tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (livistona halongensis) và cây rau má (centella asiatica)

tuy nhiên hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của các cây trong họ Cau của Việt Nam được công bố.. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

I.1 Ý nghĩa của luận án

Cuộc sống ngày càng đối mặt với nhiều nguy cơ: thảm họa môi trường, các chứng bệnh nan y như ung thư, HIV/AIDS, bệnh tim mạch hay là những dịch bệnh phức tạp, nguy hiểm mới xuất hiện gần đây: dịch SARS, cúm H5N1, H1N1, v.v một số loài động, thực vật bị đưa vào sách đỏ và tuyệt chủng Điều đó thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm

ra thuốc chữa bệnh có tác dụng chọn lọc, hiệu quả cao và giá thành rẻ để trị bệnh cũng như nghiên cứu tìm cách bảo vệ, bảo tồn các loài động thực vật quý hiếm Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người, gia súc và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính được sử dụng trực tiếp để làm thuốc

hoặc dùng làm "Mô hình" cho các nghiên cứu tổng hợp và bán tổng hợp

các loại thuốc mới Họ Cau là họ thực vật lớn, có rất nhiều cây đã gắn liền với đời sống của nhân dân ta cũng như một số nơi trên thế giới như Trung Quốc, Australia, tuy nhiên hầu như có rất ít công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học và hoạt tính sinh học của các cây trong họ Cau của Việt Nam được công bố Cây rau má, trong dân gian được sử dụng

để làm rau ăn, nước giải khát và được sử dụng trong nhiều bài thuốc để trị một số các chứng bệnh thường gặp ở người và gia súc và rất quen thuộc với chúng ta Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi chọn đề

tài “Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất phân

lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis T.H Nguyen & Kiew)

và cây rau má [Centella asiatica (Linn.) Urban]”

I.2 Mục tiêu của luận án

Nghiên cứu, phát hiện các chất có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh

học lý thú từ các loài thuộc chi Cọ (Livistona R.Br.), họ Cau

(Arecaceae) và cây rau má ở Việt Nam, cụ thể là cây cọ hạ long và cây rau má tại Ba vì Hà Nội

I.3 Những đóng góp mới của luận án

- Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học

của dịch chiết và các hợp chất phân lập từ cây cọ hạ long (Livistona halongensis) được nghiên cứu

- Đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất từ cây cọ hạ long, trong

đó có 3 hợp chất mới và 6 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Cọ

- Từ cây rau má thu hái tại Ba Vì - Hà nội đã phân lập được 2 hợp chất

là 2 chất triterpen chính với hàm lượng khá cao và 1 hỗn hợp 2 chất

stigmasterol glucosid + β-sitosterol glucosid

- Công bố về hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng oxy hóa của các dịch chiết và một số hợp chất phân lập từ cây cọ

hạ long (Livistona halongensis) và cây rau má (Centella asiatica)

I.4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 195 trang với 3 chương, 18 bảng, 39 hình, 3 sơ đồ,

81 tài liệu tham khảo và 3 phụ lục Luận án được bố cục như sau: Mở đầu: 3 trang; Tổng quan: 29 trang; Thực nghiệm: 25 trang; Kết quả và thảo luận: 55 trang, Kết luận và kiến nghị: 3 trang, Danh mục công trình liên quan đến luận án: 1 trang, Tài liệu tham khảo: 8 trang, phụ lục 71 trang

II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

Mở đầu: Đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượng, mục tiêu

và nhiệm vụ của luận án

Chương 1: Tổng quan

Trên cơ sở nghiên cứu tài liệu, chương tổng quan đề cập đến đặc điểm thực vật, ứng dụng trong y học cổ truyền và tình hình nghiên cứu về hóa

học, hoạt tính sinh học của một số loài trong chi Cọ (Livistona R.Br.),

và chi Rau má (Hydrocotyle; Centella)

Chương 2: Thực nghiệm

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình chiết: Mẫu thực vật được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ

phòng sau đó chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, diclometen, metanol Cất loại dung môi thu được các cao chiết tương ứng

Phân lập các chất: Tinh chế các cao chiết thu được bằng các

phương pháp sắc ký: sắc ký cột thường, sắc ký cột nhanh với các chất hấp phụ và các hệ dung môi thích hợp

Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác

định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…)

Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính chống oxy hóa

2.3 Phân lập các hợp chất từ cây cọ hạ long: (Sơ đồ 2.1, Sơ đồ 2.2 ) 2.4 Phân lập các hợp chất từ cây rau má: (Sơ đồ 2.3)

Sơ đồ 2.1 Phân lập các chất từ vỏ cây cọ hạ long (L halongensis)

Sơ đồ 2.2 Phân lập các chất từ rễ cây cọ hạ long (L halongensis)

Vỏ thân cọ khô xay nhỏ (900g)

Cao MeOH 24,9 g (LHV.m)

Chiết lần lượt: n-hexan, diclometan, MeOH Cất loại dung môi

Kết tinh: n-hexan/ EtOAc(1:1)

Sơ đồ 2.3 Phân lập các chất từ cây rau má [C asiatica (L.) Urban.]

Chương 3: Kết quả và thảo luận

3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cọ hạ long (Livistona

Chiết với CH 2 Cl 2

Chiết với n-hexan Cất loại MeOH

Chiết MeOH 3 lần, t=80 0 C, 2h, thêm H2O

Cất loại dung môi

Thủy phân NaOH 10%, 2h, t=80 0 C

Trung hòa bằng HCl 5%, lọc kết tủa Cao nước (120g)

Cất loại dung môi

Phổ hồng ngoại của chất 67 có đỉnh hấp thụ của nhóm = CH2

(1712 cm-1) bên cạnh các dao động của nhóm –CH2 và –CH3 (2920,

hình 4.2) cho pic ion phân tử tại m/z = 425,38078 [M+H]+, theo tính

thể là một triterpen xêtôn có chứa vòng cyclopropan và nhóm (=CH2)

H-NMR có tín hiệu cộng hưởng của hai proton vòng cyclopropan tại  = 0,324 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-19A) và 0,553 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-19B);

3 x s Các số liệu trên cho phép dự đoán chất 67 là cyclomusalenon Phổ

cyclopropan cũng được thấy rõ qua tương tác của H19A (0,324 ppm) và H19B (0,553 ppm) Những tín hiệu khác bị trùng lặp nhiều Phổ HSQC

C-2 (41,0 ppm), tương tác giữa C19 (27,0 ppm) và H19A (0,324 ppm)

và H19B (0,553 ppm) Phổ HMBC cho thấy tương tác của C-3 (213,4

vị trí C3 là đúng Ngoài ra còn thấy rõ tương tác giữa H3-27 (1,573 ppm) với C24 (41,6 ppm); C25 (150,2 ppm); C26 (109,4 ppm).Tổng hợp các dữ liệu trên và sau khi so sánh phổ 13C-NMR của chất 67 với

phổ của 4-epicyclomusalenon ghi trong cùng điều kiện và của

cyclomusalenon đã kết luận được rằng chất 67 là cyclomusalenon

[(24S)-24-methyl-29-norcycloart-25-en-3-on]

*) Chất 68 (LHVn5a): Cycloleucadenon

Phổ hồng ngoại của chất 68 cho các tín hiệu hấp thụ của nhóm

68 cho các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho vòng cyclopropan tại  =

0,566 (1H, d, J= 3,9 Hz, H-19A), 0,791 (1H, br s, H-19B), 4,66 (2H, m,

=CH2) và tín hiệu của 7 nhóm methyl trong đó có hai tín hiệu methyl

của 31 nguyên tử carbon, trong đó có 7 nhóm CH3, 12 nhóm CH2, 5

nhóm CH và 7 carbon bậc 4 Từ các số liệu phổ thu được cho thấy 68 và

67 là hai chất có cùng một cấu trúc khung, tuy vậy 68 có nhiều hơn một

Như vậy chất 68 có công thức phân tử là C31H50O (M= 438) So sánh

cycloleucadenone ghi cùng dung môi cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau Vậy kết luận, chất 68 chính là cycloleucadenon

*) Chất 69 (LHVn4): 3β- Cyclomusalenol

Phổ hồng ngoại của chất 69 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm

có cùng khung carbon với chất 67 Sự có mặt của nhóm isopropenyl thể

(s) So với phổ của chất 67 thì phổ của chất 69 không chứa nhóm

là ở vị trí β (3β-OH) dựa vào sự tách vạch của tín hiệu của H-3 là một

dt Trong trường hợp 3α-OH thì tín hiệu của H-3 sẽ là một singlet (s)

và 5 carbon bậc 4 Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z = 427,36355 phù hợp với công thức phân tử là

H-NMR của 3β- Cyclomusalenol phân lập được từ cây chuối hột (Musa

balbisiana colla), có thể kết luận chất 69 là 3β-cyclomusalenol

[(24S),14α, 24-dimethyl-9β,19-cyclo-5α-cholest-25-en- 3β-ol]

*) Chất 70 (LHVn7 = LHRn3): Stigmast-4-en-3-on

Phổ hồng ngoại của chất 70 cho đỉnh hấp thụ của nhóm carbonyl

Hz, CH3-27), 0,86 (3H, d, J = 7,4 Hz, CH3-21) và nhóm metyl gắn với

(Hình 4.13) với các tín hiệu C =199,598 (s, C-3), 171,653 (s, C-5) và

C-NMR và phổ DEPT của chất 70 có tín hiệu của 29 nguyên tử carbon,

trong đó có 6 nhóm CH3, 11 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 4 nguyên tử carbon bậc 4 Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) cho pic ion phân tử

là C29H48O (M=412) Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 70 hoàn toàn phù hợp với phổ của chất stigmast-4-en-3-on trong tài liệu Như vậy chất 70

chính là stigmast-4-en-3-on

*) Chất 71 (CT1): Stigmasterol

Chất 71: Được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng

29 cacbon, trong đó có 3 cacbon bậc bốn, 11 cacbon bậc ba, 9 cacbon

của hai liên kết đôi ở vị trí C5 = C6: ( = 140,8 và 121,7) và vị trí C22 =

H-19), ba nhóm metyl gắn với –CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,798 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,848 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02

tín hiệu cộng hưởng của một olefin proton ( = 5,35 (1H, br s, H-6) và hai olefin proton ( = 5,02 (1H, dd, J = 8,7, 15.2 Hz, H-22) và 5,16 (1H,

dd, J = 8,6, 15,2Hz, 23) ; một proton carbinol:  = 3,51 (1H, m,

pic cơ bản, hình thành do tạo thành dẫn xuất dien liên hợp (3,5-dien) sau

khi phân tử 71 bị tách một phân tử nước Kết hợp các dữ kiện phổ

của chất 71 là stigmasterol

*) Chất 72 ( LHVH2): β-Sitosterol

Chất 72 được xác định là β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1

3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ rễ

cây cọ hạ long (Livistona halongensis)

*).Chất 73 (LHRn2):

6-O-acetyl-2R,8-dimetyl-2-(4R,8R,11-trimetyltridecence-12)chroman

Chất 73 thu được dưới dạng bột vô định hình, có pic ion phân tử

đó có 3 nhóm thể hiện dưới dạng tín hiệu dublet ở H = 0,84 (J = 5,9

= 2,13 có thể được gán cho nhóm metyl đính vào vòng thơm; tín hiệu metyl của nhóm axetyl cộng hưởng ở 2,24 ppm và metyl của nhóm isopropenyl xuất hiện ở 1,64 ppm Ngoài ra, các tín hiệu của hai proton thơm có tương tác meta ở 6,60 và 6,66 ppm (mỗi tín hiệu d, J = 2,6Hz), hai proton olefin (>C=CH2) ở 4,66 ppm cũng như các proton no trong

DEPT, bao gồm 7 nhóm metyl, 8 cacbon thơm, 11 nhóm metylen, 2 nhóm metin và 2 cacbon bậc 4 Sự có mặt của phần 2-metylchroman

axetat trong phân tử 73 được chứng minh qua 3 nhóm tín hiệu: vòng

thơm, aliphatic metylen và metyl Các tương tác trong phổ HMBC đã khẳng định cấu trúc của phần 2-metylchroman axetat trong phân tử chất

73 Các tương tác đó là tương tác giữa một cacbon trong cầu ete (C = 150,37, C-8a) với hai proton thơm ở H = 6,60; 6,66 (H-5, H-7), hai

H = 2,13 (8-CH3) và tương tác của cacbon thứ 2 trong cầu ete (C =

nhóm metyl ở C-2 được xác định bằng sự dịch chuyển về phía trường thấp của C-6 (142,51 ppm) và các tương tác quan sát được trong phổ

và 2-CH3 (1,25 ppm) Các dữ liệu phổ đã phân tích cho phép kết luận

cấu trúc của đơn vị 2-metylchromanol-6-axetat trong chất 73 Cấu trúc

của mạch nhánh được chứng minh qua các tương tác giữa C-12' (C =

hai ở H = 1,00 (d, 3H-11') trong phổ HMBC Vị trí nối kết của mạch

định dựa vào so sánh với tài liệu tham khảo công bố bởi Browstein và Brem Theo các tài liệu này, các đồng phân quang học khác nhau của α

-4’ Do đó, có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của chất 73 dựa vào

đồng phân quang học của δ- tocopherol đã được nghiên cứu và thống kê trong tài liệu Qua đối chiếu với tài liệu tham khảo, độ chuyển dịch hóa

R, R của chất 3,4-dehydrotocopherol Do đó cấu trúc của chất 73 được

6-O-acetyl-2R,8-dimethyl-2-(4R,8R,11-trimethyltridecence-12)chroman

*) Chất 75 (LHRm1): 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben:

các tín hiệu của một nhóm methoxy ở δH 3,83 (3H, s) cùng với năm

Hz) và 6,85 (1H, d, J = 16,2 Hz) Các tín hiệu proton thơm thuộc hai vòng benzen, trong đó ba proton thuộc một vòng thơm bị thế ở vị trí C-

13

C NMR của chất 75 cho tín hiệu của 15 cacbon trong đó có 7 x CH, 1

ppm Các số liệu phổ cho thấy chất 75 có chứa khung stilben với 5

nhóm thế trong đó có 4 nhóm OH và một nhóm methoxy Qua so sánh

số liệu phổ với tài liệu tham khảo chứng tỏ chất 75 có công thức cấu tạo

là 3,5,3’,5’-tetrahydroxy-4-metoxystilben Từ các số liệu ESI-MS, phổ

chúng tôi xác định được cấu trúc của chất 75 như trên

*) Chất 76 (LHRm2): 2S,3S-3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan

Công thức phân tử của 76 là C16H16O6 được xác định qua pic ion

ESI-MS Để khẳng định cấu trúc của chất 76, chúng tôi đã axetyl hóa chất 76 tạo dẫn xuất tetraaxetyl 80 của nó Phổ HR-ESI MS của chất 80 có pic

1

doublet có hằng số tương tác meta (J = 2,2 Hz) ở H 5,97 và 5,95 cho

2,77 đặc trưng cho khung 3 hydroxyflavan Tương tác của proton của

tích đầy đủ tương tác trực tiếp trong phổ HSQC và tương tác qua 2 hoặc

3 liên kết trong phổ HMBC cho phép kết luận cấu trúc của chất 76 là

3,5,7,3’-tetrahydroxy-5’-metoxyflavan Hằng số tương tác bé của H-2

và H-3 cho biết 2 proton này ở vị trí cis với nhau, như vậy chất 76 sẽ có cấu hình tương đối là (2R, 3R) hoặc (2S, 3S) Chất 76 có năng suất quay

25

= +2,7 ( c = 2,84, MeOH) so sánh với tài liệu tham khảo gợi ý

cho biết cấu hình của chất 76 là 2S, 3S Bằng kết hợp số liệu phổ phân tích ở trên đã xác định được cấu trúc của 76 là: 2S,3S-3,5,7,3’-

tetrahydroxy- 5’- metoxyflavan Đây là một chất mới, lần đầu tiên tìm thấy trong thiên nhiên

*) Chất 77 (LHRm3): β-sitosterol-3-O-β–D-glucopyranosid

(β-sitosterol glucosid)

0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 1,00 (3H, d, J = 6,7Hz) Ngoài ra, trên phổ

1

5,32 (1H, br s) và tín hiệu của một nhóm metin mang oxi tại 3,42 (1H, m) Các tín hiệu của các proton còn lại bị trùng lấp lên nhau trong

3,10-3,14 (3H, m) và tín hiệu của nhóm metilen mang oxi tại δH 3,64

H-NMR của chất 77 còn cho tín hiệu của một proton anome tại δH 4,22

C-NMR của hợp chất 77 cho thấy sự xuất hiện của 35 cacbon trong đó có

29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường Tín hiệu của

11,62; 11,73; 18,56; 18,90; 19,04 và 19,65, tín hiệu của một nhóm metin mang oxi của aglycon tại δC 70,09 (C-3) Ngoài ra còn có tín hiệu của

73,43; 76,69; 76,74 và 76,90 Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy chất 77

là một tritecpen khung prostan có gắn thêm một nhánh đường

β-glucopyranose Qua so sánh với tài liệu tham khảo ta xác định chất 77 là

daucosterol

*) Chất 78 (LHRm4): 2R,3R-3,7,3’-trihydroxy-5’-metoxyflavan 5-O- D-glucopyranosid

được công thức phân tử của 78 là C22H26O11 Dữ kiện phổ MS, 1H-, 13

C-NMR cho thấy chất 78 có cùng cấu trúc khung và nhóm thế giống chất

76 nhưng có thêm một đường hexose Tín hiệu của 5 nhóm oxymethin

Proton anomeric ở H 4,85(d, J = 7,5 Hz) cho thấy đây là đường

β-D-glucopyranose Tương tác của H-1” (H 4,85) với C-5 (C 158,4) trong

quy kết cho C-5 mà không phải là C-7 vì nếu là C7 thì phải có tương tác

với cả 2 proton liền kề (C-7/H-6, H-8) Cấu hình cis của H-2 và H-3

và ngược dấu so với chất 76, cho thấy chất này cấu hình tuyệt đối là 2R,

3R Từ việc phân tích số liệu phổ 1 chiều, 2 chiều và kết hợp với công

thức phân tử đã xác định được cấu trúc của 78 là

mới

*) Chất 79 (LHRm6): Sacharose octaacetat