Nghiên cứu biểu hiện gen Paga mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E. Coli BL21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN PHƯỢNG MINH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN PAGA MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN PHƯỢNG MINH

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN PAGA MÃ HÓA

KHÁNG NGUYÊN BẢO VỆ PA CỦA VI KHUẨN

BACILLUS ANTHRACIS TRONG VI KHUẨN E COLI BL21

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian dài thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn Thủ trưởng và cán bộ Viện Hóa học Môi trường Quân sự nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn của mình

-Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2013

Học viên

Nguyễn Phượng Minh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về bệnh than 3

1.1.1 Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than 3

1.1.2 Các dạng bệnh than 4

1.1.2.1 Bệnh than thể da 5

1.1.2.3 Bệnh than hô hấp 7

1.1.2.4 Bệnh than thể màng não 7

1.1.3 Bệnh than và chiến tranh sinh học 8

1.2 Tác nhân gây bệnh than 9

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis 10

1.2.2 Độc tố của vi khuẩn B anthracis 11

1.2.2.1 Độc tố vỏ nhày 11

1.2.2.2 Độc tố than 12

1.2.2.2.1 Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA) 12

1.2.2.2.2 Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF) 13

ện của các gen gây độc trong vi khuẩn B anthracis 15

1.3 Kháng nguyên bảo vệ PA 17

1.3.1 Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA 17

1.3.2 Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA 18

1.3.3 Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20

1.4 Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA 22

1.5 Biểu hiện gen pagA 23

1.5.1 Vector biểu hiện 23

1.5.2 Lựa chọn chủng biểu hiện 25

1.5.3 Phương pháp biểu hiện 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Vật liệu 28

28

2.2 Hoá chất và môi trường 29

2.2.1 Hoá chất, dung dịch 29

2.2.2 Môi trường 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn [30] 35

2.3.2 Phương pháp tinh sạch plasmid [30] 35

2.3.3 Phương pháp PCR 36

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose [30] 36

2.3.5 Phương pháp cắt bằng enzym giới hạn [30] 37

2.3.7 Phương pháp làm tế bào khả biến E coli 39

2.3.8 Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30] 39

2.3.9 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % [30] 40

2.3.10 Phương pháp biểu hiện gen 41

2.3.11 Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện 41

2.3.12 Xác định khả năng hoà tan của protein 42

2.3.13 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin 42

2.3.14 Phương pháp Western Blot [3, 25] 44

CHƯƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Tách chiết DNA tổng số 46

3.2 Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR 46

3.3 Tách dòng gen pagA 47

3.3.1 Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 47

3.3.2 Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vector tái tổ hợp 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3.3.3 Đọc trình tự nucleotide của gen pagA 51

3.4 Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA 54

3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA 54

3.4.2 Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS 54

3.4.3 Tạo chủng E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA 55

3.4.3.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E coli DH5α 55

3.4.3.2 Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp 55

3.4.3.3 Kiểm tra khung đọc của vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA 57 3.4.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào E coli BL21 (DE3) 58

3.4.4 Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong E coli BL21 59

3.4.4.1 Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA 59

3.4.4.2 Xác định khả năng hoà tan và định khu của protein 62

3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin 63

3.6 Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng Western blot 64

66

66

KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC HÌNH

5

ủa bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa 6

Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than 7

Hình1 4: Não của người bị nhiễm bệnh 8

Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) và bào tử (B) của vi khuẩn B anthracis 10

Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF 13

Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF 14

Hình 1.8: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA 18

Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA 20

Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA 20

Hình 1.11: Vector biểu hiện 23

Hình 1.12: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pET-28a(+) 25

Hình 2.1: Mô hình phản ứng Western blot 44

Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose 46

Hình3.2 Điện di sản phẩm PCR của gen pagA trên gel 0,8% agarose 46

Hình 3.3 Khuẩn lạc E coli DH5α trên môi trường LBA chứa X - gal và ampicillin 47

Hình 3.4 Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel 0,8 % agarose 48

Hình 3.5 Điện di sản phẩm cắt bằng EcoRI trên gel 1,5% agarose 49

Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng dòng 1, 10 bằng enzyme BamHI và XhoI trên gel 1 % agarose 50

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 và BA2 từ các dòng khuẩn lạc 1,2 trên gel 0,8% agarose 51

Hình 3.8 So sánh trình tự gen pagA của chủng B anthracis VCM1167 với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế 52

Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA 54

Hình 3.10 Điện di sau khi thôi gel trên gel 1% agarose 55

Hình 3.11 Khuẩn lạc của E coli DH5α trên môi trường LBA 55

Hình 3.12 Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E coli DH5a trên gel 1 % agarose 56

Hình 3.13 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose 56

Hình 3.14 Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose 57

Hình 3.15 Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết 58

Hình 3.16 Khuẩn lạc của vi khuẩn E coli chủng BL21 trên môi trường LBA 58

Hình 3.17 Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide 59 Hình 3.18 Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 % polyacrylamide 60

Hình 3.19 Điện di biểu hiện protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG 61

Hình 3.20 Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide 62

Hình 3.21 Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide 63

Hình 3.22 Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide 64

Hình 3.22a Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF 65

Hình 3.22b Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể kháng PA trên màng lai PVDF 65

Hình 3.22c Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng PA tự nhiên 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm Nó mang một số đặc điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng

Kháng nguyên tái tổ hợp Protective Antigen (PA) là một trong 3 loại

độc tố than của vi khuẩn Bacillus anthracis PA là nhân tố quyết định tính độc

của vi khuẩn than Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết Lethal Factor (LF) hay nhân tố gây phù thũng Edema Factor (EF) lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ Ngoài ra, PA còn

có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than Chính vì vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than cũng như tạo vaccine phòng chống bệnh than

Xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu

biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis trong vi khuẩn E coli BL21”

Mục tiêu của đề tài:

1 Biểu hiện Protein PA của vi khuần Bacillus anthracis trong vi khuẩn

E coli BL21,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2 Thu nhận kháng nguyên bảo vệ PA tái tổ hợp phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Tách dòng và giải trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA,

2 Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA,

3 Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn E coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA,

4 Nghiên cứu tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng (IPTG), thời gian,

5 Tinh sạch được protein PA trên cột sắc ký ái lực Probond Nikel Resin,

6 Kiểm tra khả năng phản ứng của protein PA tái tổ hợp với kháng thể đặc hiệu kháng PA bằng phản ứng Western blot

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về bệnh than

1.1.1 Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than

Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đã gây ra những thiệt hại vô

cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng như làm ảnh hưởng tới sức

khoẻ con người Vì thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm họa

đen, vì khi bị nhiễm bệnh, vết thương có màu đen [1] “Bệnh than” bắt nguồn

từ Hy Lạp “Anthrakos” nghĩa là than, do vết thương trên da có màu đen Bệnh

than được tìm ra bởi John Bell vào cuối thế kỷ 15

Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguồn gốc của bệnh than và quá

trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis (B anthracis)

Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất

định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi

Bệnh thường gặp ở những động vật ăn cỏ như: cừu, dê, ngựa, trâu bò Đặc

biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người nên được coi là mối hiểm họa đe doạ

cho sức khoẻ cộng đồng

Trận dịch than được biết đến đầu tiên trong lịch sử xảy ra năm 1500

trước Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập

Năm 1491 trước Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh than ở Ai

Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện bệnh than

Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga) Những năm 1960, bệnh than đã làm chết khoảng 60.000 gia súc ở

Châu Âu

Tháng 4 năm 1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua, xảy ra

một trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 người [18] Sau đó vài năm, một

trận dịch tương tự xảy ra ở Paraguay

Năm 1978 – 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm hơn 6.000

người bị nhiễm bệnh và 100 người chết

Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch than lớn Người

ta phải giết 4.492 con gia súc bị nhiễm than và áp dụng các biện pháp sát trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị, đường sá, đất đai bằng fomalin

Sau sự kiện ngày 11/9/2001, bọn khủng bố sinh học đã dùng bào tử của

vi khuẩn B anthracis tấn công một số bưu điện của Mỹ bằng các phong bì thư

làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh [1]

Trận dịch than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh

Ở Việt Nam, bệnh than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng ít được thông báo Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, năm 1997

có 30 người mắc bệnh than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58 người Riêng năm 2000 có 27 người mắc bệnh than, trong đó có 12 ca ở Cao Bằng,

11 ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào bị tử vong Tháng 5/2008 ở Điện Biên có 22 người mắc bệnh nhưng không có ai bị tử vong Từ tháng 6 đến nay, tại huyện Mèo Vạc, Hà Giang đã xảy ra các vụ trâu

bò, lợn, dê chết Người dân đã ăn thịt các gia súc này và kết quả xét nghiệm của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương kết luận có 13 ca nghi nhiễm mắc bệnh than, một người đã tử vong [32]

Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền núi chăn nuôi gia súc lớn như Thanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2] Đối với các trường hợp mắc bệnh than ở nước ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn

cỏ như trâu, bò, những người làm nghề thuộc da chế biến xương

Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da, qua đường tiêu hoá và đường hô hấp Bệnh than có thể biến chứng thành thể than màng não nếu hít vào bào tử than Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà người ta chia bệnh than thành 4 thể than khác nhau: than da, than tiêu hoá, than hô hấp, than màng não [19]

1.1.2.1 Bệnh than thể da

Đây là hình thức than phổ biến nhất chiếm hơn 95 % và là loại bệnh có khả năng điều trị Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã

bị nhiễm than, thường là những người nông dân, bác sĩ thú y, người giết mổ

gia súc hay thịt Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B anthracis có thể xâm nhập và gây bệnh

Triệu chứng của bệnh: sau 1 – 2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn ngứa như côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu hoại tử trong vùng tâm Sau 2 – 3 ngày sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị trí nhiễm, xung quanh xuất hiện các mụn nước Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết loét

sẽ xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy Trong khoảng 1 – 2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng lên Sau đó vùng thương tổn sẽ chuyển sang dạng tự phát Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu

làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi Than da gây tử vong khoảng 20 % các trường hợp không được điều trị kịp thời

1.1.2.2 Bệnh than thể tiêu hoá

Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm bào tử than mà không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì khả năng gây bệnh vẫn cao [2] Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột của bệnh nhân mắc bệnh than Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những vị trí thương tổn của màng ngoài ruột và dạ dày Từ những vị trí này sẽ xuất hiện những vết loét, lan rộng và lan vào hệ bạch huyết Bệnh than tiêu hoá thường ít gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao Bệnh thường có hai thể lâm sàng [11]:

– Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận biết là có thương tổn xuất huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao Sau đó là các triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong Bệnh nhân có thể viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu bạch huyết Sau 2– 3 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong

– Thể họng, miệng: tại vùng thương tổn thấy xuất hiện hoại tử ở vùng vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch

của bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa

vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu và đa số dẫn đến tử vong Dạng than này có

tỷ lệ tử vong cao chiếm 50 % mặc dù có được điều trị

1.1.2.3 Bệnh than hô hấp

Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than Sau khi vào cơ thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng như ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn ra máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai triệu chứng trên Một số nang lympho của đường tiêu hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến chứng sang thể màng não gây xuất huyết Đa số bệnh nhân đều tử vong trong khoảng 1– 2 ngày kể từ khi phát bệnh Tỷ lệ tử vong của bệnh than này rất cao

1.1.2.4 Bệnh than thể màng não

Bệnh thường do biến chứng từ ba thể than trên Than màng não xuất

hiện khi vi khuẩn B anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương

theo đường máu và các mạch bạch huyết Triệu chứng của bệnh là thường sốt cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn, lên cơn mê sảng khi phát bệnh và

Hình 1.3: Phổi bị nhiễm bệnh than

dẫn đến hôn mê Đa số bệnh nhân thường dẫn đến tử vong sau 1– 2 ngày kể

từ khi mắc bệnh Thể than này có tỷ lệ tử vong rất cao, thường là 100%

1.1.3 Bệnh than và chiến tranh sinh học

Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời nó dễ chuẩn bị

và phát tán nhanh nên đã được sử dụng như một loại vũ khí sinh học làm tê

liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia

Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng như một thứ vũ khí vô cùng lợi hại Một vài nước như Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq và Liên Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện của chiến tranh

Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để cung cấp cho các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất

Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Mãn Châu Lý (Trung Quốc)

Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ khí bệnh than

ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland

Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than Sau chiến tranh thế giới thứ hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick, Maryland

Hình1 4: Não của người bị nhiễm bệnh

than

Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến các bưu điện Mỹ làm 5 người chết, và 17 người bị nhiễm bệnh Sự kiện này

đã làm đau đầu các nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô

la cho việc tiêm phòng vaccine

Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh

Trước tình hình chính trị bất ổn như hiện nay thì nguy cơ xảy ra chiến tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn Vì vậy chúng ta cần phải nghiên cứu kỹ

về tác nhân và cơ chế gây bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ lúc nào

1.2 Tác nhân gây bệnh than

Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than được nhà nghiên cứu

người Đức Pallender phát hiện ra tác nhân là vi khuẩn B anthracis

Năm 1950, ông Daven, nhà nghiên cứu người Pháp cũng tìm ra tác nhân

gây bệnh là B anthracis Nhiều năm trước đó, cũng có nhiều nhà khoa học

nghiên cứu kỹ hơn về loại vi khuẩn này như Kock và cộng sự (1876), Pasteur

và cộng sự (1877), Xenkovck và cộng sự (1883) Năm 1877, Kock đã nuôi

cấy vi khuẩn B anthracis trên môi trường tinh khiết và chứng minh nó có khả

năng hình thành bào tử và có thể gây chết cho động vật Ông đã chứng minh

sự có mặt của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi bệnh than

Năm 1822 – 1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào tử B anthracis ở

nơi chôn xác động vật bị chết bởi bệnh than

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus anthracis

Vi khuẩn B anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus, tồn tại trong đất, nước và không khí B anthracis là vi khuẩn Gram dương sinh bào tử (trong

điều kiện kị khí hay kị khí không bắt buộc) không có lông roi nên không có khả năng di động Kích thước tế bào từ 3 – 5 m, rộng từ 1 – 2 m Tế bào hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài hoặc chỉ vài tế bào nối với nhau [19]

Bào tử B anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước

khoảng từ 1 – 1,5 m, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào thời kỳ cuối của pha sinh trưởng logarit [13]

Khuẩn lạc B anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi, dính, ướt, đường kính 3 – 5 mm [5]

Điều kiện thích hợp cho B Anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ

Hình 1.5: Hình thái tế bào (A) và bào tử (B) của vi khuẩn B anthracis

bệnh và chết Bào tử B anthracis có khả năng chống chịu với điều kiện khắc

nghiệt của ngoại cảnh rất tốt, vì vậy nó được sử dụng như một thứ vũ khí lợi hại trong chiến tranh và khủng bố

1.2.2 Độc tố của vi khuẩn B anthracis

Các độc tố của vi khuẩn B anthracis bao gồm độc tố vỏ nhày và các độc tố than Độc tố vỏ nhày bản chất là acid poly – – D – glutamic, đã được

mã hoá bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb) Các

độc tố than bao gồm kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen), nhân tố gây chết LF (Lethal factor), nhân tố gây phù thũng EF (Edema factor) Các

độc tố than lần lượt được mã hoá bởi các gen pagA, lef và cya, các gen này

nằm trên plasmid pX01 (185kb) [7, 13]

1.2.2.1 Độc tố vỏ nhày

Độc tố vỏ nhày hay vỏ capsulee có bản chất là acid poly – – D –

glutamic trong khi vỏ capsulee của hầu hết các loài vi khuẩn khác lại có bản

chất polysaccharides Độc tố vỏ nhày có trọng lượng phân tử là 215 kDa ở

trong tế bào và ở ngoài tế bào là 20 – 55 kDa Nó được mã hoá bởi các gen

cap nằm trên plasmid pXO2 có trọng lượng phân tử là 95kb [19, 20]

Tất cả các dòng độc của B anthracis đều tạo ra vỏ nhày Vỏ nhày giúp cho vi khuẩn B anthracis tránh được sự bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật

chủ và kích thích gây nhiễm trùng Vỏ nhày ức chế đại thực bào và gây ra đáp ứng miễn dịch yếu Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm tăng tính độc của vi khuẩn bệnh than Thông thường các khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các

khuẩn lạc nhẵn [19]

Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng thông thường Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết

khí [11] Bản thân chuỗi poly – – D – glutamic không gây độc nhưng có

chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh

và bạch huyết, chống lại hiện tượng thực bào Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của bệnh [11]

1.2.2.2 Độc tố than

Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh ở cả giai đoạn đầu của bệnh cũng như trong suốt quá trình phát triển của bệnh [8] Độc tố than bao gồm 3 thành phần: kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây phù thũng EF và nhân tố gây chết LF

1.2.2.2.1 Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen – PA)

Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83kDa, bao

tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong quá trình nhiễm bệnh [19, 20]

Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid

pXO1 Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết

LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc lực

1.2.2.2.2 Tác nhân gây phù thũng (Edema factor – EF)

EF được coi như một enzyme Adenylate Cyclase (AC), có trọng lượng

phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc acid amin Nó có chức năng chuyển hoá ATP nội bào thành cAMP, quá trình này được thực hiện khi EF kết hợp với Calmodulin (CaM – là một thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn) [16, 19] EF phụ thuộc Calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24 acid amin (303 – 339) mang vị trí gắn ATP Trình tự này có liên quan đến quá trình xúc tác EF có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào

pH, không giống như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được chuyển vào trong tế bào chất [19] Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế bào vật chủ, độc tố EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng enzym và dẫn đến làm mất tính thấm của tế bào vật chủ Dịch tế bào bị dồn ứ

Hình 1.6: Nhân tố gây chết EF

và gây nên hiện tượng trương bào, màng tế bào căng ra mọng nước, đây chính

là nguyên nhân gây phù thũng ở tế bào vật chủ [16]

Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi ít nhất 3 vùng chức năng riêng biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi phần enzyme của EF với CaM và adennosine 5’– α – β – Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất,

nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ

1.2.2.2.3 Nhân tố gây chết (Lethal factor – LF)

Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng

phân từ 90kDa, được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B anthracis

tiết ra [19]

LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt động Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính

với LF Vì thế, LF được coi là một

metalloprotease kẽm [9] Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen Activated Protein Kinase – MAPKs) [19] Sự đột biến ở vùng xúc tác của LF

sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hưởng đến sự phân bào [7]

Hình 1.7: Nhân tố gây chết LF

sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokine trong đại thực bào và tế bào bạch huyết [16] Đây chính là nguyên nhân gây phá huỷ đại thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của

chế sự tổng hợp các đại phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch LF phong toả hệ thống báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc biệt của tế bào, vùng metalloprotease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào làm cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn dịch về sự xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ

1.2.3 Bi u hiện của các gen gây độc trong vi khuẩn B anthracis

Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch

mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA Gen acpA nằm trên plasmind pXO2 hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (một trong các gen mã hoá vỏ capsulee) Gen atxA nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen capB và các gen mã hoá protein độc tố pagA, lef và cya Gen atxA là nhân tố điều hoà

dương cho sự hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen độc tố Sự hoạt hoá này phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO2/bicarbonate cao Ngoài ra

atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [19]

Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, người ta tiến hành gây đột biến để tạo một thể đột biến atxA Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển như nhau Nhưng trên

môi trường nghèo dinh dưỡng như môi trường tổng hợp XO hoặc các môi trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng Sterne (pXO1+

hơn so với chủng gốc Như vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng

hợp vỏ capsulee có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hoá vỏ capsulee Đồng

thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử Thể đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, còn các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA

nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì không có đặc tính trên Điều đó thể hiện

sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [14]

Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy một gen pag kích thước 300 bp, nó cùng được dịch mã xuôi chiều với gen pagA Gen pagR mã hoá cho một protein có trình tự acid amin giống các

tác nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác Gen pagR ức chế sự

biểu hiện của gen acpA và atxA Ngoài ra, gen pagR còn điều khiển sự biểu hiện của một vài tổ hợp phiên mã promoter – lacZ được hoạt hoá bởi

CO2/atxA Sự điều hoà những tổ hợp này cùng với gen pagA và pagR có thể phụ thuộc vào sự thay đổi mức độ atxA hoặc không phụ thuộc vào sự biểu hiện của atxA [14]

Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsulee tăng lên khi tế

nếu nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [13]

Hai nhân tố là CO2/bicarbonate và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều

môi trường đã được đậy kín Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ

37 oC cũng nhiều hơn khi ủ ở 28 o

C [13, 15]

Như vậy quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá

vỏ capsulee trong vi khuẩn B anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều

cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [7, 19, 20]

1.3 Kháng nguyên bảo vệ PA

1.3.1 Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA

Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây

độc của vi khuẩn B anthracis Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa,

nguyên bảo vệ PA do gen pagA mã hoá, gen này nằm trên plasmid pXO1

(185 kb) [19, 20]

Mặc dù bản thân PA không gây độc nhưng nó lại có khả năng truyền dẫn các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ PA83 có khả năng kết hợp với thụ thể trên bề mặt tế bào Dưới tác dụng của protease nội bào họ furin, PA83

sẽ bị phân tách thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết với LF

và EF [19, 20] Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA Các nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí phân cắt này thì không có khả năng gây độc Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên kết với nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh Khi vòng heptam kết hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với nhân tố EF sẽ gây phù thũng cho tế bào vật chủ Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp gây độc cho tế bào vật chủ làm tăng hiệu quả gây độc của nhân tố gây chết và phù thũng [19, 20]

Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than Người

ta đã nghiên cứu khả năng kích thích gây đáp ứng miễn dịch của nhiều kháng

nguyên vi khuẩn B anthracis như vỏ capsulee, S – layer hay các protein khác,

kết quả cho thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng

kích thích miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9]

Kháng thể PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào vật chủ hoặc phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83 Chính nhờ vai trò dẫn truyền quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều

nghiên cứu chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than cũng như các nghiên cứu sản xuất vaccine sử dụng nguyên liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp

1.3.2 Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA

Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid anim (83 kDa) Nó có trình tự tương đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase như:

thể nhân B của Clostridium botulinum C2 (33 % tương đồng), Clostridium difficile cdt (35 % tương đồng), Clostridium perfingens iota – toxin – 1b (34

% tương đồng), Clostridium spiroforme Sb (33 % tương đồng) và protein VIP1 của Bacillus cereus (27 % đồng nhất) Các con số này nhằm giải thích

cấu trúc bậc 2, 3, 4 của phân tử PA Nhưng trình tự tương đồng giữa PA và họ độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase không bao gồm vùng IV, điều này chỉ ra sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố [20]

Kháng nguyên bảo vệ PA được tạo thành bởi các cấu trúc đối song

Vùng I (1 – 249): Cấu trúc xoắn , vùng này chứa 2 ion Ca2+ và một vị trí hoạt hoá phân giải của các protease Sau khi PA được hoạt hoá bởi protease nội bào, nó sẽ giải phóng ra mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh PA63 Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7

Hình 1.8: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA

cấu trúc này tan trong nước và xâm nhiễm vào trong tế bào vật chủ [20]

Vùng II (250 – 487): là một rỗng chứa một cấu trúc như cái móc lớn

và linh hoạt Vùng này liên quan đến sự hình thành vòng heptam [19] Nó chứa một vòng xoắn lớn linh hoạt (302 – 325) liên quan đến sự hình thành lỗ màng Ở pH thấp, heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ Ngoài ra, vùng này còn có liên quan đến sự sắp xếp lại 7 vòng xoắn của

heptam để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi liên kết với màng Vòng này có

điểm cắt cho chymotrysin (Phe313 – Phe314) hai gốc này còn có liên quan tới sự vận chuyển EF và LF vào trong tế bào chất Vòng heptam hình thành nên kênh chọn lọc trong màng nhân tạo cũng như màng tế bào [19]

Vùng III (488 – 594): là vùng nhỏ nhất có cấu trúc kiểu gấp nếp

[20] Vùng này chứa một lõi kị nước (282 – 328) gồm 101 acid amin của 5 trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và dường như được tạo ra thông qua quá trình

sao chép Vùng này bao gồm 4 tấm bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ

và 1 khe tương tự như ở ferredoxins và vùng A của độc tố gây hội chứng shock độc 1 [20] Vùng này liên quan đến sự tương tác giữa các protein với nhau Có nghiên cứu cho rằng vùng III liên quan đến quá trình

nửa gắn với enzyme thuỷ phân [19]

Vùng IV (595 – 735): đây là vùng liên kết với thụ thể và chứa vị trí

epitop quyết định kháng nguyên của PA [19, 20] Vùng này đã được chứng minh là có khả năng gây đáp ứng miễn dịch Nó gồm hai vùng là vòng xoắn lớn (704 – 723) và vòng xoắn nhỏ (679 – 693), trong đó chỉ có vòng xoắn nhỏ

là có trình tự liên kết với thụ thể Ngoài ra còn có các gốc ở cuối đầu C tham gia hỗ trợ cho việc liên kết Nếu loại bỏ 2 phần là đầu C và vòng xoắn nhỏ sẽ

làm giảm tính độc bằng cách ức chế sự liên kết của PA với thụ thể [19]

Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam có 7 nhánh Cấu trúc

thũng EF để gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ

1.3.3 Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA

Sự phân cắt PA83 thành PA63 và PA20 là một bước then chốt trong quá trình gây độc bởi vì sự mất đi của PA20 sẽ làm lộ ra vị trí liên kết của

PA với hai nhân tố là EF và/hoặc LF Đồng thời nó làm giảm sự cản trở

Hình 1.10: Cơ chế dẫn truyền độc tố của kháng nguyên bảo vệ PA (1) PA liên kết với thụ thể bề mặt tế bào, enzyme nội bào phân cắt PA tạo PA20 và PA63

(2) PA đã được phân cắt hình thành heptam (PA63) 7 , EF hoặcLF liên kết vào heptam tạo phức hợp xâm nhập vào nang có tính acid

(3) Phức hợp giải phóng EF hoặc LF vào phần bào tan

Hình 1.9: Cấu trúc vòng heptam của kháng nguyên bảo vệ PA

của không gian lập thể và ngăn cản sự oligomer Sự phân cắt protein có thể hoàn thành trong cơ thể với nồng độ trypsin thấp Trypsin phân cắt ở Arg167 được chứng minh bởi trình tự N cuối và có một giả thuyết đưa ra rằng sự phân cắt trong cơ thể xảy ra ở gần nhau hoặc cùng một vị trí Để kiểm tra giả thuyết này, PA được biến đổi chút ít với việc cắt bỏ từ vị trí

163 đến 168, phân tử này không bị phân cắt bởi trypsin hoặc protease trong

cơ thể và hoàn toàn không gây độc tế bào khi tiếp xúc với LF Vị trí này

– Lys165 – Lys166 – Arg167 Đây

là bằng chứng thể hiện endoprotease furin phân cắt cùng một vị trí của Arg – X – Lys/ Arg – Arg, giả thuyết đưa ra rằng furin có khả năng phân cắt

PA Trong thực tế việc phân cắt PA của furin được quan sát trong ống nghiệm và chất ức chế furin ngăn chặn sự phân cắt của liên kết thụ thể với kháng nguyên bảo vệ PA trên bề mặt tế bào

Đầu tiên các protease furin sẽ hoạt hoá các protein thuỷ phân trên bề mặt tế bào của vùng I của PA83 và giải phóng ra mảnh PA20 (20 kDa) ở đầu

N [7] Mảnh PA20 (1 – 157) không có vai trò quan trọng trong sự gây độc và

bị phân giải trong môi trường Phần chính của vùng I (168 – 258) hình thành trên đầu N của mảnh PA63 hoạt động và bộc lộ vị trí liên kết trên PA63 với nhân tố gây chết và hoặc nhân tố gây phù thũng Sau đó, các mảnh PA63 liên kết lại với nhau tạo thành vòng heptam có 7 nhánh Cấu trúc heptam này hoà tan trong nước ở pH trung tính hoặc kiềm, vì thế có thể cài lên màng tế bào có

pH acid hình thành nên các kênh cation chọn lọc trong màng kép lipid nhân tạo và màng tế bào Do vòng heptam này tan trong nước nên nó hình thành một vòng lõm có đường kính 160 Å cao 85 Å [20] Mỗi phân tử PA63 có khả

EF xâm nhập vào đại thực bào thông qua cơ chế thẩm bào trung gian thụ thể

(receptor – mediated endocytosis) Phức hợp này được chuyển vào trong một

nang có tính acid để duy trì hoạt tính và ức chế sự acid hoá của endosome,

cùng với bề mặt có tính acid của kênh truyền dẫn, cho phép nhân tố EF và LF

đi vào bên trong tế bào chất để sinh sản độc tố gây phù thũng và độc tố gây chết [19, 20]

1.4 Gen mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA

Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen cấu trúc pagA nằm trên

plasmid pXO1 Kháng nguyên bảo vệ PA bản thân nó không có độc nhưng nó

được coi là một thành phần quan trọng của vi khuẩn B anthracis trong quá

trình gây bệnh vì nó là nhân tố dẫn truyền trung có khả năng liên kết với EF hoặc LF để gây độc Đặc biệt, trên bề mặt PA có vị trí liên kết với kháng nguyên, do đó mà có khả năng gây đáp ứng miễn dịch

Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính di truyền cũng như đặc điểm

PA người ta có thể ứng dụng để sản xuất protein PA sử dụng trong tạo vaccine phòng bệnh than Đồng thời cũng có thể hiểu rõ hơn vai trò của những vùng chức năng khác nhau của PA trong quá trình gắn lên màng tế bào đích để đưa các nhân tố gây độc LF và EF vào bên trong tế bào chất

gây ra hiệu quả độc tố [28]

Gen mã hoá cho kháng nguyên bảo vệ PA là gen pagA nằm trên plasmid pXO1 Theo tài liệu nghiên cứu trên thế giới, gen pagA có khung đọc

mở (ORF) dài 2319 codon, trong đó đoạn có kích thước 2205 bp mã hoá cho

735 acid amin của PA hoàn chỉnh PA83 Trước vùng mã hoá protein này có

29 codon mã hoá chuỗi peptide tín hiệu có đặc tính tương tự ở những protein

khác do B anthracis tiết ra Chúng đều tích điện âm, có đầu cuối N gồm 5

acid amin (Met – Lys – Lys – Arg – Lys), vùng kỵ nước trung tâm (6 – 21), gốc alanine [28]

Thành phần base của gen pagA có tỷ lệ A + T cao, chiếm 69 %, trong

đó, A = 39 %, T= 30 %, G = 17 %, C = 14 % Thành phần base này khác với những gen mã hoá protein ở những vi khuẩn khác Gen cấu trúc của protein hoàn chỉnh PA83 bắt đầu từ vị trí nt 1891, đứng trước vị trí này là 2 codon mở

đầu ATG (mã hoá cho acid amin methionine) nằm ở vị trí nt 1834 và 1804 Gen mã hoá PA83 không có codon mã hoá cystein

Khi nghiên cứu 26 chủng B anthracis khác nhau thì thấy xuất hiện 5

đột biến điểm, trong đó có 2 đột biến làm biến đổi acid amin và 3 đột biến cùng nghĩa Theo lý thuyết, tỷ lệ đột biến làm biến đổi acid amin so với đột biến cùng nghĩa là 1: 5 Tuy nhiên ở đây tỷ lệ này lớn hơn Những đột biến làm biến đổi acid amin nằm ở vùng có tính kháng nguyên cao, nằm ngang phần giao nhau của vùng III và IV ảnh hưởng tới vùng liên kết với LF [21]

1.5 Biểu hiện gen pagA

1.5.1 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện gen (expression vector) là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng tạo nên các protein lai [4]

Hình 1.11: Vector biểu hiện

Vector biểu hiện mạnh là các vector có các đặc điểm:

- Có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ

- Promoter hoạt động mạnh

- Dịch mã tạo nhiều protein lai

- Đoạn trình tự MCS (Multiple cloning site) có nhiều vị trí cắt đặc hiệu của nhiều loại enzym giới hạn

- Vector vẫn giữ được hoạt tính khi cài gắn gen tách dòng có kích thước lớn

- Hoạt động của vector không ảnh hưởng hoặc gây ức chế tế bào chủ

- Gen chỉ thị dễ dàng nhận biết

Để có thể thu nhận protein tái tổ hợp thì gen mã hoá cho protein phải đựơc gắn vào vectơ biểu hiện Có rất nhiều hệ vectơ biểu hiện tương ứng với nhiều loại tế bào biểu hiện khác nhau Dựa trên những đặc điểm của vector

biểu hiện đã nêu trên, để biểu hiện gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA

chúng tôi sử dụng vectơ pET-TRX (pET-TRX Fusion Expression Vector System) làm vectơ biểu hiện

Vectơ pET-TRX có kích thước khoảng 5800bp, được thiết kế dựa trên

cơ sở của vectơ pET-28a(+) nhưng được gắn thêm đoạn gen mã hoá cho protein Thioredoxin với mục đích làm tăng tính hoà tan của protein tái tổ hợp,

có vị trí gắn của T7 promoter, vùng Lac Operator là vị trí nhận biết và gắn các protein điều hoà giúp cho quá trình điều hoà hoạt động của gen, vùng cắt gắn

đa vị chứa vị trí cắt của các enzym giới hạn Một đuôi gồm 6 Histidine có vai trò trong việc tinh sạch protein tái tổ hợp, vị trí T7 terminator kết thúc quá trình dịch mã Vùng nhận biết gồm gen kháng kháng sinh là kanamycin giúp cho việc chọn lọc chính xác dòng plasmid tái tổ hợp

Hình 1.12: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pET-28a(+)

1.5.2 Lựa chọn chủng biểu hiện

Có rất nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau như biểu hiện gen bằng hệ

biểu hiện nấm men, B subtilis, Baculovirus, E coli hay biểu hiện trong tế bào

động vật bậc cao…

Khi sử dụng hệ biểu hiện nấm men các protein tái tổ hợp thường được tiết

ra ngoài môi trường rất hiệu quả, có độ tinh sạch cao và đảm bảo hoạt tính sinh học của chúng Nhưng ở nấm men có hiện tượng glycosyl hoá làm ảnh hưởng tới một số hoạt tính của protein Nấm men biểu hiện tốt và tiết ra tốt các sản phẩm của gen có nguồn gốc từ động vật, thực vật bậc cao, nấm nhưng không tiết

ra tốt các sản phẩm của gen có nguồn gốc từ vi khuẩn ra ngoài môi trường

Khác với hệ biểu hiện nấm men, sử dụng hệ thống biểu hiện E coli sẽ tránh được hiện tượng glycosyl hoá Biểu hiện E coli hệ thống biểu hiện E coli có rất nhiều ưu điểm hơn hẳn các hệ thống biểu hiện khác như [4]:

- Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein

tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l

- Biểu hiện gen trong tế bào E coli có thể giảm được các chi phí cho

công nghệ và hoá chất, nên giá thành sản phẩm hạ

- Cấu trúc bộ gen E coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương

đối đầy đủ

- Có rất nhiều chủng vi khuẩn E coli được sử dụng trong biểu hiện gen trong đó chủng E coli BL21 là một trong những chủng E coli được ưa

chuộng và sử dụng rộng rãi để biểu hiện nhiều loại gen khác nhau

Tuy nhiên sử dụng vi khuẩn E coli làm tế bào chủ trong biểu hiện gen

có một số hạn chế sau:

- Các gen mã hoá các loại protein có kích thước lớn hơn 50 kD, protein giàu cystein (ví dụ như gen mã hoá plasminogen) hoặc những sản phẩm protein có sự hình thành nhiều liên kết disunfua (S - S) rất khó khi biểu hiện

gen trong tế bào E coli

- Tế bào E coli có thể cho biểu hiện tốt các loại protein không biến đổi

cấu trúc phân tử sau dịch mã và không có quá trình glycosyl hoá

- Một số chủng vi khuẩn E coli có thể gây bệnh hoặc tạo các độc tố khi

biểu hiện gen của sinh vật bậc cao

- Mặt khác, khả năng tạo và tiết protein ngoại bào của các chủng vi

khuẩn E coli tương đối thấp

1.5.3 Phương pháp biểu hiện

Để biểu hiện gen pagA, đầu tiên người ta phải tách dòng gen pagA và

đem cài gen đã được tách dòng này vào một vector biểu hiện Để cho các gen tách dòng được biểu hiện mạnh mẽ, phải lựa chọn các tế bào vật chủ phù hợp các tiêu chuẩn sau [4]:

Trong thực nghiệm tách dòng gen, người ta thường chọn hai loại tế bào

vật chủ là vi khuẩn E coli và nấm men Đây là hai đối tượng có khả năng

biểu hiện gen mạnh nhất

Quá trình biểu hiện gen bao gồm một số bước chung như sau:

Bước 2: Dựa vào trình tự gen, thiết kế các đoạn mồi để nhân gen Tổng hợp đoạn mồi

Bước 3: Chuẩn bị DNA khuôn để nhân gen

Bước 4: Nhân gen bằng PCR từ DNA hệ gien của vi khuẩn hoặc từ ngân hàng DNA nhưng tốt nhất là nhân gen trực tiếp từ chính plasmid mang gen đã từng dùng để đọc trình tự gen đó

Bước 5: Đưa gen vào vecto tách dòng và biến nạp vào tế bào E coli

DH5α để khuyếch đại dòng gen

Bước 6: Tách plamid từ các thể biến nạp E.coli DH5α Kiểm tra gen

trong vector tách dòng bằng enzym hạn chế

Bước 7: Đưa gen vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E coli

DH5α

Bước 8: Tách plasmid từ các thể biến nạp trong E coli và kiểm tra gen

và đặc biệt là chiều của gen trong vector biểu hiện Gen cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của promoter

Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gen vào tế bào chủ E coli

và tiến hành biểu hiện

Sau khi tiến hành biểu hiện thành công, tiến hành điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid và tinh sạch protein

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Vi sinh vật: Chủng vi khuẩn B.anthracis VCM1167 nhận từ phòng Di

truyền vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

nhận từ phòng Di truyền vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cặp mồi sử dụng để nhân đoạn gen pagA được thiết kế dựa trên trình

tự của gen pagA đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (số đăng ký

M22589), được tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự như sau:

Mồi sử dụng để đọc trình tự gen pagA có trình tự như sau:

M13- F: 5' CAG GAA ACA GCT ATG 3'

M13- R: 5' GTA AAA CGA CGG CCA 3'

PA2- F: 5’ ATA AGT AAA AAT ACT TCT ACA AGT AGG ACA C 3'

TA Cloning Kit: Vector pCR2.1 (Invitrogen)

Plasmid mang vector biểu hiện pET - TRX - FUS nhận từ phòng Vi sinh Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

Kit thôi gel (Invitrogen)

Kit tinh sạch protein (Cột sắc kí ái lực Niken Probond, Invitrogen)

2.2 Hoá chất và môi trường

2.2.1 Hoá chất, dung dịch

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử được mua từ các

hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio- Rad, bao gồm: dNTP, Taq polymerase,

agarose 1%, polyacrylamide, marker, ethidium bromide, protease, RNAse, axid acetic, kháng sinh Kanamycin, IPTG, enzym, Chloroform…

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật bao gồm: cao nấm men, cao thịt, trypton, agar, glucose, NaCl…

Tris base 15,14 g Glycine 72,1 g SDS 20% 25 ml

Coomasive Brilliant Blue 0,25 g Dung dịch tẩy màu 100 ml