tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loại khố sâm mềm (brucea mollis wall. ex kurz) và cơm rượu trái hẹp (glycosmis stenocarpa (drake) guilaum) ở việt

VIỆN HÓA HỌCMAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM BRUCEA MOLLIS WALL... Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Trần Thị Ngọc Diệp,

VIỆN HÓA HỌC

MAI HÙNG THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS

STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 62.44.27.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2012

Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường

2 GS.TS Young Ho Kim

Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn

Phản biện 2: GS.TSKH Trần Văn Sung

Phản biện 3: PGS.TS Hoàng Thanh Hương

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Hội trường (tầng 3), nhà A18 – Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 – Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2012

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Hà Nội

- Thư viện Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN

1 Nguyễn Mạnh Cường, Trần Thu Hường, Trần Quốc Toàn, Huỳnh Minh Hùng, Mai

Hùng Thanh Tùng, Nguyễn Quyết Chiến, (2010), Đóng góp mới về nghiên cứu thành

phần hóa học cây Cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa, Tạp chí Hóa học, 48

(4B), 516-520

2 Mai Hùng Thanh Tùng, Trần Thu Hường, Trần Thế Bách, Nguyễn Quốc Bình, Bá

Thị Châm, Nguyễn Mạnh Cường, (2011), Tác dụng gây độc tế bào ung thư của lá cây

Khổ sâm mềm (Brucea mollis), Tạp chí Dược liệu 16 (6), 356-360

3 Mai Hùng Thanh Tùng, Nguyễn Thành Dương, Trần Thu Hường, Nguyễn Mạnh

Cường, (2011), Các amít và flavonoit từ lá cây Khổ sâm mềm - Brucea mollis, Tạp

chí Hóa học 49 (6A), 389-392

4 Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức, Bùi Hữu Tài, Nguyễn Mạnh Cường, (2011),

Các tecpenoit và phenolic glucoside từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex

Kurz), Tạp chí Hóa học 49 (6), 765-768

5 Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Young Ho Kim, Nguyễn Mạnh Cường, Đóng

góp mới về nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall

ex Kurz), Tạp chí Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng)

6 Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Trần Thị Ngọc Diệp, Young Ho Kim, Nguyễn

Mạnh Cường, Một số hợp chất béo và sterol được phân lập từ cây Khổ sâm mềm

(Brucea mollis), Tạp chí Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng)

7 Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Trần Thu Hường, Nguyễn Mạnh Cường, Các

isoprenoit và coumarin từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz), Tạp chí

Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng)

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Cho đến ngày nay dân số thế giới đã đạt được bảy tỷ người, một con số rất lớn và nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo Trong khi đó thì tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hướng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nước đang phát triển đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới phải cố gắng tìm ra những loại thuốc mới

Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ, mà cho đến nay thế giới vẫn chưa khám phá hết Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng Hiện nay, tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hướng khắc nghiệt hơn, đã và đang làm cho một số lượng lớn các loài suy thoái dần Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài người

Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz)

được sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở Ngoài ra, trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc nhằm tìm kiếm các loài thực vật có hoạt tính kháng lại dòng ung thư phổi người A549, nhóm tác giả Nguyễn

Mạnh Cường đã phát hiện ra cây B mollis có hoạt tính rất mạnh, dịch chiết

MeOH từ lá cây ức chế tới 96% tế bào ung thư Bên cạnh đó, các phân đoạn được tách ra từ lá cây Khổ sâm mềm cũng đã được thử trên các dòng ung thư khác nhau như LU-1 (ung thư phổi người), Hep-G2 (ung thư gan người), MCF-

7 (ung thư vú người) Kết quả cho thấy cặn chiết MeOH cũng cho hoạt tính gây

(μg/ml) 14,49 Đặc biệt có phân đoạn n-hexan cho hoạt tính gây độc tế bào rất

(μg/ml) lần lượt là 3,5; 1,03 và 5,8

Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) thu hái

tại Việt Nam đã được nghiên cứu Từ cây Cơm rượu trái hẹp, nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường đã phân lập được một số ancaloit như murrayanin, bisisomahanin và murrayafoline A Trong đó, murrayafoline A có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư đại tràng thông qua con đường Wnt/b-catenin và có tác dụng đến tim mạch Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:

"Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài

Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp

(Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam''

2 Mục tiêu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài trên theo định hướng tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư

3 Nội dung nghiên cứu của luận án

4 Ý nghĩa khoa học của luận án

Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) và loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam Các kết quả của luận án sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chi Brucea và chi Glycosmis nhằm khai thác và ứng dụng có hiệu quả các hoạt tính quý báu

của chúng trong lĩnh vực y dược

5 Những đóng góp mới của luận án

- Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của cây Brucea mollis (Wall ex Kurz) ở Việt Nam và trên thế giới

- Từ lá, thân và rễ cây Brucea mollis đã phân lập được 23 hợp chất, trong đó

có 16 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea gồm: octatriacontan-1-ol (BM.01), tritriacontan-1-ol (BM.02), bombiprenone (BM.04), α-tocopherol (BM.05), vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside (BM.09), soulameanone (BM.10),

cytosine (BM.11), thymine (BM.12), axít tricosanoic (BM.14), cleomiscosin A

1β,6α-dihydroxy-4(14)-eudesmene (BM.18), niloticin (BM.19), dimethyl crenatin (BM.20), inosine (BM.21), leonuriside A (BM.23)

- Từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) phân

lập được 4 hợp chất gồm: N-methylpyrrolidine-2-cacboxamit (GP.24), đường

sucrose (GP.25), (±) p-synephrine (GP.26),

mới là GP.27

- Đã đánh giá độc tính tế bào ung thư của dịch chiết MeOH tổng và các cặn

chiết n-hexan, điclometan, dịch nước từ lá cây Khổ sâm mềm đối với 3 chủng tế

bào ung thư phổi người (LU-1), ung thư gan người (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) Dịch chiết MeOH cho tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với dòng tế

rất mạnh đối với cả ba dòng tế bào ung thư Lu, Hep-G2 và MCF-7 với giá trị

- Đã nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập

được trên bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) Phát hiện

hợp chất isobrucein B (BM.15), 9-methoxycanthin-6-one (BM.17) và niloticin

3,73 (μg/ml) Trong đó hợp chất isobrucein B (BM.15) có hoạt tính mạnh nhất

và cao hơn cả chất đối chứng dương ellipticine

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 167 trang, trong đó có 126 hình, 31 bảng Bố cục của luận án:

Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Thực nghiệm (20 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (86 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình khoa học đã công bố trong khuôn khổ luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang) với 141 tài liệu cập nhật đến năm

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần Tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

1.1 Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Sầu đâu (Brucea), họ

Simaroubaceae (Thanh Thất)

1.2 Sơ lược về lớp chất quassinoit, là lớp chất chính của chi Brucea

1.3 Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Cơm rượu (Glycosmis),

họ Cam quýt (Rutaceae)

Nguyên liệu: Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall ex Kurz) được thu

hái vào tháng 3/2009, ở Mai Châu, tỉnh Hoà Bình Tên khoa học của cây do TS Trần Thế Bách (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) xác định Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật HN thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, kí hiệu mẫu là VK 2211 (HN)

Cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa - (Drake) Guillaum) được thu hái

tại xã Hoàng Hoa Thám, huyện Chí Linh, tỉnh Hải Dương, Việt Nam vào tháng 2/2009 , tên khoa học của cây được xác định bởi nhà thực vật học Ngô Văn Trại -Viện Dược liệu

Quy trình chiết: Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần

nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có

độ phân cực tăng dần như: n-hexan, cloroform hoặc điclometan, etyl axetat,

BuOH và MeOH

Phân lập các chất: Tinh chế các cặn chiết thu được bằng phương pháp sắc

ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex LH-20 và các hệ dung môi thích hợp

Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng

sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…)

Phương pháp thử hoạt tính sinh học:

Hoạt tính gây độc tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) được cung cấp bởi GS.TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và cách xác định cấu trúc của 27 hợp chất phân lập được từ hai cây Khổ sâm mềm và Cơm rượu trái hẹp Dưới đây là bảng tổng hợp cấu trúc của các hợp chất phân lập được trong khuôn khổ luận án

BM.09

Vomifoliol

9-O-β-D-glucopyranoside (lần đầu tiên phân lập từ chi

BM.15

(lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea)

N N H

1 23

4

5 6 7 8 9 10 11 12 13

14

15 1617

O

O

OH 1

2

3

4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18

30

BM.19

Niloticin (lần đầu tiên phân lập từ chi

BM.21

Inosine (lần đầu tiên phân lập từ chi

H

1 2

3 4 5

6 (S)

H O

OH H

H HO

O

O HO

HO

H N

CH 3

HO

1 2

3 4 5 6

7

8 9

1'

2' 3'

4'

5' 6'

4'' 5''

Hợp chất BM.15 được tách ra dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy

giống với hợp chất soulameanone (BM.10) ngoại trừ các tín hiệu xuất hiện ở δ 73,3 (C-19); 169,0 (C-1"); 20,3 (C-2"); 172,6 (C-1'); 53,0 (C-2') trong BM.15 và

δ 28,8 (C-19); 17,8 (C-20) trong BM.10

nhóm metyl tại δ 22,5 (C-17), 11,5 (C-18), 20,3 (C-2"), 1 nhóm metoxy tại δ 53 (C-2'), 2 nhóm metylen tại δ 28,5 (C-6), 73,3 (C-19), 5 nhóm metin liên kết với ôxy tại δ 81,1 (C-1), 83 (C-7), 72,4 (C-11), 75,8 (C-12), 67,0 (C-15), 3 nhóm metin tại δ 43,5 (C-5), 42,8 (C-9), 51,5 (C-14) và 8 cacbon không liên kết hydro

6,11 (m, H-3)

Kết hợp phân tích các tương tác trong phổ HMBC, COSY của BM.15 cho

124,3 (C-3), 162,9 (C-4), một nhóm cacbomethoxy ở δ 172,6 (C-1'); 53,0 (C-2')

và một nhóm axetyl ở δ 169,0 (C-1"); 20,3 (C-2")

Phổ HMBC của BM.15 còn thể hiện tương tác của proton H-19 với các

cacbon C-13, C-14 Điều đó chứng tỏ cầu epoxy được nối giữa C-8 và C-13

Từ các phân tích trên ta suy ra được hợp chất BM.15 là một dạng quassinoit

khung C-20 (năm vòng, pentacyclic) có hai mạch nhánh ở C-13 và C-15

Cấu trúc lập thể của BM.15 được xác định dựa vào phổ NOESY Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ NOESY của BM.15 cho thấy có tương tác giữa

cạnh đó, trong phổ NOESY còn có tương tác giữa H-19/H-7;H-14,

và cầu nối metylenoxy giữa C-8 và C-13 là có cấu hình b

Phổ khối ESI-MS của BM.15 có một peak ion giả phân tử tại m/z 463,0

Hình 3.40 Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của

hợp chất BM.15

Từ cây Khổ sâm mềm đã phân lập được hai quassinoit là soulameanone

BM.10 và isobrucein B BM.15 Hai hợp chất này được thử hoạt tính kháng bốn

dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) Kết quả thể hiện hợp chất

BM.15 có hoạt tính rất mạnh, thậm chí mạnh hơn cả chất đối chứng dương

ellipticine, trong khi đó thì hợp chất BM.10 lại không có hoạt tính Khi so sánh

về mặt cấu trúc của hai hợp chất này ta thấy hợp chất BM.15 có các đặc điểm

như có hệ vòng picrasane với một nhóm keton ở vị trí C16; một hệ liên hợp α,b-keton không no ở vòng A; một cầu epoxymethanon nối giữa C8 và C13 và

có các mạch nhánh este ở C13 và C15 Như vậy, các đặc điểm cấu trúc trên là cần thiết cho tác dụng kháng ung thư của các quassinoit

Bảng 3.9 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15

Vị trí δ H (ppm)

(CDCl 3 , 500 MHz)

δ C (ppm) (CDCl 3 ,

125 MHz)

HMBC (H®C)

COSY (H®H)

NOESY (H®H)

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 và chất tham khảo

(ppm) (125 MHz)

(ppm) (125 MHz)

Hình 3.41 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.15

Hình 3.42 Phổ DEPT của hợp chất BM.15

Hình 3.43 Phổ HSQC của hợp chất BM.15

Hình 3.47 Phổ ESI-MS của hợp chất BM.15

Hợp chất GP.27: 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')-b (methylamino)ethyl}phenol (chất mới)

-D-glucopyranosyl]-2-Hợp chất GP.27 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng nâu, tan tốt trong

chất GP.26 (p-synephrine), ngoại trừ tín hiệu của hai nhóm đường tại δ 62,8, 64,8,

72,0, 72,4, 73,0, 73,8, 74,9, 76,3, 78,0, 94,0 và 98,2 Ta dự đoán đây là một dạng

dẫn xuất diglycoside của p-synephrine

H-1') và 5,12 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-1") tương ứng với các cacbon tại δ 98,2 (C-H-1') và

94,0 (C-1")

Từ các dữ liệu phổ HMBC và COSY xác định được hai nhóm đường là

D-glucopyranosyl và L-arabinofuranosyl Proton anome (δ 4,5, J = 8,0 Hz) cho

3,5 Hz) của nhóm đường L-arabinofuranosyl chứng tỏ nhóm đường này có cấu hình α Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác mạnh giữa proton H-2' (δ 3,16) của phần đường glucopyranosyl với cacbon C-7 (δ 69,8) của phần aglycon và proton H-7 (δ 4,89) của phần aglycon với cacbon C-2' (δ 76,3) của phần đường

vào vị trí C-7 của phần aglycon, ngoài ra còn có tương tác của proton H-1'' (δ

5,12) của phần đường arabinofuranosyl với cacbon C-4' (δ 74,9) của phần đường glucopyranosyl cho thấy hai nhóm đường gắn với nhau qua cầu C1''-O-C4'

NOESY (H→H)

Phổ ESI-MS của GP.27 cho peak ion giả phân tử tại m/z 506,2

Từ các phân tích trên ta có thể đưa ra cấu trúc và sơ đồ phân mảnh của GP.27 là

Hình 3.104 Sơ đồ phân mảnh của hợp chất GP.27 trong phổ ESI-MS

Kiểm tra tư liệu đã công bố, cho đến nay chưa thấy một glycoside nào của

p-synephrine được phát hiện Do đó, có thể khẳng định hợp chất này là chất mới, nó là một dạng dẫn xuất diglycoside của p-synephrine (GP.26) và được

H HO

O

O HO

HO

H CH3

HO

1 2

3 4 5 6

7

8 9

1'

2' 3'

4' 5' 6'

1'' 2'' 3''

4''

5''

OH H

H HO

O

O HO

HO

H CH3

HO

1 2

3 4 5 6

7 8 9

1'

2' 3'

4' 5' 6'

1'' 2'' 3''

4'' 5''

H H

H

H

H H

COSY NOESY