Nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

MỞ ĐẦU Tăng sản thượng thận bẩm sinh TSTTBS Congenital Adrenal Hyperplasia – CAH là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi sự thiếu hụt một trong số các enzym

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘT BIẾN

TRÊN GEN CYP11B1

Ở NGƯỜI BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iv

MỞ ĐẦU - 1

I TỔNG QUAN - 3

1.1 Hormone tuyến thƣợng thận - 3

1.1.1 Tuyến thượng thận - 3

1.1.2 Q - 4

1.1.3 Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase - 7

1.2 Cytochrome P450 - 8

1.2.1 Vai trò và chức năng - 8

1.2.2 Cấu trúc không gian cytochrome P450 - 10

1.3 Gen CYP11B1 - 11

1.3.1 Cấu trúc và chức năng - 11

1.3.2 Cấu trúc không gian của CYP11B1 - 12

1.4 Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS) - 14

1.4.1 Khái niệm - 14

1.4.2 Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase - 14

1.4.2.1.Cơ chế gây bệnh - 14

1.4.2.2 Biểu hiện lâm sàng - 15

1.4.2.3 Cơ sở di truyền - 16

1.4.3 Tăng sản thượng thận bẩm sinh do nguyên nhân khác - 16

1.5 C - 18

1.5.1 Chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh - 18

1.5.2 Điều trị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh - 19

1.6 Tình hình nghiên cứu - 20

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu - 26

2.1.1 Bệnh nhân - 26

2.1.2 Hóa chất - 26

2.1.3 Thiết bị - 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu - 28

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số - 28

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose - 28

2.2.3 Đo quang phổ DNA - 29

2.2.4 Nhân gen bằng kĩ thuật PCR - 29

- 30

2.2.6 Giải trình tự gen tự động trên máy - 30

2.2.7 Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis) - 31

2.2.8 Biểu hiện trong tế bào COS-1 và phân tích hoạt tính enzyme - 31

2.2.9 Phân tích trình tự gen trên phần mềm tin học - 32

PHẦN III: KẾT QUẢ - 33

3.1 Tách DNA tổng số - 33

3.2 Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế - 34

3.3 Khuếch đại đoạn gen CYP11B1 - 35

3.4 Phân tích ảnh hưởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân - 38

3.4.1 Bệnh nhân 01 - 38

3.4.1.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh - 38

3.4.1.2 Phân tích trình tự phát hiện đột biến - 39

3.4.1.3 Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật - 40

3.4.2 Bệnh nhân 02 - 42

3.4.2.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh - 42

3.4.2.2 Phân tích trình tự phát hiện đột biến - 43

3.4.2.3 Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật - 44

3.4.3 Bệnh nhân 03 - 46

3.4.3.1 Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh - 46

3.4.3.2 Phân tích trình tự phát hiện đột biến - 47

3.5 Phân tích cấu trúc - 48

3.5.1 So sánh trình tự amino acid của CYP11B1 - 48

3.5.2 Mô hình cấu trúc 3D của các đột biến điểm trên CYP11B1 - 53

3.5.2.1 Mô hình cấu trúc không gian của CYP11B1 - 53

3.5.2.2 Đột biến R51K - 54

3.5.2.3 Đột biến E147D - 55

3.5.2.4 Đột biến N152K - 56

IV THẢO LUẬN - 58

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 66

4.1 Kết luận - 66

4.2 Kiến nghị - 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 67

MỞ ĐẦU

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital Adrenal Hyperplasia – CAH) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi sự thiếu hụt một trong số các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp hormone của vỏ thượng thận Trong đó, thiếu hụt 21-hydroxylase chiếm 90-95%, 11β-hydroxylase chiếm từ 5-8% các trường hợp trẻ đẻ sống và rất hiếm gặp trường hợp thiếu hụt 3β-hydroxysteroid dehydrogenase Bệnh TSTTBS là bệnh di truyền với các dấu hiệu suy thượng thận cấp

có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức năng sinh dục, sinh sản và tâm lý

Hiện nay, sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã góp phần quan trọng đưa đến nhiều thành công trong lĩnh vực

nghiên cứu các bệnh di truyền người Phân tích đột biến gen CYP21A2 mã hóa cho hydroxylase và đột biến gen CYP11B1 mã hóa 11β-hydroxylase có vai trò quan trọng

21-trong việc khẳng định chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh TSTTBS Sự kết hợp giữa chẩn đoán phân tử, lâm sàng và hóa sinh sẽ giúp cho bác sĩ hoặc những người tư vấn di truyền có một cái nhìn toàn diện, tổng quát về tình trạng của bệnh nhân, giúp định hướng cho việc chỉ định điều trị bằng liệu pháp hormone thay thế suốt đời

Trong những năm gần đây, tại các bệnh viện ở Việt Nam, số lượng các bệnh nhân, đặc biệt các bệnh nhi, có hiện tượng TSTTBS ngày càng xuất hiện nhiều hơn Hiện nay, tại một số bệnh viện và cơ sở nghiên cứu trong nước đã bắt đầu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến gen gây bệnh TSTTBS Tuy nhiên, các

nghiên cứu chỉ chủ yếu phát hiện đột biến trên gen CYP21A2 bằng cách lọc các đột

biến thường gặp bằng kỹ thuật MLPA

Xuất phát từ các lý do trên đây, luận văn “NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG

CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƯỜI BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG

THẬN BẨM SINH” được tiến hành với những nội dung:

- Xác định đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân và gia đình bệnh nhân

có hiện tượng tăng sản thượng thận bẩm sinh

- Xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến lên hoạt tính của enzyme 11β hydroxylase

Từ đó, đánh giá mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen của đột biến trên

gen CYP11B1

I TỔNG QUAN 1.1 Hormone tuyến thƣợng thận

1.1.1 Tuyến thƣợng thận

Tuyến thượng thận gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm ở cực trên hai thận Ở trẻ em, cân nặng trung bình mỗi tuyến là 4 gram, gồm hai phần: phần vỏ và phần tủy, khác nhau về bào thai học, sinh hoá học và chức năng Phần vỏ có ba vùng: vùng cầu (vùng glomerulosa), vùng bó (vùng fasciculata) và vùng lưới (vùng reticularis) (Hình 1.1)

Hình 1.1: Vị trí và cấu tạo tuyến thƣợng thận [9]

Vỏ tuyến thượng thận sản xuất ra một phức hệ nhiều steroid hormone bao gồm glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen (hormone sinh dục nam giới) và estrogen (hormone sinh dục nữ giới) Tuyến này bao bọc xung quanh lõi thượng thận và bao gồm nhiều vùng sản xuất ra các steroid khác nhau (Hình 11) Do được tổng hợp từ cholesterol, các hormone vỏ thượng thận đều có bản chất là steroid và được gọi là corticosteroid hay corticoid (xuất phát từ chữ cortex nghĩa là vỏ) Mặc dù có cùng nguồn gốc và bản chất, những thay đổi về cấu trúc hoá học gồm thay đổi các gốc hoá học và các vị trí liên kết carbon đã tạo nên các nhóm corticoid có tác dụng sinh học

khác nhau Người ta đã chiết xuất được trên 50 dẫn xuất corticoid và chia làm ba nhóm:

Hormon chuyển hoá muối (mineralocorticoid), tổng hợp ở vùng cầu Hormon chuyển hoá đường (glucocorticoid), tổng hợp ở vùng bó

Hormon sinh dục nam (androgen), tổng hợp ở vùng lưới

Cortisol là thành phần chính của glucocorticoids, tham gia vào quá trình chuyển hóa năng lượng và đáp ứng các stress của cơ thể

Steroid hormone, trong đó có hormone vỏ thượng thận, được tổng hợp nhờ sự tham gia trực tiếp của một chuỗi các enzyme Phản ứng hydroxyl hoá giữ vai trò quan trọng trong sự tổng hợp cholesterol từ acetate cũng như quá trình chuyển hoá cholesterol thành steroid hormone và muối mật Vì vậy, các enzyme tham gia tổng hợp hormone vỏ thượng thận là những enzyme xúc tác quá trình hydorxyl hoá, gọi chung là các hydroxylase Trừ enzyme 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), các enzyme tổng hợp corticoid đều thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt là CYP bao gồm: CYP11A1 (chuỗi cholesterol bị phân cắt ra làm nhiều mảnh nhỏ, còn gọi là cytochrome P450 hoặc P450scc), CYP17 (17α-hydroxylase/ 17,20-lyase or P450c17), CYP21A2 (21-hydroxylase cytochrome P450 hoặc P450c21), CYP11B1 (11β-hydroxylase hoặc P45011β), CYP11B2 (aldosterone synthase hoặc P450aldo), và CYP19 (aromatase hoặc P450aom) [36] (Hình 1.2)

1.2 vỏ [10, 13]

, được gọi

là steroid 27-carbon Các mô tế bào steroidogenic có thể tổng hợp cholesterol bằng

phương pháp de novo từ muối acetate, muối axetat này có thể làm biến đổi những este

nội bào của cholesterol, hoặc nhận lipoprotein từ huyết thanh Trong quá trình tổng hợp steroid hormone tuyến thượng thận, cholesterol được chuyển đổi thành steroid hormone hoàn chỉnh nhờ sự xúc tác trung gian của các enzyme cytochrome P450 trong

ty thể và lưới nội chất Quá trình tổng hợp bắt đầu xảy ra trong ty thể, tiếp tục trong lưới nội chất, và hoàn tất trong ty thể Do đó, dạng tiền chất của steroid hormone nằm ở giữa ty thể và các ngăn của tế bào chất là rất quan trọng trong quá trình tổng hợp các hormone tuyến thượng thận

Quá trình tổng hợp steroid hormone bị giới hạn bởi sự vận chuyển cholesterol từ ngoài vào trong màng ti thể và vùng hoạt động của CYP11A1 (chuỗi 20, 22-hydroxylase cholesterol) Trong quá trình tổng hợp steroid hormone, cholesterol được tập trung lại và đưa đến trung tâm hoạt động của CYP11A1, nơi trực tiếp liên kết với vùng bên trong màng ty thể Các protein sẽ có nhiệm vụ thực hiện sự vận chuyển này

có tên là protein điều hòa steroidgenic [66] Các pregnenolone sau đó đi từ ty thể đến lưới nội chất để tiếp tục các quá trình chuyển hóa tiếp theo Mặt khác, pregnenolone còn có thể được chuyển đổi trực tiếp thành progesterone nhờ 3β-hydroxysteroid

17α-hydropregnenolone nhờ 17α-hydroxylase (CYP17) để sản xuất ra 17α-hydroxypregnenolone Sau đó, 17α-hydroxypregnenolone sẽ được 3βHSD biến đổi thành 17α-hydroxyprogesterone hoặc steroid C19, dehydroepiandrosterone nhờ xúc tác 17,20 lyase từ CYP17 Bên cạnh đó, dehydroeiandrosterone (DHEA) được 3βHSD biến đổi thành androstenedione tham gia vào cấu tạo các tiền chất của hormone

-21 để sản xuất ra lần lượt 11-deoxycorticosterone và 11- deoxycortisol Những sản phẩm này của CYP21A2 sau đó được đưa trở lại vào ty thể, nơi bước cuối cùng của quá trình tổng hợp steroid hormone trong lớp vỏ tuyến thận diễn ra Hai đồng phân CYP11B là 11β-hydroxylase/aldosterone synthase (CYP11B2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1), làm xúc tác cho quá trình chuyển hóa deoxycorticosterone và 11-deoxycortisol lần l

, vùng cầu, sản xuất ra mineralocorticoid aldosterone bền vững từ deoxycorticosteone nhờ sự xúc tác của CYP11B2 Một sự khác biệt về enzyme ở giữa vùng cầu và vùng bó là sự vắng mặt của CYP17 tại vùng cầu cầu có xu hướng biểu hiện ra CYP11B2 Tại vùng lưới, androstenedione được chuyển đổi thành testosterone và esterone/estradiol nhờ 17β-ketosteroid reductase (17βHSD) và 19-hydroxylase

(CYP19) Trong cơ thể người, cortisol được sản xuất ra với số lượng lớn hơn so với aldosterone và chiếm khoảng 80% lượng glucocorticoid Androgen, DHEA và androstenedione, được sản xuất ra tại vùng lưới, được chuyển hóa thành testosterone hoặc estrogen bở

ra corticosterone (ví dụ như loài chuột và những loài gặm nhấm khác) có tương đối ít hormone giới tính do nguyên nhân từ tuyến thượng thận [24, 40, 66]

1.1.3 Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase

Quá trình tổng hợp adrenocorticosreroid được điểu khiển bởi vùng dưới đồi và tuyến yên trước (Hình 1.3) Vùng dưới đồi điều khiển sản xuất ra hormone sinh corticotropin (CRH) vào trong tĩnh mạch máu, từ đó máu sẽ đi vào tuyến yên CRH kích thích tuyến yên sản sinh ra adrenocorticotropin (ACTH) vào trong trong hệ thống lưu thông máu ACTH lại kích thích tuyến thượng thận chuyển đổi cholesterol thành pregnenolone Pregnenolone sau đó sẽ tạo thành glucocorticoid, hormone giới tính và aldosterone lần lượt ở trong reticularis, fasciculata và glomerulosa Thêm vào đó, angiotensin II và ion K+ ở nồng độ cao kích thích tạo thành aldosterone synthase (CYP11B2) trong vùng glomerulosa để tạo thành aldosterone Ngược lại, glucocorticoid và androgen ức chế sự hình thành hoạt tính của CRH ở vùng não điều khiển và ngăn cản sự tạo thành ACTH ở tuyến yên Trong khi đó, aldosterone không gây ức chế sự sản sinh ra ACTH và CRH như những hormone trên

Sự tổng hợp cortisol được kiểm soát căn bản bởi ACTH [61] ACTH hoạt động thông qua một G protein có 2 điểm thụ cảm đặc trưng ở trên bề mặt của tế bào tuyến thượng thận để tăng lượng cAMP (adenosine 3’, 5’ monophotphate) [50] AMP tuần hoàn có một tác động ngắn vừa phải (vài phút đến vài giờ) đến sự vận chuyển cholesterol vào trong ty thể để tăng cường sự tổng hợp protein điều hòa hoạt động steroidogenic (StAR) [58] Mức độ tăng cao của cAMP nội bào có một sự tác động dài

hơn (nhiều giờ đến vài ngày) lên sự dịch mã của gen mã hóa enzyme cần thiết cho sự tổng hợp cortisol bao gồm CYP11B1 [60], và ưu tiên biểu hiện mRNA của CYP11B1 hơn so với CYP11B2 [31, 32]

Hình 1.3: Quá trình điều hòa hoạt động 11β-hydroxylase (CYP11B1) 1.2 Cytochrome P450

1.2.1 Vai trò và chức năng

Cytochrom P450 (CYP450) là một nhóm enzyme khá đa dạng, xúc tác quá trình oxy hóa các chất hữu cơ Nó có khả năng xúc tác nhiều phản ứng trong cơ thể như: phản ứng hydroxy hóa, nitơ hóa, oxy hóa, sulfua hóa, epoxide, khử amin và oxy hóa khử nitơ [27], chiếm khoảng 75% tổng số các phản ứng chuyển hóa khác nhau [14] Các chất nền của enzyme CYP bao gồm các chất trung gian của quá trình trao đổi chất như chất béo và kích thích tố steroid, cũng như các chất xenobiotic như các loại thuốc

và hóa chất độc hại khác Vào năm 1991, Nebert cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

để thành lập khóa phân loại enzyme cytochrome P450 [48] Hệ thống phân loại này đã sắp xếp liên họ enzyme cytochrome P450 theo sự giống nhau về trình tự của mỗi họ enzyme và từng nhóm nhỏ, cùng với đó là theo enzyme từ mỗi loài sinh vật Hiện nay

đã có hơn 11000 gen P450 khác nhau đã được tách dòng từ động vật, thực vật, vi nấm,

vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [49], tuy nhiên, các enzyme này lại không

được tìm thấy ở E coli [11, 22] Hiện nay, enzyme này được sử dụng trong các nghiên

cứu về nhiều lĩnh vực như: hóa sinh, y dược học, sinh lý học, hóa học nội bào, công

nghệ sinh học và môi trường [28]

Phản ứng phổ biến nhất được xúc tác bởi cytochrome P450 là một phản ứng monooxygenase, phản ứng tạo thành oxy đơn nguyên tử hoặc oxy phân tử ở cơ chất Ví

dụ, chèn một nguyên tử oxy vào một chất nền hữu cơ (RH), giải phóng nước:

RH + O 2 + NAD(P)H + H +  ROH + H 2 O + NAD(P) +

Hầu hết các CYPs cần một phân tử cung cấp một hay nhiều điện tử để giảm sắt (và oxy phân tử) Cytochrome P450 hấp thu ánh sáng có bước sóng gần 450 nm khi gắn với carbon monoxide (CO), cho ra phức hợp có màu hồng, nên chúng có tên vị trí

“sắc tố 450” hay “màu hồng 450” Căn cứ tính chất của các phân tử chuyển điện tử CYPs có thể được phân loại thành nhiều nhóm [16]

Hình 1.4: Những nhóm hệ thống enzyme P450 A) Hệ thống ở vi khuẩn (nhóm Ia); B) Hệ thống ở ti thể (nhóm Ib); C) Hệ thống ở eukaryote (nhóm II) [26, 37]

Thông thường, cytochrome P450 chia làm 2 nhóm chính: nhóm enzyme ở vi khuẩn hoặc ty thể và nhóm enzyme ở tế bào eukaryote [26] Nhóm I liên quan đến hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn cũng như ở ty thể trong tế bào eukaryote Chúng bao

gồm 3 loại protein riêng biệt: FAD - containing reductase vận chuyển những chất khử tương ứng từ pyramide nucleotide (NADH hoặc NADPH) đến thành phần thứ hai của

hệ thống là ferredoxin và chính bản thân nó sẽ khử enzyme P450 [37] Cả 3 loại protein này đều ở dạng tan trong vi khuẩn (Hình1.4 A) Tuy nhiên, chỉ có có ferredoxin

là protein tan trong ty thể, trong khi đó reductase và P450 lần lượt là chất kết hợp với màng và chất tạo ra liên kết với vùng bên trong màng tythể [26, 37]

Nhóm protein P450 thứ II rất phổ biến ở eukaryote và thể hiện những phản ứng xúc tác cực kỳ đa dạng Hệ thống monooxygenase của nhóm này được tìm thấy ở trong lưới nội chất (ER) của tế bào eukaryote chứa hai protein màng chính là enzyme P450

và NADPH-dependent P450 reductase (Hình 1.4 C) và FMN, cả hai cùng thực hiện sự chuyển những chất khử cần thiết từ NADPH đến một trong những isozyme P450

1.2.2 Cấu trúc không gian cytochrome P450

Poulos và cộng sự đã miêu tả cấu trúc tinh thể của P450cam (CYP101) từ

Pseudomonas putida [54] Vào đầu những năm 1990, người ta đã xác định được cấu

trúc của những cytochrome P450, tên là P450BM3 (CYP102) [55], P450terp (CYP108) [38], P450eryF (CYP107) [29] và P450nor (CYP55) [47] Cho đến nay, những chuyên gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể đã xác định được cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn Sự phân tích những cấu trúc này đã cho thấy sự xác định trình tự giữa những cytochrome P450 khác nhau thậm chí có khuynh hướng rất kém thì tất cả cytochrome đều biểu thị là một dạng nếp gấp và hình học Topo Nói chung, những P450 đều thể hiện một dạng nếp gấp với việc là các liên kết đầu N- và C- cuối cùng được sắp xếp xung quanh các heme sắt Cấu trúc lõi của P450 gồm có 6 dạng xoắn: D, E, I, L, J và

K Trong khi đó, cấu trúc gấp nếp β bao gồm hai dạng: gấp nếp β dạng 1 chứa 5 sợi và cấu trúc gấp nếp β dạng 2 chứa 2 sợi Heme sắt nằm ở giữa dạng xoắn I và L [53] Dựa vào sự sắp xếp của các thành viên họ CYP2C, Gotoh cho rằng 6 vùng tham gia vào việc nhận dạng cơ chất, định rõ SRS (vùng nhận dạng cơ chất) [34] Tại SRS-1 (xoắn

B’), SRS-2 (carboxyl cuối của dạng xoắn F) và SRS-3 (axit amin cuối ở dạng xoắn G),

có một cấu trúc không gian biến đổi liên tục Ngược lại, vùng SRS-4 (giữa dạng xoắn I), SRS-5 (β6-1/β6-4) và SRS-6 (β4-hình kẹp tóc) chỉ chứa những cấu trúc không gian giới hạn Bên cạnh đó, những dạng trình tự đồng nhất bao gồm dạng EXXR tại liên kết C- cuối ở dạng xoắn K, dạng CXGXXLA ở túi Cys và dạng AGXXT ở dạng xoắn I, gồm có một vài những chất lắng lại giữa những CYP và dạng DXXXF ở dạng xoắn K’[45]

1.3 Gen CYP11B1

1.3.1 Cấu trúc và chức năng

Tên chính thức của gen này là Cytochrome P450, họ 11, phân lớp B,

polypeptide 1 thường được viết tắt là CYP11B1 Gen CYP11B1 –

Cụ thể, enzyme giúp chuyển đổi một phân tử 11-deoxycortisol thành cortisol [31] đồng thời nó cũng chuyển hóa 11-deoxycorticosterone thành corticosterone hoặc 18-hydroxy-11-deoxycorticosterone nhưng quá trình hydroxy hóa tại vị trí 18 của corticosterone là rất thấp [2].Các quá trình này được kích hoạt bởi hormone gọi là nội tiết tố thượng thận corticotrophic (ACTH) do tuyến yên sản xuất Cortisol giúp duy trì lượng đường trong máu, bảo vệ

cơ thể khỏi sự căng thẳng, ngăn chặn các tình trạng viêm nhiễm Corticosterone được chuyển thành các hormone aldosterone bởi các enzyme aldosterone synthase, được mã

hóa bởi gen CYP11B2 Aldosterone giúp kiểm soát huyết áp bằng cách duy trì lượng

muối và nước trong cơ thể

Gen CYP11B1 nằm trên cánh dài của chromosome 8, tại vị trí 21, có kích thước khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron Gen CYP11B2 độ tương đồng 93% so với gen CYP11B1, nằm trên cánh dài của chromosome 8, giữa vị trí 21 và 22 (Hình 1.5)

Tuy 2 protein này có độ tương đồng cao nhưng trọng lượng phân tử của chúng lại khác nhau, lần lượt là 51 kDa và 49 kDa khi chạy trên điện di SDS-PAGE [31, 50]

CYP11B1 không thể chuyển hóa corticosterone đến aldosterone Ngược lại, CYP11B2

có hoạt tính 11β-hydroxylase yếu hơn CYP11B1 nhưng nó lại có thể hydroxyl hóa ở vị trí C-18 và sau đó tiếp tục 18-hydroxy corticosterone tới aldosterone CYP11B2 có thể

chuyển hóa 11-deoxycortisol đến 18-oxocortisol Phản ứng này không có ý nghĩa ở in

vivo vì nó không biểu hiện trong vùng fasciculata, nhưng nó lại đóng vai trò quan trọng

ở các bệnh nhân có hội chứng glucocorticoid áp chế tăng aldosterone [2]

Hình 1.5: Vị trí của CYP11B1 và CYP11B2 trên chromosome 8 [17]

1.3.2 Cấu trúc không gian của CYP11B1

Để tìm hiểu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của CYP11B1 đòi hỏi phải nghiên cứu về cấu trúc không gian 3D của enzyme này Sự xác định cấu trúc protein nhờ sự nhiễu xạ tia X-quang thường xuyên gặp phải những vấn đề trong trường hợp protein chứa màng như CYP11B1 và CYP11B2, và sự xác định cấu trúc cộng hưởng từ hạt nhân bị giới hạn ở các protein có kích thước nhỏ hơn Những phương pháp này được kiểm soát và sử dụng để phân tích dư lượng các hợp chất xác định được

trong quá trình nghiên cứu đột biến gen Sự khác nhau chủ yếu của hai loại protein này nằm trong cùng một vị trí heme nguyên tử sắt (Hình 1.6B)

ra những liên kết hydro khác nhau xung quanh vị trí Arg348, Arg448 và nhóm heme sắt propionate là vùng trung tâm hoạt động của CYP11B2 được cho là nhỏ hơn so với CYP11B1 Bên cạnh đó, Ulmshneider tập trung vào nghiên cứu tương tác của chất làm bất hoạt protein và mối quan hệ giữa cấu trúc chức năng của những chất gây ức chế đã được phát triển sâu hơn [59] Thêm vào đó, hình mẫu CYP11B1 của Roumen và cộng

sự mang đến sự tìm hiểu sâu hơn đối với các vùng được lựa chọn nghiên cứu, các cấu

tử ở các enzyme và sự tương tác giữa các cấu tử này [57]

1.4 Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS)

1.4.1 Khái niệm

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzyme cần thiết để tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase (21-OH), 11β-hydroxylase (11-OH), 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD) và 20/22 Desmolase [8] Bệnh này thường có dấu hiệu là sự tăng cao hơn mức bình thường hormone sinh dục đực hay còn gọi là sự nam hóa Biểu hiện rõ rệt nhất là sự xuất hiện cơ quan sinh dục của nam giới bên ngoài cơ quan sinh dục của nữ giới hay cơ quan sinh dục của nam giới phát triển hơn bình thường [23]

1.4.2 Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase

Theo Zachmann và cộng sự, có khoảng 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ

sự suy giảm 11β-hydroxylase [65] TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thường kết hợp với tăng huyết áp Nhiều trường hợp mắc CAH do suy giảm 11β-hydroxylase đã được tìm thấy trong số những người Do thái ở Israel nhập cư từ Ma Rốc Trong nhóm người này, tỷ lệ mắc bệnh lên tới 1/5.000 – 1/7.000 ca mới sinh [56] so với mức bình thường là 1/200.000 ca mới sinh [58]

tượng tăng huyết áp ở bệnh nhân CAH, do thiếu hụt 11β-hydroxylase nên một lượng lớn cortisol không được tạo ra Ngoài ra, do 11-deoxycortisol bị ứ quá nhiều nên dạng tiền chất của nó là 17-OH progesterone sẽ đi vào con đường tổng hợp androgen, dẫn đến sự tăng cao hơn mức bình thường của hormone nam giới và sự biến dạng cơ quan sinh dục (Hình 1.2) Như vậy, có thể nói biểu hiện rõ rệt nhất của tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase là hiện tượng huyết áp và hormone nam giới ở bệnh nhân tăng cao

1.4.2.2 Biểu hiện lâm sàng

Tăng huyết áp là sự rối loạn phổ biến ở bệnh nhân CAH do suy giảm hydroxylase, tuy nhiên huyết áp lại tăng không đồng nhất ở trong những nhóm những bệnh nhân cụ thể Những nhóm bệnh nhân có thể được xác định dựa trên nền tảng những phản ứng kích thích steroid hormone và kích thích sinh học Những nhóm này xuất hiện những triệu chứng như suy giảm renin và không có yếu tố điều hòa steroid hormone Người ta ước tính rằng khoảng 2/3 bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase có biểu hiện huyết áp tăng cao [56], triệu chứng này thường xuất hiện ngay ở những năm đầu đời [65] Trong khi đó, sự thiếu hụt cortisol dẫn đến tăng huyết áp mineralocorticoid có thể liên quan đến những vấn đề về đường võng mạc, hơn 1/3 bệnh nhân có biểu hiện sự to lên của bộ não và số người tử vong do đứt mạch máu não đã được nêu ra [35, 56] Những dấu hiệu khác của sự tăng cao mineralocorticoid như hạ kali trong máu và cơ bắp yếu hoặc chuột rút có thể xảy ra ở đa số bệnh nhân nhưng lại không ảnh hưởng đến huyết áp Hoạt tính renin trong huyết thanh thường bị ức chế khi trẻ lớn tuổi hơn và mức độ aldosterone thường ở mức thấp mặc dù khả năng tổng hợp aldosterone không thật sự bị kìm hãm [62]

11β-Đối với hiện tượng tăng cao hormone nam giới, những bé gái có triệu chứng thiếu hụt 11β-hydroxylase, sinh ra có biểu hiện đực hóa, dương vật xuất hiện bên ngoài

cơ quan sinh dục Nguyên nhân của nó là do có sự tiết quá nhiều androgen trong thận

trong suốt quá trình hình thành phôi và thai nhi Trái ngược với cơ quan sinh dục bên ngoài, cấu trúc tuyến sinh dục bên trong hoàn toàn bình thường, như cơ thể bé gái vẫn

có tử cung, âm đạo và buồng trứng Sự phát triển nhanh chóng tế bào soma ở lúc còn nhỏ cùng với sự phát triển xương nhanh trước tuổi dẫn đến sự kết thúc sớm của xương đỉnh não, và tầm vóc người lớn thấp bé là những dấu hiệu của việc thừa hormone nam giới ở những bé trai và bé gái mới sinh Thêm vào đó, những em bé bị những ảnh hưởng trên có thể dẫn đến sự kết thúc sớm sự phát triển giới tính [52] Những bệnh nhân với sự suy giảm một phần 11β-hydroxylase sinh ra với cơ quan sinh dục bên ngoài bình thường nhưng vẫn có những dấu hiệu và triệu chứng của việc thừa hormone sinh dục đực ví dụ phụ nữ trưởng thành có thể biểu hiện của sự rậm lông và kinh

nguyệt ít

1.4.2.3 Cơ sở di truyền

TSTTBS do thiếu hụt enzyme 11-OH là bệnh di truyền lặn do đột biến gen trên NST thường Khả năng sinh con bị bệnh là 25% và sinh con dị hợp tử mang gen bệnh lặn là 50% Những người dị hợp tử này rất khó phát hiện và là người truyền gen bệnh cho các thế hệ tiếp theo Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể

1.4.3 Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do nguyên nhân khác

TSTTBS do thiếu hụt 21- hydroxylase

Đây là nguyên nhân chính chiếm 90 – 95% nguyên nhân gây bệnh TSTTBS [19] Sự thiếu hụt hoạt động của 21-OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/ hoặc thiếu hụt aldosterone cũng như thừa androgen thượng thận Trẻ gái có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài và tình trạng giả dậy thì sớm ở trẻ trai Ở thể mất muối, bệnh nhân

có các triệu chứng lâm sàng tương tự như thể nam hoá đơn thuần, và có kèm theo thiếu

hụt aldosterone ở trẻ sơ sinh Nếu không được điều trị sớm, bệnh nhân có thể tử vong

do cơn suy thượng thận cấp

TSTTBS do thiếu hụt cholesteron desmolase

TSTTBS do thiếu cholesteron desmolase còn được gọi là hội chứng Prader Gurtner Trong hội chứng này, do thiếu desmolase, cholesterol không chuyển được thành pregnenolon nên sự tổng hợp của cả ba loại steroid là mineralocorticoid, glucocorticoid và androgen đều giảm

Sau khi ra đời, trẻ bị suy thượng thận với biểu hiện mất muối, mất nước và truỵ mạch Trẻ trai có bộ phận sinh dục ngoài giống như trẻ gái Đây là bệnh hiếm gặp, có

tỷ lệ tử vong cao

TSTTBS do thiếu hụt 17α- hydroxylase (17-OH)

TSTTBS do thiếu 17α- hydroxylase còn được gọi là hội chứng Biglieri Trong hội chứng này, do thiếu 17-OH, pregnenolon không chuyển được thành 17- hydroxypregnenolon và progesteron không chuyển được thành 17 hydroxyprogesteron nên sự tổng hợp glucocorticoid và androgen giảm Trong khi đó đường sinh tổng hợp mineralocorticoid không bị gián đoạn nên sự sản xuất các steroid trong đường đó tăng lên

Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng cao huyết áp và giả ái nam ái nữ ở trẻ trai Đây

là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone glucocorticoid

TSTTBS do thiếu hụt 3β- hydroxysteroid dehydrogenase

TSTTBS do thiếu hụt 3β- hydroxysteroid dehydrogenase còn được gọi là hội chứng Bongiovani Do thiếu enzyme này, sự tổng hợp các steroid có liên kết đôi Delta

4 giảm, gây giảm tổng hợp glucocorticoid, mineralocorticoid và androgen, trong khi

đó, sản xuất DHA và androstendiol Delta 5 tăng

Trẻ trai có biểu hiện dị dạng bộ phận sinh dục ngoài như tật lỗ đái thấp và không có bìu Trẻ gái có thể phì đại âm vật và môi lớn dính giống bìu Đôi khi có trường hợp có kèm theo biểu hiện mất muối Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone glucocorticoid

TSTTBS do thiếu hụt 18- dehydrogenase

TSTTBS do thiếu hụt enzyme 18- dehydrogenase còn được gọi là hội chứng Olick Do thiếu enzyme này, corticosterone không chuyển được thành aldosterone gây hội chứng mất muối trên lâm sàng Đây là bệnh hiếm gặp và có thể điều trị được bằng hormone mineralocorticoid

, người ta

đã dựa chủ yếu và định lượng trong máu ba sản phẩm cuối của ba đường tổng hợp hormone vỏ thượng thận là aldosterone, cortisol và testosterone cùng các chất chuyển hoá trong nước tiểu Nhưng sự thay đổi ba loại hormone này còn xảy ra trong cả bệnh TSTTBS do rối loạn các enzyme khác Nồng độ aldosterone và cortisol giảm trong cả bệnh Addison hay trong bệnh suy tuyến yên toàn bộ, và nồng độ testosterone tăng

trong cả các bệnh gây dậy thì sớm khác như u tuyến yên, u vỏ thượng thận nam hoá hay u tinh hoàn Thêm vào đó, việc thu thập nước tiểu 24 giờ để định lượng các chất chuyển hoá đối với trẻ sơ sinh hoặc bệnh nhi đang trong cơn suy thượng thận thường gặp nhiều trở ngại vì không lấy hết được nước tiểu và phải tiêm hydrocortison ngay Vì vậy, kết quả thu được nhiều khi không chính xác Trong đó, mức độ tăng cao của 17-OHP là nguy cơ tiềm tàng dẫn đến TSTTBS

tế bào động vật, phân tích hoạt tính enzyme

1.5.2 Điều trị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh [6]

TSTTBS là bệnh kéo dài suốt đời, không có cách nào chữa trị hoàn toàn Không thể thay thế enzyme và phẫu thuật não hoặc phẫu thuật tuyến thượng thận cũng không giúp được gì Tuy nhiên, có thể thay thế hay bổ sung các hormone bị thiếu – tức là cortisol và hormone giữ muối bằng cách uống thuốc Các loại thuốc này cần duy trì hàng ngày, suốt đời, kể cả khi trẻ có thể hoàn toàn khỏe mạnh

Một số loại thuốc như hydrocortisone, cortisone, prednisolone, dexamethasone

có thể thay thế hormone cortisol Tuy nhiên, mỗi loại thuốc này có công hiệu và thời

gian tác dụng khác nhau Hydrocortisone có công hiệu tương tự cortisone và thời gian tác dụng ngắn, là loại thuốc nên dùng nhất cho trẻ bị TSTTBS Trong khi đó prednisolone có công hiệu mạnh hơn gấp 5 lần còn dexamethasone mạnh gấp 40-80 lần cortisone và có thời gian tác dụng dài hơn Dexamethosone thường không áp dụng cho trẻ đang tăng trưởng do công hiệu quá lớn và thời gian tác dụng kéo dài (24-48 giờ), có khả năng gây cản trở đến sinh trưởng của trẻ Tuy nhiên, khi trẻ đã đạt chiều cao bình thường của người lớn thì thuốc này lại có hiệu quả rất tốt, giúp kiểm soát bệnh 24/24 giờ Nếu cần thêm hormone giữ muối bệnh nhân có thể dùng thêm fludrocortisone

Liều dùng thuốc chính xác để điều trị CAH thay đổi tùy từng trẻ, tùy theo khổ người, khả năng hấp thụ của ruột và nhân tố khác Liều dùng thuốc do bác sĩ xác định riêng cho từng người, dựa trên kết quả xét nghiệm lâm sàng và hóa sinh thường xuyên, kết hợp với theo dõi lâm sàng sự tăng trưởng của trẻ, sự phát triển và huyết áp Khi trẻ lớn lên, liều dùng sẽ tăng lên

1.6 Tình hình nghiên cứu

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

-

-

Đột biến trên gen CYP11B1- Arg448His, gây bệnh TSTTBS lần đầu tiên được

miêu tả vào năm 1991 bởi White và cộng sự [62] Hiện nay đã có nhiều đột biến trên

gen CYP11B1 được tìm thấy nhờ phương pháp PCR và đọc trình tự Tính đến nay đã

có hơn 60 đột biến mới được xác định và công bố trên thế giới [7] Rất nhiều đột biến điểm được tìm thấy ở bệnh nhân mắc bệnh CAH đã gây ra những sự rối loạn chức năng của 11β-hydroxylase khi biểu hiện đột biến trên nuôi cấy tế bào (bảng 1.9)

Hình 1.7: Đột biến trên gen CYP11B1

Gần đây, Zhang M và cộng sự khi nghiên cứu ở chín bệnh nhân có biểu hiện

bệnh TSTTBS do đột biến trên CYP11B1 đã phát hiện đột biến phổ biến p.R454C và

ba đột biến mới p.V148G, IVS7-9C> A, c.1359_1360insG Khi nghiên cứu về mức độ biểu hiện của các đột biến cho thấy các p.R141X, p.V148G, c.1359_1360insG và đột biến p.R454C chỉ biểu hiện 4,9%, 3,9%, 3,7%, 4,5% hoạt tính enzyme [67]

Bảng 1.1 Một số đột biến thay thế amino acid trên gen CYP11B1 dẫn đến

sự ảnh hưởng hoạt tính 11β-hydroxylase trong tế bào động vật

dẫn

p.R454C Trung

Giảm 95,5%hoạt tính 11β-hydroxylase [67]

p.R141X Trung

Giảm 95,1%hoạt tính 11β-hydroxylase

[67]

p.V148G Trung

Giảm 96,3 %hoạt tính 11β-hydroxylase [67]

p.F79I Không xác

Giảm 8,8 %hoạt tính 11β-hydroxylase [21]

p.R138C Không xác

Giảm 9,8 %hoạt tính 11β-hydroxylase [21]

R143W Không xác

Giảm 10,6 %hoạt tính 11β-hydroxylase [21]

P42S Không xác

Giảm 15% hoạt tính 11β-hydroxylase [39]

P94L North

Giảm 0,05% hoạt tính 11β-hydroxylase [41]

W116C Thổ Nhĩ

Giảm 2,9% hoạt tính 11β-hydroxylase [43]

V129M Caucasian 2 C-helix Mất hoàn toàn hoạt tính

11-hydroxylase [33]

N133H Không xác

Giảm 17% hoạt tính 11β-hydroxylase [39]

A331V Caucasian 6 I-helix Mất hoàn toàn hoạt tính

11-hydroxylase [33]

A368D North

Giảm 1,17% hoạt tính 11β-hydroxylase [41]

E371G Caucasian 6 K-helix Mất hoàn toàn hoạt tính

Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây, tại các bệnh viện ở Việt Nam, số lượng các bệnh nhân, đặc biệt các bệnh nhi, có hiện tượng TSTTBS ngày càng xuất hiện nhiều hơn Bệnh nhân có biểu hiện TSTTBS đầu tiên được phát hiện tại Hà Nội vào năm 1976 [6] Theo thống kê của Viện Nhi Trung ương, năm 1999 có 71 trẻ em có hiện biểu hiện của TSTTBS [4] Đến tháng 12 năm 2009 con số bệnh nhân với TSTTBS đã tăng lên 494 trường hợp (47% là bé trai, 53% là bé gái và tới 72% mất muối TSTTBS), tăng hơn 5 lần trong 11 năm qua [6] Các bệnh nhân được khám lâm sàng như suy dinh dưỡng, tăng huyết áp cũng như được làm các xét nghiệm hóa sinh như mất muối, suy giảm cortisol, 17-OHP [1, 3-5] Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu một cách hệ thống về di

truyền phân tử cả 2 gen CYP21A2 và CYP11B1 ảnh hưởng tới sự suy giảm cortisol

Thực tế, các nghiên cứu mới chỉ tập chung sàng lọc các đột biến thường gặp bằng kỹ thuật MLPA (sử dụng kit MLPA P050B2 - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification là một phương pháp multiplex-PCR để phát hiện số lượng sao chép bất thường của DNA hoặc RNA (đạt tới tới 50 sự khác biệt), có khả năng phân biệt các trình tự khác nhau chỉ trong một nucleotide) Kỹ thuật này dựa vào các đột biến đã

được phát hiện sàng lọc 6 đột biến thường gặp: P30L (Exon 1), mất đoạn 8bp (Exon 3),

I172N (Exon 4), Exon 6 Cluster (Exon 6), Q318 (Exon 8), mất toàn bộ gen CYP21A2,

mất đoạn 30Kb (Exon 3 hybrid) Năm 2011-2012, Phòng Hệ gen học chức năng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có

những nghiên cứu sâu hơn về di truyền phân tử bệnh TSTTBS trên cả 2 gen CYP11B1

và CYP21A2

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Bảng 2.1: Danh sách bệnh nhân và mã số mẫu bệnh phẩm

Vector biểu hiện pSVL được mua từ hãng Pharmacia Biotech Inc (Freiburg, CHLB Đức) Môi trường nuôi cấy tế bào: pyruvate, glutamine, fetal bovine serum và kháng sinh của hãng Sigma 11-deoxycortisol, cortisol và [3

H] 11-hydroxycortisol của hãng DuPont NEN (Boston, Mỹ) Các dung môi dùng cho sắc kí lớp mỏng và một số hóa chất thông dụng được mua từ hãng Merck

Mồi nhân và giải trình tự gen CYP11B1 được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Đoạn Oligonucleotides

Tên mồi Chiều

xuôi

Chiều ngƣợc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ máu bệnh phẩm bằng bộ KIT DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN Qui trình được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

và đo quang phổ để xác định nồng độ cùng với độ tinh sạch

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose

Mẫu DNA được điện di trên gel agarose 0,8 % trong dung dịch TAE 1X Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương

Nhuộm bằng EtBr: bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ Bản gel được tráng

qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad)

2.2.3 Đo quang phổ DNA

Dung dịch chứa DNA tổng số được đo quang phổ ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch Mỗi đơn vị OD ở bước sóng 260 nm kýhiệu là A260 nm

Khi đó, công thức chung tính nồng độ DNA tổng số:

C DNA (ng/µl)= A260 nm × 50 × độ pha loãng

Trong đó:

CDNA:nồng độ DNA tổng số (ng/µl) A260 nm: mật độ quang ở bước sóng 260 nm

2.2.4 Nhân gen bằng kĩ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau:

- DNA khuôn mẫu

- Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide

- Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP)

- Taq DNA polymerase chịu nhiệt

Toàn bộ gen CYP11B1 bao gồm tất cả exon / intron được nhân lên bằng 3 cặp

mồi riêng biệt (Bảng 2.2) Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Tag Buffer, 10 mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 200 ng DNA tổng số

và 2 U Dream Tag polymerase Chu trình nhiệt nhân gen CYP11B1 bắt đầu bằng tiền

biến tính 95°C/ 3 phút; tiếp theo là 30 chu kì gắn mồi và kéo dài bao gồm biến tính 95°C/ 1 phút, gắn mồi ở 60°C/ 1 phút và kéo dài chuỗi ở 72°C/ 3 phút; bước cuối cùng

là 72°C/ 10 phút

2.2.5

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp thôi gel sau khi tiến hành điện

di các mẫu PCR lượng lớn Phần gel chứa đoạn gen mong muốn được cắt và thu vào ống effendorf 1,5 ml đã khử trùng Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas

2.2.6 Giải trình tự gen tự động trên máy

Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM

3100 Gentic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing

Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả dNTPs

và ddNTPs trong đó ddNTPs là 4 loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau

Mồi sử dụng để giải trình tự trong bảng 2.2 Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên máy PCR Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide

2.2.7 Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis)

Đột biến điểm được tạo ra trên vector pSVLh11B1 bằng việc sử dụng kit Change Site-Directed Mutagensis (Stratagen Ltd., Cambridge, UK) Trình tự biểu hiện CYP11B1 trên cấu trúc vector pSVLh11B1 trong tế bào động vật được xem như đối chứng (wild-type) Các cặp mồi đáp ứng với sự thay đổi của amino acid trên bảng 2.2 Chu trình nhiệt tạo đột biến điểm được miêu tả theo phương pháp của TS Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm 2008 [20] Các đột biến điểm được kiểm tra lại bằng đọc trình

Quik-tự gen (MWG Eurofins, Ebersberg, Germany)

2.2.8 Biểu hiện trong tế bào COS-1 và phân tích hoạt tính enzyme

Dòng tế bào COS-1 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 5% huyết thanh bò (fetal bovine serum), 0,1 mg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, 1

mM pyruvate và 4 mM L-glutamine Các tế bào được nuôi cấy tới mật độ khoảng 2 ×

105 / đĩa sau 18-24 h, sau đó tế bào này được biến nạp với 1 µg vector pSVLh11B1 và

1 µg vector biểu hiện bovine adrenodoxin (pbAdx) bằng việc sử dụng kit Effectene Transfection Reagent (Qiagen) Sau 6 h biến nạp, các tế bào được ủ nuôi tiếp ở 37 ºC,

72 h trong 4 ml môi trường có bổ sung 0,6 µCi [3H]- 11-deoxycortisol Steroid được tách chiết 2 lần từ dịch nổi của tế bào (800 µl) với chloroform và các sản phẩm steroid được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng theo TS Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm

2008 [20]

Phân tích Western bot để chứng minh sự biểu hiện của wild-type và đột biến của 11-hydroxylase trong tế bào động vật Protein được tách chiết từ tế bào COS-1 (200 µg) được đưa lên gel 10% SDS-PAGE và sau đó được chuyển sang màng nitrocellulose CYP11B1 được phát hiện với kháng thể thỏ kháng CYP11B người (Charles River Laboratories, Germany) và phát hiện hình ảnh bằng bộ kit ECL (Amersham Biosciences, UK)

2.2.9 Phân tích trình tự gen trên phần mềm tin học

Dữ liệu thô sau quá trình giải trình tự gen sẽ được đưa lên phầm mềm tin sinh học Bio Edit v7.0 Tại đây 4 loại nucleotide là A, T, G, C sẽ được biểu diễn dưới các

đỉnh (peak) khác nhau Trình tự nucleotide của gen CYP11B1 sẽ được so sánh với trình

tự chuẩn từ ngân hàng gen

Cấu trúc 3D protein được phân tích trên 2 chương trình phần mềm spdbv và ViewerLite Chương trình spdbv cho phép thay đổi đột biến từ amino acid này sang amino acid khác, biểu hiện các liên kết trong phân tử, Chương trình ViewerLite42 biểu diễn cấu trúc không gian 3D protein

PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1 Tách DNA tổng số

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách từ máu toàn phần của bệnh nhân

có biểu hiện của bệnh TSTTBS Phương pháp tách DNA được tiến hành theo bộ KIT DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN Hiện nay có nhiều phương pháp tách DNA được áp dụng rộng rãi như phương pháp tách DNA bằng kit, tách DNA sử dụng Perchlorate sodium, sử dụng acetate d'ammonium… Nguyên lý cơ bản của các phương pháp tách DNA từ máu đều bao gồm 4 bước cơ bản: phá vỡ hồng cầu, phá vỡ bạch cầu, loại bỏ protein, thu hồi DNA Phương tách DNA máu bằng bộ kit là phương pháp tách nhanh, sản phẩm thu được có nồng độ cao, đồng đều và độ tinh sạch đảm bảo

DNA sau khi tách sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic là mang điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính linh động và vận tốc di chuyển trong điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân

tử và nồng độ các chất cấu thành gel

Hình 3.1: Điện di DNA tổng số mẫu bệnh phẩm M: Marker DNA chuẩn 1 kb

1,2,3: DNA tổng số mẫu bệnh phẩm

Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromid Thuốc nhuộm ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang có thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép Mặc dù vậy, ái lực liên kết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép DNA nhuộm EtBr được nhận biết bằng tia cực tím vì thế dưới tác dụng của ánh sáng UV, băng vạch DNA trên bản gel sẽ được hiện hình rõ ràng

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA hiện sáng rõ, không bị đứt gãy, đã loại

bỏ tạp chất và RNA Sản phẩm DNA có thể dùng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2 Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế

Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quang : Một đơn

vị OD260nm tương ứng với nồng độ: 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi, 40 µg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn

Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, dung dịch DNA được đo thêm ở mật độ quang bước sóng 280 nm (A280 nm) Đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất Một dung dịch DNA được xem là sạch khi tỷ số A260 nm/ A280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2

Bảng 3.1: Kết quả đo quang phổ mẫu DNA tổng số

Kết quả đo mật độ quang cho thấy, sản phẩm DNA sau khi tách có nồng độ và

độ tinh sạch cao, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.3 Khuếch đại đoạn gen CYP11B1

Đoạn gen CYP11B1 có kích thước khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron, vì

thế, 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại được toàn bộ đoạn gen (Hình 3.1)

Hình 3.2 Sơ đồ nhân đoạn genCYP11B1 Chiều dài gen CYP11B1 khoảng 7

kb gồm 9 exon, được chia thành 3 đoạn gen A (2,5 kb), B (1,6 kb) và C (2,3kb) để

nhân toàn bộ gen

Vì gen CYP11B1 và CYP11B2 có độ tương đồng rất cao (90%), nên khi thiết kế

các cặp mồi cần phải chú ý các điểm khác nhau của 2 đoạn gen này để tránh nhân

nhầm gen CYP11B2