố đắm tàu Exxon Valdez ở Alaska (1989) người ta đã bổ sung 50.000 kg N và 5.000 kg P để tăng sự phân giải dầu của VSV ở đây [36], [43]

1.3.5 Vai trò và lược sử nghiên cứu nấm sợi phân giải dầu

1.3.5.1 Vai trò của nấm sợi trong hệ sinh thái RNM

- Nấm sợi RNM góp phần quan trọng trong việc khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp

- Chúng được sử dụng để sản xuất nước tương, đậu phụ, các loại enzym như: amilaza, proteinaza, xenlulaza,

- Nhiều loại nấm sợi có khả năng tích luỹ vitamin, các chất sinh trưởng

và nhiều ancaloit có giá trị chữa bệnh

- Nấm sợi có khả năng tiết chất kháng sinh có giá trị: Pennixilin, xephalosporum, fuzidin, fumagilin, tripaxidin

- Nấm sợi được sử dụng trong sản xuất thu sinh khối giàu protein làm thức ăn cho gia súc

- Việc phát hiện ra VSV có khả năng phân giải các hợp chất ahydro khó phân huỷ có ý nghĩa rất lớn trong ngành công nghệ sinh học Rất nhiều nhà khoa học trong các phòng thí nghiệm đi sâu nghiên cứu sử dụng VSV trong thăm dò và khai thác dầu khí VSV phân giải dầu còn được sử dụng để sản xuất sinh khối giàu protein cho gia súc, trên cơ chất dầu mỏ Để giải quyết vấn đề ô nhiễm dầu hiện nay trên biển và các vùng ngập mặn Biện pháp sử dụng chủ yếu là cơ học và hoá học Nhưng biện pháp này để lại một lượng dầu không xử lí hết sau khi thu dọn Ngày nay, các nhà khoa học sau khi dùng phương pháp lí-hoá để dọn bớt lượng dầu trên bề mặt đã phối hợp thêm biện pháp phân hủy sinh học để xử lí lượng dầu còn lại [27], [32]

1.3.5.2 Lược sử nghiên cứu nấm sợi phân giải dầu

Các vi sinh vật phân giải dầu chủ yếu là nhóm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Các công trình nghiên cứu về nấm sợi ở RNM của các tác giả trên thế giới như: Từ năm 1895 Miyoshi đã công bố công trình nghiên cứu về khả năng phân huỷ parafin trong dầu mỏ của vi sinh vật 1906-Rahn nghiên cứu khả năng phân giải parafin bởi nấm mốc Năm 1925, Tauson đã phát hiện thấy khả năng phân giải cacbuahydro của vi khuẩn Đến năm 1940, rất nhiều nhà khoa học trong các phòng thí nghiệm trên thế giới đi sâu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong thăm dò và khai thác dầu khí Năm 1961, Fush thống

kê có 26 giống trong đó có 75 chủng phân giải cacbuahydro mạch thẳng, 25 chủng phân giải cacbuahydro mạch vòng Sau đó, các nhà khoa học Kom-agata, Nakase, Kasuio đã phân lập được 498 chủng nấm men có khả năng phân giải cacbuahydro

Số lượng các loài VSV có khả năng phân giải dầu mỏ được công bố ngày càng nhiều Chúng thuộc các nhóm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và cả

xạ khuẩn

 Vi khuẩn: Bacillus, Bacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium

 Nấm men: Candida(chủ yếu), Endomyces

 Nấm sợi: Penicilium, Aspergillus

 Xạ khuẩn: Actinomyces, Streptomyces

Trong số các nhóm vi sinh vật thì vi khuẩn và nấm sợi là hai nhóm đã tìm thấy nhiều loài có khả năng phân giải dầu mạnh Nấm sợi phát triển mạnh trên môi trường có n-ankan mạch thẳng nhưng yếu hơn ở mạch nhánh Vi sinh vật trong môi trường có dầu mỏ, với điều kiện thích nghi chúng có thể sử dụng các thành phần cacbuahydro của dầu mỏ làm cơ chất dinh dưỡng nguồn cacbon [28]

Sự phân huỷ sinh học không phải là một khái niệm mới Các nhà khoa học đã nghiên cứu từ năm 1940 Tuy nhiên, nó chỉ được biết đến rộng rãi như

là một công nghệ cho việc làm sạch các vùng ven bờ bị ô nhiễm do sự cố tràn dầu tiêu biểu như trường hợp xử lí tai nạn tràn dầu ở Prince William Sound vào năm 1989 (Hoff, 1993)

Nấm trên thế giới đã được nghiên cứu và hệ thống hoá từ lâu Nhưng

mô tả đầu tiên về nấm biển xuất hiện trong RNM là nhà nghiên cứu nấm Cribb và Cribb (1955, 1956, 1960) ở Australia, về nhóm Philophorophoma littoralis Linder Tiếp đến là Kohlmeyer (1966, 1968, 1969) Năm 1979 Kohlmeyer và cộng sự đẫ đưa ra danh sách 42 loài vi nấm RNM (23 loài

thuộc Ascomyco-tina, 17 loài thuộc Deuterromycotyna, 2 loài thuộc basidiomycotina) Năm 1987, Hyde và Jones 89 loài nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak (Ấn Độ) Gần 300 chủng nấm từ lá cây, chủ yếu là nấm kí

sinh [33] Bên cạnh đó, cũng có những công trình nghiên cứu hệ vi nấm khác trên lá của cây Heliconia marina ở Costa Rica và ở nam Mexico Qua tổng hợp, so sánh người ta đã ghi nhận được một số loài vi nấm đặc trưng của

vùng Caribê như: Clordium phacosporum var cubense, Cylinsympodiella sp Lauriomyces pulchra và Solheimia costaspora (JD Polishook et al, 1996)

Chủ yếu là các loài nấm sợi có khả năng phân giải xenluloza, protein, kitin Riêng về nấm sợi phân giải dầu ở RNM còn tản mạn

Tại Việt Nam, có công trình nghiên cứu nấm sợi có khả năng phân giải dầu thô ở các giếng khoan dầu khí thuộc tỉnh Thái Bình, Vũng Tàu của tác giả Lại Thuý Hiền Nghiên cứu tính đa dạng và vai trò của nấm sợi phân lập từ RNM ở tỉnh Thái Bình và Nam Định của Mai Thị Hằng, 2003 Cũng theo các nhà nghiên cứu, vi sinh vật RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ tìm thấy có khoảng 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ

ở mức độ khác nhau, một số chủng nấm sợi thuộc các chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paeci-lomyces có khả năng phân giải mạnh dầu

DO Ngoài ra các nhà nghiên cứu còn thấy các chủng nấm sợi hiện diện ở RNM cũng có mặt ngay trên dầu thô ở Bạch Hổ [42], [44], [45], [47]

Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Khu vực lấy mẫu

Ghi chú: Vị trí lấy mẫu

Hình 2.1: Bản đồ vị trí lấy mẫu huyện Cần Giờ

[Nguồn từ http://mabvn.net]

Các mẫu đất, lá, thân cây ở các vùng của RNM Cần Giờ như:

- Đất ở bề mặt từ 0-5cm và lớp đất bề sâu khoảng 10-15cm ở xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp; Bình Khánh; đảo khỉ; ruộng muối cách đảo khỉ 3km; rừng Đước thuộc rừng trồng lâu năm

- Thân: Thân mục, thân tươi ; quả chủ yếu ở các cây như : Dừa nước,

Sú, Đước, Bần, Mắm

- Lá gồm lá mục, lá vàng, lá tươi

Đa số đất ở RNM Cần Giờ là đất sét pha cát, rừng thứ sinh cây trồng

từ 5-20 năm, độ ẩm cao Mẫu được lấy làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau một tháng vào tháng 6, 7, 8 năm 2006 Đợt 1 tháng 6 ít mưa, đợt 2 tháng 7 mưa vừa và đợt cuối tháng 8 mưa nhiều

- Các VSV kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633 từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự Nhiên TP HCM và Escherichia coli ATCC 15224 từ

phòng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện Bình Dân

2.1.3 Máy móc thiết bị

- Máy dập mẫu (Anh)

- Nồi hấp vô trùng Hyrayama (Nhật)

- Tủ sấy Memmer (Đức)

- Tủ cấy (Việt Nam)

- Tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật Bản)

- Tủ ấm Memmert (Đức)

- Máy lắc Gerhardt (Đức)

- Máy đo pH pometer KL-009 (II) (Trung Quốc)

- Kính hiển vi quang học, máy ảnh kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật)

- Cân điện tử 2 số Sartorius (Đức)

- Cân phân tích điện tử (4 số) Sartorius (Đức)

- Tủ lạnh National (Nhật)

2.1.4 Các môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống nấm sợi

- MT 1 : Môi trường D : Dùng để phân lập nấm sợi

Na2HPO4 0,7g Nước biển 1000ml

Dầu DO (dầu hoả) 2,5ml

pH = 5,5-6,0

Để xác định ảnh hưởng của pH, độ mặn, nồng độ nitơ đến khả năng phân giải dầu Ta điều chỉnh bằng các chất NaOH, HCl, NaCl và các muối nitrat với tỉ lệ khác nhau

- MT 4: MT Czapek- Dox: Nuôi cấy và thử hoạt tính enzim ngoại bào (xenlulaza; kitinaza; amilaza; proteaza)

Glucose 20,0g

KH2PO4 1,5g NaNO3 3,5g KCl 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g FeSO4.7H20 0,1g (vết) Agar 20,0 g Nước biển 1000ml

pH = 6,5- 7,2

Để thử hoạt tính enzym amilaza, kitinaza, proteaza, xenlulaza ta dùng các cơ chất tương ứng là tinh bột, bột vỏ tôm, casein, CMC thay đường glucose với hàm lượng tương đương

* Cách thu kitin từ vỏ tôm: Vỏ tôm rửa sạch bằng nước, đem đun sôi thay nước 3 lần Xử lí tiếp với dung dịch NaOH 10% để loại bỏ hết protein Sau đó xử lí tiếp bằng dung dịch HCl 10% để hoà tan CaCO3, cuối cùng rửa sạch, sấy khô, nghiền nhỏ để xử dụng trong các thí nghiệm [19]

- Các MT phân loại nấm sợi:

- MT 5: Malt Extract Agar (môi trường MEA):

Malt Extract 20,0g Pepton 1,0g

Glucose 20,0g Agar 20,0g Nước biển 1000ml pH=5,6

2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

- Nguyên tắc: Mẫu lấy dựa trên mục đích phân lập loại VSV nào, thì

chọn cơ chất, số lượng mẫu cho phù hợp Không lấy ngẫu nhiên mất nhiều

thời gian Phân lập nấm sau khi lấy mẫu càng sớm càng tốt

- Thu mẫu:

- Ngẫu nhiên: Khi thuỷ triều vừa rút tại các rừng già cách biển 2km Mẫu đất trên bề mặt dưới lớp lá cây mục và lớp đất sâu 5- 10cm Mẫu lá cây già tươi, lá vàng, lá khô ở các cây khác nhau Mẫu thân cây tươi, khô, mục

- Chọn lọc: Mục đích phân lập chọn những chủng nấm có khả năng phân giải dầu Vì vậy, trước khi tiến hành thu mẫu 1 tháng tôi đã đưa dầu DO- chất cảm ứng vào môi trường đất Sau đó, tiến hành thu mẫu

- Cách tiến hành:

Mẫu đất: Dùng thìa vô trùng lấy phần đất cần cho vào túi nilon Đồng thời ghi các thông số cần thiết về nơi lấy mẫu: địa chỉ, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu, người lấy mẫu

Mẫu lá, thân: dùng dao, kéo, vô trùng cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon Tất cả các mẫu sau khi lấy đều được bảo quản trong thùng đá, vận chuyển về PTN và giữ ở nhiệt độ 4oC

2.2.1.2 Phương pháp phân lập

- Nguyên tắc: Để phân lập nấm sợi là VSV đơn bào, thường phải pha

loãng để các tế bào tách rời nhau ra Sau đó trải đều trên mặt đĩa petri để các khuẩn lạc mọc riêng rẽ Mỗi khuẩn lạc sinh ra từ một tế bào ban đầu, do đó khi tách nuôi sang môi trường mới một hoặc vài lần có thể thuần khiết được giống nấm sợi

- Tiến hành: Cân 10g đất (đã nghiền nhỏ và trộn đều), lá hoặc thân cho

vào túi lọc Trong đó có chứa 90ml nước cất vô trùng, đưa vào máy nghiền mẫu, dập trong 2 phút, vận tốc 230 vòng Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 1

ml dung dịch trên sang ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, ta được dung dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục như vậy pha loãng đến nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

Lấy 0,1ml (2 giọt) dung dịch pha loãng nồng độ 10-6 sang hộp petri

có chứa môi trường phân lập, dùng que trang, trang đều cho đến khi khô Giữ nguyên que trang tiếp tục sang hộp 2 và hộp 3 [33] Sau đó, để ở nhiệt độ phòng trong 2 hoặc 3 ngày Tách các khuẩn lạc riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết Cuối cùng, đưa vào ống nghiệm có chứa thạch nghiêng môi trường giữ giống (MT2)

- Yêu cầu: Các chủng phân lập ngẫu nhiên từ MT và chủng phân chọn

lọc kí hiệu riêng để so sánh

2.2.1.3 Phương pháp xác định số lượng VSV [9]

- Nguyên tắc: Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng

nhiều phương pháp khác nhau: Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển

vi, gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), định lượng 1 cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)…

Định lượng thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn:

- Cách tiến hành: Đưa 10ml nước cất vô trùng có 3 giọt Tween 80

vào ống giống thạch nghiêng nuôi cấy được 3 ngày Lắc đều, lấy 1ml mẫu có chứa VSV Pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn Dùng micropipet lấy 0,1ml dịch huyền phù trải đều trên mặt môi trường trong hộp petri Nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 3 ngày, đếm số lượng khuẩn lạc VSV phát triển trong hộp petri, từ đó tính được số lượng tế bào trong 1ml mẫu lúc đầu theo công thức:

N = a x 10 x n Với N: Tổng số CFU trong 1ml mẫu đem phân lập

n: Độ pha loãng mẫu

a: Số CFU trung bình đếm được trong một hộp petri

- Yêu cầu:

+ Không đếm hộp có khuẩn lạc mọc bung, mọc lan

+ Chỉ đếm hộp có ít nhất 10 khuẩn lạc trở lên Những hộp có số khuẩn lạc nhỏ hơn 10 không có giá trị thống kê

+ Khi đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa tránh sự phát tán của bào tử vào không khí, gây nhiễm mẫu hoặc môi trường khác

2.2.1.4 Phương pháp định danh nấm sợi [6]

- Nguyên tắc: Các chủng VSV cần được xác định chủng loại, trước khi

tiếp tục nghiên cứu hoặc sử dụng Việc phân loại định danh cần tiến hành tỉ

mỉ thông qua quá trình quan sát, mô tả hoặc các trắc nghiệm sinh hoá dựa trên một khoá phân loại nào đó

- Cách tiến hành phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị môi trường

nuôi cấy thích hợp (YEA; MEA; Czapek)

MT sau khi đổ vào hộp petri, để qua ngày khi bề mặt môi trường tương đối khô ráo rồi mới cấy

Cấy chấm điểm các chủng nấm tuyển chọn, tuỳ theo tốc độ phát triển của từng loài nấm mà cấy 1 hoặc 3 điểm

Đánh dấu vào vị trí cần cấy lên mặt đáy của đĩa MT bằng bút lông Khi cấy, úp ngược hộp MT và cấy bào tử vào các điểm đánh dấu trước, tránh sự rơi vãi bào tử trên bề mặt môi trường tại những vị trí không mong muốn

Sau khi cấy, đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng, trong tối và thường xuyên theo dõi 3 đến 7 ngày

 Quan sát đại thể:

Ghi nhận các thông tin về khuẩn lạc của nấm (kích thước, hình dạng, màu sắc, sắc tố tiết ra môi trường, giọt tiết, ) mô tả mặt trên và mặt dưới môi trường thạch Quy trình quan sát đại thể đặc điểm khuẩn lạc định loại:

- Giọt tiết nếu có (ít, nhiều, màu sắc )

- Mùi khuẩn lạc (có, không mùi)

- Sắc tố hoà tan (màu sắc môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có Các cấu trúc khác: Bó sợi, bó giá, các cấu trúc mang bào tử trần như đĩa giá hoặc túi giá, đệm nấm, hạch nấm vv

 Sinh sản vô tính hay hữu tính

 Đặc điểm của các cơ quan sinh sản vô tính,

 Hình thái, kích thước của các loại bào tử (dạng bào tử trần, bào tử kín…)

+ Đặc điểm cuống sinh bào tử (giá bào tử): Hình dạng và cách sắp xếp cuống sinh bào tử (đơn hoặc thành bó, song không liên kết chặt chẽ, bó

có liên kết chặt chẽ, liên kết thành mô giả)

+ Kiểu phân nhánh của cuống sinh bào tử: Không phân nhánh, phân nhánh đơn, phân nhánh nối tiếp hay phân nhánh đối xứng

+ Màu sắc của cuống sinh bào tử: Không màu hoặc màu sáng, sặc

sỡ hay màu tối

+ Sự khác nhau về cấu tạo và vị trí của cuống sinh bào tử:

 Vị trí:Đâm lên hay trúc xuống, bò ngang, thẳng

 Kích thước: Cao, thấp, mỏng hay dầy

 Hình dạng phần ngọn của cuống (tròn, vuông, lồi…)

 Bề mặt của cuống: Phẳng, lồi, xù xì hay gai

 Nơi xuất phát: Từ sợi khí sinh hay cơ chất

+ Đặc điểm của bào tử: Đơn bào hoặc đa bào, có hay không có vách ngăn, có hay không có các sợi phụ, không màu, màu sáng, màu rực rỡ hay tối, toàn bộ đám bào tử màu gì? Được sinh ra trực tiếp từ sợi nấm hay từ sợi nấm

do đứt gẫy hoặc được tạo ra trên cuống sinh bào tử Xếp đơn độc , thành chuỗi hay tụ tập thành cụm Hình dạng bào tử (hình cầu, ôvan, elíp, ) Bề mặt nhăn hay gai, sần sùi hay có các sợi tơ hoặc đuôi

2.2.2 Phương pháp sinh học

2.2.2.1 Xác định khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi

- Nguyên tắc: Khả năng phân giải cacbuahydro được đánh giá bằng sự

sinh trưởng của VSV (lượng sinh khối khô) trên MT có thành phần cacbuahydro

- Tiến hành:

+ Chuẩn bị các bình tam giác dung tích 250 ml có chứa 47,5 ml môi trường khoáng nước biển và 2,5 ml dầu D.O (dầu hoả, toluen) có khối lượng tương đương 2,1g ( 4%)

+ Vô trùng môi trường ở 121oC trong 30 phút