Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhược tinh đã được lọc rửa

Nguyễn Phương Thảo Tiên 2007 khi tiến hành nghiên cứu trên những mẫu tinh dịch bình thường, tác giả thấy không có sự khác biệt về các chỉ số chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu g

===    ===

PHẠM THỊ THU THỦY

§¸NH GI¸ CHÊT L¦îNG TINH TRïNG SAU B¶O QU¶N L¹NH s©u ë NH÷NG MÉU NH¦îC TINH §· §¦îC LäC RöA

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2011

PHẠM THỊ THU THỦY

§¸NH GI¸ CHÊT L¦îNG TINH TRïNG

SAU B¶O QU¶N L¹NH s©u ë NH÷NG

MÉU NH¦îC TINH §· §¦îC LäC RöA

Chuyên ngành : Mô học - Phôi thai học

Mã số : 60.72.01

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Khang Sơn

HÀ NỘI - 2011

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bảo quản lạnh mô và tế bào là kỹ thuật bảo quản mô và tế bào sống ở nhiệt độ cực thấp Quá trình sống đòi hỏi sự vận động của các phân tử trong môi trường nước Bảo quản lạnh làm môi trường nước ở trong và ngoài tế bào biến đổi thành thể rắn, quá trình đó làm ngừng chuyển động các phân tử và các quá trình sinh học trong tế bào Bảo quản lạnh được coi là thành công nếu

tế bào trở lại hoạt động sống bình thường, không bị tổn thương về cấu trúc cũng như chức năng khi đưa về 37oC [6], [23]

Bảo quản lạnh tinh trùng là một kỹ thuật quan trọng thường được sử dụng trong hỗ trợ sinh sản Kỹ thuật này được thực hành rộng rãi để lưu trữ tinh trùng trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo hay thụ tinh trong ống nghiệm [40]

Chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng tinh trùng trước bảo quản lạnh, quy trình bảo quản, môi trường bảo quản, nhiệt độ bảo quản

Sau bảo quản lạnh các mẫu tinh trùng bình thường, nhiều nghiên cứu cho thấy các chỉ số về mật độ, độ di động, khả năng sống của tinh trùng đều giảm rõ rệt so với trước khi bảo quản [13],[27],[67] Đánh giá ảnh hưởng của quá trình bảo quản lạnh lên chất lượng tinh trùng ở mẫu tinh dịch bất thường

là vấn đề gần đây đang được quan tâm [19],[24],[50] Quá trình này góp phần bảo quản, lưu giữ các tinh trùng được coi là quý hiếm đối với những bệnh nhân nam bị vô sinh do bất thường tinh trùng Ngày nay, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản mà hy vọng có con của các bệnh nhân này hoàn toàn có thể thực hiện được

Quá trình lọc rửa tinh trùng trước khi bảo quản giúp loại bỏ tinh tương, các tinh trùng chết, tinh trùng bất thường, các mảnh vỡ, vi khuẩn, bạch cầu, các gốc oxy hoạt động… Việc lọc rửa tinh trùng còn loại bỏ hầu hết HIV,

HCV, CMV, HPV, hạn chế sự lây nhiễm chéo trong quá trình bảo quản lạnh trong nitơ lỏng [18],[24],[30] Nguyễn Phương Thảo Tiên (2007) khi tiến hành nghiên cứu trên những mẫu tinh dịch bình thường, tác giả thấy không có

sự khác biệt về các chỉ số chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu giữa các mẫu tinh trùng đã được lọc rửa và những mẫu tinh trùng không được lọc rửa [13] Hiệu quả của việc lọc rửa tinh trùng trước khi bảo quản lạnh đối với các mẫu tinh dịch bất thường như thế nào Sau quá trình bảo quản lạnh các mẫu tinh trùng đã được lọc rửa có thể thu hồi được những tinh trùng tốt để chuẩn bị cho hỗ trợ sinh sản hay không Hiện chưa có nhiều nghiên cứu về việc bảo quản lạnh những mẫu tinh trùng bất thường của người nên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhƣợc tinh đã đƣợc lọc rửa” với mục tiêu:

1- Đánh giá chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh sâu ở những mẫu nhược tinh đã được lọc rửa

2 - Xác định ảnh hưởng của việc lọc rửa đối với các mẫu nhược tinh được bảo quản lạnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VÔ SINH NAM

Vô sinh là một vấn đề của toàn xã hội Vô sinh hiện nay có chiều hướng ngày càng gia tăng Theo những số liệu điều tra dân số trong những năm gần đây, có khoảng 7-10% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh [8],[11] Trên thế giới vô sinh cũng chiếm một tỷ lệ tương tự, vào khoảng 10 -15% [54]

Có nhiều nguyên nhân gây ra tình trạng vô sinh, trong đó nguyên nhân

do nam và do nữ là ngang nhau [12]

Trong số các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới, có đến 90% nguyên nhân do bất thường tinh trùng [11] Những bất thường tinh trùng thường gặp là: số lượng tinh trùng ít (thiểu tinh), tinh trùng di động kém (nhược tinh), tinh trùng dị dạng (quái tinh) và không có tinh trùng (vô tinh) [8]

R Gurevich (2010) cho biết tỉ lệ nam giới bị vô sinh do không có tinh trùng chiếm 10-15% và tỉ lệ những người không có tinh trùng chiếm khoảng 1% dân số nói chung [54] Tác giả Nguyễn Xuân Quý (2004) khi nghiên cứu trên 396 cặp vợ chồng điều trị vô sinh cho kết quả: vô tinh chiếm tỷ lệ 10,1%, thiểu tinh chiếm 27,3%, tỷ lệ nhược tinh là 71,9 % và quái tinh chiếm tỷ lệ 74,2 % [11]

Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Poongothai J (2009) có đến >50% các trường hợp vô sinh nam không rõ nguyên nhân [53]

Số lượng và độ di động của tinh trùng là những yếu tố quan trọng giúp cho tinh trùng có khả năng thụ tinh Theo WHO 1999, một mẫu tinh dịch bình

thường có ít nhất 50% tinh trùng di động tiến tới Mẫu tinh dịch được coi là nhược tinh khi tỷ lệ tinh trùng di động trong mẫu ít hơn 50% [68] Nhược tinh thường kết hợp với thiểu tinh, chỉ một số ít người có số lượng tinh trùng bình thường nhưng khả năng di động của tinh trùng kém [46]

Cơ chế sinh bệnh học của bệnh nhược tinh vẫn còn chưa rõ ràng, tuy nhiên các tác giả nghiên cứu cũng đề cập đến các yếu tố nguy cơ của bệnh như: nhiễm trùng, phẫu thuật, các chất kích thích, ảnh hưởng của các chất gây

ô nhiễm môi trường, hóa chất, bức xạ…Một trong các cách mà các chất gây ô nhiễm môi trường ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng là chúng tác động vào

cơ thể, kích thích cơ thể sản xuất các gốc tự do trong quá trình chuyển hóa tế bào Trong khi cơ thể con người tạo ra chất chống oxy hóa để bảo vệ tế bào khỏi các gốc tự do thì các chất gây ô nhiễm môi trường và sự gia tăng các gốc

tự do đã phá vỡ cân bằng mong manh đó và gây ra những bất thường về mật

độ, độ di động và hình dạng của tinh trùng [36] Zhou QZ và cs (2009) cũng

đã tìm thấy một số gen (tektin-2, DNAI1, DNAH5, ) và các protein (ACTB, ANXA5, PRM1, ) có liên quan đến bệnh nhược tinh [70]

Vô sinh nam thường được chẩn đoán bằng xét nghiệm phân tích tinh dịch Điều trị vô sinh nam hiện nay chủ yếu nhằm nâng cao chất lượng tinh trùng, do đó làm tăng khả năng chọn lọc được những tinh trùng tốt để chuẩn

bị cho HTSS Năm 1995, kỹ thuật chọc hút tinh trùng từ mào tinh qua da và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Percutanous Epidemal Sperm Aspiration: PESA, Intracytoplasmic sperm injection: ICSI), kỹ thuật phân lập tinh trùng

từ tinh hoàn những trường hợp giảm sinh tinh tại tinh hoàn và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Testicular Sperm Aspiration: TESA/ICSI) được báo cáo thành công Sự thành công của các kỹ thuật này đã mở ra một hướng phát triển mới trong điều trị vô sinh nam [16]

1.2 NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN LẠNH SÂU TINH TRÙNG NGƯỜI 1.2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp bảo quản lạnh sâu tinh trùng người

* Trên thế giới

Ngay từ năm 1776, Spallanzani lần đầu tiên đã dùng nhiệt độ lạnh sâu

-78oC và không sử dụng môi trường để bảo quản tinh trùng Đến năm 1937, Bernstein và Petropavloski đã tiến hành bảo quản thành công các tinh trùng của bò, cừu, ngựa, heo rừng và thỏ ở nhiệt độ -21oC Nghiên cứu của Jahnel (1938) và Parkes (1945) đã công bố phương pháp làm lạnh tinh trùng người [dẫn từ 67]

Hoagland và Pincus (1942) đã mô tả quá trình làm lạnh nhanh tinh trùng người và thỏ bằng việc sử dụng vòng làm lạnh đối với các mẫu nhỏ Các tác giả thu được kết quả lên đến 40% tinh trùng còn sống sót sau phương pháp bảo quản này [dẫn từ 67]

Đến năm 1949, Polge và cộng sự đã sử dụng glycerol làm môi trường bảo quản lạnh Sử dụng glycerol trong bảo quản lạnh tinh trùng đã đem lại kết quả khả quan Nghiên cứu của Polge và cộng sự được coi là dấu mốc quan trọng của bảo quản lạnh mẫu sinh vật hiện đại

Năm 1953, đứa trẻ đầu tiên đã ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh Trong những năm tiếp theo, phương pháp này được áp dụng rộng rãi cùng với các kỹ thuật (hạ nhiệt độ, đóng gói, sử dụng môi trường bảo quản) ngày càng tiến bộ Smirnov (1949) đã bảo quản lạnh thành công tinh trùng thỏ trong nitơ lỏng Đến năm 1963-1964, phương pháp làm lạnh tinh trùng trong nitơ lỏng chính thức ra đời Sherman (1962) đã bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196oC

và chỉ 2 năm sau đó 4 đứa trẻ đã ra đời bằng việc sử dụng tinh trùng đông lạnh -196oC [59] Lizuka và cộng sự (1968) đã sử dụng môi trường có bột

lòng đỏ trứng gà để bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196oC và đã có nhiều trẻ

em ra đời bằng phương pháp này

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu mới về kỹ thuật bảo quản tinh trùng người như: phương pháp đông tinh nhanh sử dụng cọng rạ tự kéo [31],[41], bảo quản tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không cần chất bảo quản [67]… bước đầu đem lại các kết quả khả quan

Ngày nay, nhờ sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, nhiều phương pháp hỗ trợ sinh sản phát triển như: thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh trùng của người cho (artificial inseminatiom of donor semen: AID) hoặc của chồng (artificial inseminatiom of husband semen: AIH), thụ tinh trong ống nghiệm và chuyển phôi (IVF/ET), tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI) nên việc bảo quản tinh trùng phục vụ cho các phương pháp hỗ trợ sinh sản càng cần được mở rộng Sự ra đời của các ngân hàng tinh trùng từ những năm 1970 ở hầu khắp các nước trên thế giới đã góp phần đáp ứng được nhu cầu này

* Tại Việt Nam

Bệnh viện phụ sản Từ Dũ đã thực hiện thành công bảo quản lạnh tinh trùng người vào năm 1995, đặt tiền đề cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1997 [9] Cho đến nay, nhiều

cơ sở như: Bệnh viện Từ Dũ, Học viện Quân y, Bộ môn Mô Phôi học - Trường Đại học Y Hà Nội,… đã có những nghiên cứu được công bố về lĩnh vực này Gần đây, kỹ thuật bảo quản tinh trùng phát triển khá nhanh cùng với

sự ra đời của các ngân hàng tinh trùng trong nước đã đáp ứng được nhu cầu điều trị của số lượng lớn bệnh nhân

Phương pháp bảo quản tinh trùng được áp dụng phổ biến ở Việt Nam hiện nay là bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ lạnh sâu -196oC, trong nitơ lỏng, quy trình hạ nhiệt độ từ từ, có sử dụng môi trường bảo quản [14]

1.2.2 Những nghiên cứu về quy trình bảo quản lạnh sâu tinh trùng người Nghiên cứu về quy trình bảo quản lạnh sâu tinh trùng người đã được nhiều tác giả đề cập và đưa ra những quy trình bảo quản khác nhau Nhìn chung, quy trình bảo quản tinh trùng người gồm các bước sau:

- Chọn mẫu và xét nghiệm tinh dịch

- Cân bằng với môi trường bảo quản lạnh

- Đóng gói

- Hạ nhiệt độ

- Lưu trữ trong nitơ lỏng

- Tan đông

1.2.2.1 Chọn mẫu và xét nghiệm tinh dịch

Tùy theo mục tiêu nghiên cứu mà mẫu tinh dịch được chọn để xét nghiệm sẽ có các tiêu chuẩn khác nhau Cách đánh giá mẫu tinh dịch đa số các tác giả áp dụng theo tiêu chuẩn của WHO 1999 Hiện nay, Bộ môn Mô-Phôi, Đại học Y Hà Nội và nhiều cơ sở khác cũng đã áp dụng tiêu chuẩn này trong xét nghiệm tinh dịch đồ

1.2.2.2 Cân bằng với môi trường bảo quản lạnh

Nhiều tác giả đã sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau để bảo quản

tinh trùng người Công bố về hiệu quả của các môi trường trong bảo quản lạnh tinh trùng cũng rất khác nhau

Ban đầu, các tác giả sử dụng glycerol đơn thuần để làm môi trường bảo quản lạnh Từ năm 1937, Bernstein và Petropavlovski đã sử dụng glycerol 0,5-3M để bảo quản lạnh các tinh trùng của động vật Các tác giả đã thu được những kết quả tốt nhất ở nồng độ glycerol 0,5-2M Về sau, nhiều tác giả đã bổ sung thêm các chất khác cùng với glycerol để tăng hiệu quả bảo quản lạnh như: bột lòng đỏ trứng gà, các acid amin…[31],[59]

Năm 1999, J.K Sherman khi đánh giá hiệu quả của hai môi trường bảo quản lạnh đã đưa ra kết luận: tỷ lệ tinh trùng sống sau bảo quản không có sự khác biệt khi sử dụng môi trường bảo quản là glycerol-egg yolk hay glycerol đơn thuần [59]

Năm 2000, tác giả Hallak J và cộng sự đã nghiên cứu so sánh khi sử dụng môi trường bảo quản là TEST-Yolk và glycerol ở các khoảng thời gian bảo quản khác nhau Kết quả cho thấy: tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng hình thái bình thường ở nhóm TEST-Yolk cao hơn so với nhóm glycerol (p<0,05)

Từ các nghiên cứu trên, các tác giả đều khuyến cáo TEST-Yolk là môi trường được lựa chọn đầu tiên để bảo quản lạnh tinh trùng người

Ở Việt Nam, theo Trịnh Sinh Tiên (2002): quy trình bảo quản tinh trùng người dùng môi trường GEYC và môi trường Sperm Freeze có hiệu quả với chỉ

số sống sót sau bảo quản lạnh (Cryosurvival Factor: CSF) ≥ 50%, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với bảo quản ở môi trường glycerol đơn thuần [14]

1.2.2.3 Đóng gói

Các mẫu tinh dịch sau khi được làm cân bằng với môi trường bảo quản lạnh được nạp vào các dụng cụ đóng gói chuyên dụng Có hai hình thức đóng gói hay được sử dụng là cọng rạ (straw) bằng nhựa 0,25 ml, 0,5 ml hoặc tuýp chịu lạnh (cryovial) 2ml

Hiện chưa có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của hai hình thức đóng gói này Theo Marcelo Borges Cavalcante (2006): sử dụng tuýp chịu lạnh mang lại kết quả tốt hơn so với sử dụng cọng rạ [47] Ghasem Saki và cộng sự còn đề xuất sử dụng cọng rạ tự kéo để bảo quản một lượng nhỏ tinh trùng người cho kết quả khả quan hơn việc sử dụng cọng rạ thông thường [31]

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa các bước đóng gói trong bảo quản tinh trùng người [59] 1,2 : Cho môi trường bảo quản (glycerol) vào mẫu tinh dịch 3,4 : Nạp mẫu tinh dịch đã có chất bảo quản vào cọng rạ

5,6 : Hàn kín cọng rạ chứa tinh dịch bằng máy ép nhiệt

7,8 : Cọng rạ được đưa vào giá đông lạnh

Sau khi nạp tinh dịch vào dụng cụ đóng gói, đầu của dụng cụ sẽ được bịt kín bằng máy ép nhiệt hoặc cement chuyên dụng hoặc bằng vặn chặt nút Sau

đó, cọng rạ hoặc tuýp chịu lạnh chứa mẫu được đưa vào giá hoặc khung đông lạnh (hình 1.1)

1.2.2.4 Hạ nhiệt độ

Có nhiều phương pháp hạ nhiệt độ khác nhau Ngay từ năm 1776, Spallanzani lần đầu tiên đã dùng nhiệt độ lạnh sâu -78oC để bảo quản tinh trùng Đến năm 1937, Bernstein và Petropavloski đã tiến hành bảo quản thành công các tinh trùng của động vật có vú ở nhiệt độ -21oC Theo Kuleshova Lilia

và cộng sự (2002) tinh trùng người có thể được bảo quản thành công bằng kỹ thuật thủy tinh hóa với tốc độ làm lạnh cực nhanh (lên đến 7,2x105 o

C/ phút) [41] Tác giả Vladimir Isachenco [67] lại đề cập đến tốc độ làm lạnh chậm hơn (khoảng 150-250oC/ phút) khi bảo quản tinh trùng bằng các vòng bảo quản lạnh

Theo nhiều tác giả, nếu dùng máy lạnh sinh học chạy theo chương trình máy tính hạ nhiệt độ chậm với tốc độ 1- 25oC/ phút là tốt nhất [33], [34],[59]

Hiện nay, phương pháp hạ nhiệt độ được các ngân hàng tinh trùng trên thế giới thường dùng là hạ nhiệt độ bán tự động hoặc tự động theo chương trình hoặc không theo chương trình Một số nơi còn sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng (ở cổ bình trữ nitơ lỏng)

Ở Việt Nam, Bộ môn Mô-Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội và một số

cơ sở HTSS lớn sử dụng máy hạ nhiệt độ bán tự động Nicool 10 chạy theo 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: hạ nhiệt từ 25oC → -10oC, trong 6 phút, tốc độ hạ nhiệt: 5,8oC/ phút

- Giai đoạn 2: hạ nhiệt từ -10oC → -120oC, trong 20 phút, tốc độ hạ nhiệt: 5,5oC/ phút

- Giai đoạn 3: hạ nhiệt từ -120oC → -196oC, trong 5 phút, tốc độ hạ nhiệt: 15,2oC/ phút

Hiện nay, Bộ môn Mô-Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội đang sử dụng quy trình hạ nhiệt độ chậm bằng hơi nitơ lỏng (hạ nhiệt độ ở cổ bình nitơ lỏng theo kinh nghiệm), kết quả cũng tương đương với hạ nhiệt độ bán tự động bằng máy Nicool 10

1.2.2.5 Lưu trữ trong nitơ lỏng

Lưu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng là phương pháp đang được dùng phổ biến hiện nay Theo nhiều tác giả: bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ -196 oC chất lượng tinh trùng ít bị ảnh hưởng vì ở nhiệt độ rất thấp như vậy môi trường nước trong và ngoài tế bào biến thành thể rắn, tế bào ở trạng thái ngừng hoạt động tạm thời

Tinh trùng được bảo quản trong nitơ lỏng trong thời gian dài liệu có bị ảnh hưởng nhiều đến chất lượng không? Theo Yogev L và cộng sự (2010) khi nghiên cứu trên 2525 mẫu tinh dịch được bảo quản lạnh trong thời gian từ 6 tháng đến 15 năm đã cho kết quả: thời gian bảo quản lạnh kéo dài trong nitơ lỏng không ảnh hưởng đáng kể lên mật độ tinh trùng di động tiến tới (10,8 ± 3,3 triệu TT/ml so với 12,3 ± 2,9 triệu TT/ml ) và do vậy không làm thay đổi khả năng thụ tinh của các tinh trùng này [69] Tác giả Aranda Gallegos (1997)

đã nghiên cứu hiệu quả làm IUI với các tinh trùng được bảo quản lạnh của người cho Nghiên cứu được tiến hành trên 26 phụ nữ trải qua 86 chu kỳ IUI cho kết quả: tỷ lệ có thai ở mỗi chu kỳ là 16,6 % và tỷ lệ có thai tổng cộng là 58,3 % [21] Theo Joseph Feldschuh (2005), đã có 2 đứa trẻ ra đời từ tinh trùng bảo quản lạnh sâu sau 21 và 28 năm của cùng một mẫu tinh dịch [37]

1.2.2.6 Tan đông

Tan đông là đưa nhiệt độ của mẫu trữ lạnh lên 37oC Có thể làm tan đông trong không khí (để mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc để trong tủ ấm) hoặc trong nước ấm

Đến nay đã có nhiều phương pháp tan đông Theo Vladimir I (2004) tốc độ tan đông chậm có thể ảnh hưởng lên chất lượng tinh trùng Quá trình này làm tăng thêm các tế bào tổn thương [67] Tác giả Isachenco E (2003) cũng cho rằng quá trình tan đông với tốc độ rất nhanh sẽ giúp ngăn chặn sự kết tinh trở lại của các tinh thể đá, do đó sẽ ít gây hại với tế bào [35]

Theo Sherman J.K, tốc độ tan đông tốt nhất từ 1- 60oC/ phút Tốc độ này phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả [59]

1.2.3 Nghiên cứu áp dụng bảo quản lạnh sâu tinh trùng người

Kỹ thuật bảo quản lạnh (BQL) tinh trùng người được sử dụng để bảo tồn khả năng sinh sản của các cá thể trước một số tình huống: các phẫu thuật

có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản, thắt ống dẫn tinh, hóa trị liệu, liệu pháp xạ trị điều trị các bệnh ung thư…Gần đây, BQL được sử dụng để lưu trữ các tinh trùng được hút từ mào tinh hay tinh hoàn để dùng trong HTSS có độ phức tạp cao

Cho đến nay, đã có nhiều phương tiện dùng để trữ lạnh tinh trùng được

đề cập đến Kỹ thuật đông lạnh một lượng nhỏ tinh trùng với tốc độ cực nhanh bằng cách sử dụng vòng bảo quản lạnh đã được thông báo, giảm thời gian đông lạnh chỉ còn 5 phút [39],[57] Levi Setti và cs (2003) đã trữ lạnh tinh trùng trong màng trong suốt của trứng người có sử dụng môi trường TEST-Yolk cho tỷ lệ hồi phục của tinh trùng là 73% [43] Tuy nhiên, kỹ thuật này có một số hạn chế, ví dụ do phản ứng của màng trong suốt, tinh trùng có thể bị mắc kẹt dẫn đến giảm tỷ lệ tinh trùng hồi phục sau rã đông, hơn nữa kỹ thuật này vừa khó vừa mất nhiều thời gian [31]

Một số tác giả còn đề cập đến kỹ thuật trữ lạnh tinh trùng bằng dịch treo nhưng kỹ thuật này thường không thích hợp với các trường hợp bệnh nhân bị vô tinh, thiểu tinh nặng hoặc bệnh nhân có ít tinh dịch Bởi vì sau phương pháp đông lạnh và rã đông truyền thống, sử dụng kỹ thuật ly tâm pha

loãng tinh dịch có thể làm giảm lượng tinh trùng [31]

Năm 2004, Vladimir I và cộng sự đã phát triển một kỹ thuật mới và

bảo quản lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa không cần chất bảo quản bằng cách nhúng trực tiếp dịch treo có tinh trùng vào nitơ lỏng [67] Các phương pháp truyền thống của thủy tinh hóa đòi hỏi nồng độ chất bảo quản cao với các hậu quả tác động thẩm thấu và độc hại gây chết tế bào Kết quả là các tinh trùng của động vật có vú nhạy cảm với các chất hóa học không thể được bảo quản thành công bằng phương pháp thủy tinh hóa thông thường Trong nghiên cứu của mình, tác giả so sánh độ di động, sự toàn vẹn DNA và khả năng thụ tinh của tinh trùng giữa hai phương pháp thủy tinh hóa không chất bảo quản tốc độ nhanh và tốc độ chậm Kết quả cho thấy: cả hai phương pháp đều làm giảm 40% độ di động của tinh trùng (p<0,05) So sánh độ di động của tinh trùng giữa hai phương pháp BQL tác giả thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê [67]

Nghiên cứu tổn thương do lạnh lên chức năng ty thể, độ di động, hình thái và khả năng sống của tinh trùng, Esteves (2007) đưa ra kết quả: Sau khi

rã đông, tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường giảm 37% (p=0,001), tất cả các thông số di động của tinh trùng đều giảm tương tự, sự hấp thu Rhodamine

123 (chất để đánh giá hoạt động của ty thể) trong ty thể tinh trùng giảm 36%

và khả năng sống của tinh trùng giảm 31% [29]

Nghiên cứu của Nguyễn Phương Thảo Tiên (2007) về chất lượng tinh trùng sau BQL đối với các mẫu tinh dịch bình thường cũng cho kết quả tương

tự Tác giả cho biết: khả năng di động, khả năng sống của tinh trùng sau BQL

giảm đi có ý nghĩa thống kê (p<0,001) so với trước BQL, tỷ lệ bất thường về hình thái vi thể tinh trùng tăng lên sau BQL và thời gian BQL càng dài thì chất lượng tinh trùng càng giảm Tác giả cũng đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về BQL sâu tinh trùng người ở những mẫu tinh dịch bất thường để có thể đưa ra đánh giá đầy đủ hơn [13]

Đánh giá ảnh hưởng của BQL trên các mẫu tinh trùng bất thường chưa được đề cập đến nhiều Năm 2010, Yogev L nghiên cứu ảnh hưởng của BQL lên sự toàn vẹn DNA của tinh trùng của 34 nam giới có khả năng sinh sản bình thường và 166 nam giới bị vô sinh, trong đó: 80 trường hợp tinh trùng bất thường về hình dạng, 32 trường hợp tinh trùng bình thường, 30 trường hợp nhược tinh-quái tinh và 24 trường hợp bất thường phối hợp thiểu-nhược-quái tinh Tác giả cho biết sự toàn vẹn DNA của tinh trùng sau BQL ở các mẫu tinh dịch bình thường cao hơn đáng kể so với các mẫu tinh dịch bất thường (p<0,001), các mẫu quái tinh và nhược tinh có các mảnh vỡ nhiễm sắc nhiều hơn ở nhóm tinh trùng bình thường [69]

Tuy nhiên, theo XW Nie (2010) bảo quản lạnh có thể cải thiện được số lượng tinh trùng di động tiến tới và tỷ lệ có thai sau khi làm IUI ở mẫu thiểu tinh và nhược tinh đã được lọc rửa [50] Việc lọc rửa đã giúp chọn lọc được những tinh trùng có chất lượng tốt để bảo quản, do đó làm tăng chất lượng tinh trùng sau bảo quản

Mục tiêu bảo quản tinh trùng lạnh sâu là tinh trùng sau bảo quản có chất lượng cao nhất Theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Ngân hàng Mô Hoa Kỳ:

Tỷ lệ tinh trùng di động sau bảo quản phải đạt được ≥ 50% so với tỷ lệ tinh trùng di động trước bảo quản [59]

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây bảo quản tinh trùng người là lĩnh vực rất phát triển Tác giả Hồ Mạnh Tường (2000) đã đánh giá độ di động sau bảo quản so với trước bảo quản bằng chỉ số CSF (Cryosurvival Factor):

CSF = % tinh trùng di động sau rã đông : % tinh trùng di động trước trữ lạnh x 100%

Tác giả nhận thấy những mẫu tinh dịch có mật độ tinh trùng ≥ 50.106/ml và tỷ lệ tinh trùng di động ≥ 50%, chỉ số CSF là 53% Trong khi đó những mẫu tinh dịch có mật độ tinh trùng < 50.106/ml và tỷ lệ tinh trùng di động < 50%, chỉ số CSF là 35,6% [15]

Theo Trần Văn Hanh và cộng sự (2000), những mẫu tinh dịch được bảo quản sau khi đã lọc rửa có chỉ số CSF là 53,2 % sau bảo quản 3 tháng, 48,1 % sau 6 tháng và 41,5 % sau 12 tháng Tác giả nhận thấy: Hình thái siêu cấu trúc của tinh trùng sau bảo quản là bình thường [5]

1.2.4 Sự tổn thương tinh trùng trong quá trình bảo quản lạnh

Tổn thương tinh trùng trong quá trình trữ lạnh là do hiện tượng tạo thành các tinh thể đá trong và ngoài tế bào [17] Hiện tượng này xảy ra trong quá trình hạ nhiệt và gọi là hiện tượng shock lạnh Có thể hạn chế các tổn thương tinh trùng do lạnh bằng các phương pháp như cải thiện chất lượng tinh dịch trước BQL, lựa chọn tinh trùng để bảo quản, sử dụng các chất bảo quản tốt nhất và áp dụng các kỹ thuật làm lạnh - rã đông thích hợp [23]

Verza S Jr (2009) nghiên cứu trên 16 mẫu tinh dịch bình thường và mẫu thiểu tinh được thực hiện nhiều chu kỳ đông lạnh đã cho kết quả: tinh trùng đề kháng với tổn thương do lạnh trong quá trình bảo quản và các mẫu tinh trùng bình thường chịu đựng được quá trình làm lạnh lâu hơn so với mẫu thiểu tinh trung bình là 2 chu kỳ Khả năng đề kháng với các tổn thương do lạnh có liên quan đến chất lượng tinh dịch ban đầu [66]

Nghiên cứu “Ảnh hưởng của ascorbate và catalaza lên tinh trùng trong quá trình bảo quản lạnh” trên 30 mẫu tinh dịch bình thường, Li Z và cộng sự (2010) đã chứng minh: bảo quản lạnh gây ra các tổn thương đối với tinh trùng người có thể thông qua giả thuyết về sự hình thành các gốc oxy hóa (ROS)

Việc cung cấp ascorbate và catalaza một cách thích hợp vào môi trường bảo quản lạnh có thể ngăn chặn sự hình thành ROS [45]

Một giả thuyết mới của Esteves SC (2007), khi bổ sung PF (Pentoxifylline) vào mẫu thiểu- nhược tinh trước khi làm lạnh đã cải thiện được phản ứng cực đầu của tinh trùng (9,7% so với 4,8%, p= 0,002) thông qua việc kích thích các ion ở các tinh trùng được trữ lạnh Kết quả đã cho thấy việc điều trị bằng PF đối với các tinh trùng kém chất lượng có thể làm tăng khả năng thụ tinh của tinh trùng sau khi rã đông [29]

Theo Terai K và cộng sự (2010), có một mối tương quan nghịch giữa độ

di động của tinh trùng và tỷ lệ các chất ức chế di động tinh trùng có trong tinh tương ở các mẫu tinh dịch nhược tinh (r = - 0,68) Các chất này có thể là nguyên nhân của một số những rối loạn về di động của tinh trùng sau khi hóa lỏng tinh dịch [64] Như vậy, việc lọc rửa tinh trùng trước BQL đối với các mẫu nhược tinh là cần thiết vì quá trình này sẽ giúp loại bỏ phần lớn các chất

ức chế di động tinh trùng, do đó cải thiện được chất lượng tinh trùng trước bảo quản lạnh

Trong những năm gần đây, kỹ thuật trữ lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa (đông tinh nhanh) đã được nghiên cứu và áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới Với kỹ thuật này, sự thành công phụ thuộc vào việc loại bỏ nước trong các tế bào trong quá trình trữ lạnh Nếu nước còn sót lại trong tế bào sẽ hình thành nên các tinh thể đá Chính những tinh thể đá này hoạt động như “những con dao” và nó sẽ phá hủy bên trong tế bào hoặc “cắt” đứt làm vỡ màng của tế bào Như vậy, tinh trùng sẽ khó có khả năng sống sau rã đông

Để tránh sự hình thành các tinh thể đá, kỹ thuật trữ lạnh tinh trùng bằng phương pháp thủy tinh hóa có “chất bảo vệ” được thêm vào để thay thế hầu hết nước có trong tinh trùng “Chất bảo vệ” sẽ ngăn ngừa hình thành tinh thể

đá, nên tinh trùng sẽ được an toàn trong quá trình trữ lạnh

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BẢO QUẢN LẠNH SÂU CÁC MẪU TINH TRÙNG ĐÃ ĐƯỢC LỌC RỬA

1.3.1 Khái niệm về lọc rửa tinh trùng

Lọc rửa tinh trùng là phương pháp tách tinh trùng khỏi tinh tương, được

sử dụng nhiều trong hỗ trợ sinh sản

Các phương pháp lọc rửa tinh trùng ban đầu chỉ là kỹ thuật ly tâm để tách tinh trùng khỏi tinh tương một cách đơn giản Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp này không cao và kỹ thuật chỉ thực hiện được trên tinh dịch

có nhiều tinh trùng di động

Ngày nay, có nhiều phương pháp lọc rửa tinh trùng đã được ứng dụng Các phương pháp này dựa trên các nguyên tắc khác nhau như: di cư, lọc hay thang nồng độ để tách các tinh trùng có khả năng di động ra khỏi tinh dịch Phương pháp lọc rửa tinh trùng hiệu quả là phải thu được nhiều tinh trùng di động, không gây thương tổn cho tinh trùng hoặc làm mất chức năng sinh lý của tinh trùng, loại bỏ được tinh trùng chết và các tế bào khác như bạch cầu,

vi khuẩn, độc chất, các gốc oxy hoạt động (ROS)…

1.3.2 Các phương pháp lọc rửa tinh trùng

Hai phương pháp lọc rửa tinh trùng được áp dụng phổ biến hiện nay là: phương pháp bơi lên và phương pháp ly tâm dựa vào thang nồng độ

1.3.2.1 Phương pháp bơi lên:

Năm 1984, Mahadevan và Barker lần đầu tiên mô tả phương pháp này

Cơ sở của phương pháp bơi lên là tinh trùng có khả năng tự di chuyển nhờ đuôi Những tinh trùng có khả năng di động tốt bơi lên môi trường nuôi cấy phủ phía trên tinh dịch Lọc rửa tinh trùng theo phương pháp này thu được tỷ

lệ tinh trùng có khả năng di động rất cao (>90%), hơn nữa số lượng tinh trùng

có hình thái bình thường cũng cao và hầu như không còn các tế bào và mảnh

vụn khác Tuy nhiên, nếu lớp tinh dịch quá dày hoặc tinh dịch quá quánh sẽ làm cho nhiều tinh trùng có khả năng di động tốt ở lớp thấp hơn không thể bơi lên trên bề mặt của môi trường nuôi cấy và mật độ tinh trùng thu được thấp hơn Một hạn chế nữa của phương pháp này là tinh trùng tiếp xúc với các mảnh vụn và bạch cầu, sẽ chịu nhiều tác động của ROS

Để loại trừ và giảm thiểu các tác dụng có hại của ROS, phương pháp bơi lên có thể thực hiện trực tiếp trên tinh dịch đã ly giải Trong quá trình tiến hành, tinh dịch đã ly giải được chia làm nhiều phần nhỏ và cho vào từng ống nhỏ và phủ dung dịch nuôi cấy lên trên Một số phương pháp bơi lên sử dụng môi trường nuôi cấy bổ sung đặc biệt cho tỷ lệ tinh trùng di động cao hơn đáng kể và do đó tỷ lệ có thai lâm sàng cũng cao hơn Các môi trường nuôi cấy hay sử dụng là: Sperm Select, IVF (Vitrolife - Thụy Điển), Ferticult (Ferti Pro - Bỉ) Để tăng tối đa diện tích tiếp xúc giữa môi trường nuôi cấy và tinh dịch, các ống chứa tinh dịch và môi trường thường đặt nghiêng một góc 45otrong thời gian 30-60 phút, ở nhiệt độ 37oC Sau đó, lớp môi trường nuôi cấy

có chứa tinh trùng đã bơi lên được lấy ra một cách cẩn thận từ trên xuống dưới bằng pipet đã tiệt trùng

1.3.2.2 Phương pháp ly tâm dựa vào thang nồng độ:

Phương pháp ly tâm dựa vào thang nồng độ ra đời vào những năm 70 của thế kỷ XX Phương pháp này bao gồm: các thang liên tục và không liên tục Với thang liên tục, thang nồng độ sẽ tăng dần từ trên xuống dưới đáy của ống ly tâm Trong khi đó, với thang không liên tục thì biên giới giữa các lớp

rõ ràng Tinh dịch được đặt ở phần trên nhất của ống ly tâm Sau đó, tiến hành

ly tâm trong vòng 15-30 phút Trong phương pháp này, tất cả các tế bào theo lực ly tâm hướng xuống đáy ống Tuy nhiên, những tinh trùng có độ di động cao sẽ di chuyển nhanh hơn các tinh trùng không di động hoặc di động kém nên chúng sẽ lắng xuống tạo lớp cặn mềm ở đáy ống

Trong phương pháp lọc rửa tinh trùng theo thang nồng độ, sản phẩm Percoll được sử dụng rộng rãi trong một thời gian dài

Năm 2000, Ding DC và cộng sự đã khẳng định vai trò của việc lọc rửa tinh trùng bằng Percoll bằng kết quả nghiên cứu: tổng số tinh trùng di động và khả năng di động của tinh trùng sau lọc rửa bằng phương pháp thang nồng độ Percoll cao hơn so với phương pháp bơi lên [26]

Khi nghiên cứu tỷ lệ có thai trên lâm sàng trong phương pháp hỗ trợ sinh sản IUI, Tsai YC và cộng sự (2004) thấy không có sự khác biệt về độ di động của tinh trùng khi sử dụng Percoll và Puresperm, nhưng tỷ lệ có thai trên lâm sàng lại cao hơn khi sử dụng Percoll (13,8% so với 12,5%) [65]

Ren SS và cộng sự (2004) khi so sánh các phương pháp chuẩn bị tinh trùng cho IUI cũng đã đưa ra kết luận: sử dụng Percoll cho tỷ lệ có thai cao nhất [55]

Theo Sophonsritsuk A (2005), nghiên cứu trên những mẫu thiểu tinh, việc lọc rửa bằng thang nồng độ Percoll trước khi bảo quản lạnh giúp số lượng tinh trùng di động sau bảo quản tăng cao hơn so với mẫu tinh dịch tươi không được lọc rửa [62]

Các nghiên cứu trên đã cho thấy lọc rửa bằng thang nồng độ Percoll sẽ được ưu tiên lựa chọn hơn đối với các mẫu tinh dịch chất lượng kém

Tuy nhiên, trong những năm gần đây Percoll đã không còn được sử dụng do một số tác giả cho rằng Percoll có chứa các chất độc có thể làm thay đổi màng tinh trùng và làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng Do vậy, việc rửa tinh trùng sau khi tách tinh trùng có sử dụng Percoll là điều rất cần thiết Theo Ren SS., khi Percoll không được sử dụng nữa thì Puresperm là hóa chất dùng thay thế cho Percoll một cách có hiệu quả Tác giả cũng cho rằng: bơi lên vẫn là cách tốt nhất cho phương pháp IUI do nó có khả năng chọn được tinh trùng có độ di động tốt [55]

Tác giả Đào Thị Thúy Phượng (2004) trong nghiên cứu của mình đã cho thấy: chất lượng tinh trùng sau lọc rửa bằng Percoll hoặc SilSelect không khác nhau về tất cả các thông số: mật độ, tỷ lệ sống, độ di động và tỷ lệ hình thái tinh trùng bình thường Như vậy, SilSelect có thể thay thế cho Percoll trong lọc rửa tinh trùng [10]

Ngày nay, có nhiều sản phẩm thay thế Percoll ít gây hại cho tinh trùng

đã được sử dụng trên lâm sàng, như: IxaPrep (Medicult- Đan Mạch), SilSelect (FertiPro- Bỉ), Puresperm (Thụy Điển)… Các Labo HTSS trong nước thường

sử dụng SilSelect hoặc Sperm Grade để lọc rửa tinh trùng

Năm 1994, Moretimer D đã cải tiến phương pháp ly tâm thang nồng độ thành phương pháp mini thang nồng độ dùng cho các mẫu tinh dịch thiểu tinh, nhược tinh nặng hoặc mẫu tinh dịch kết hợp thiểu-nhược-quái tinh

Ngày nay, các phương pháp tách tinh trùng dựa vào chất lượng của tinh chất Theo Ariff Bongso (1999), phương pháp bơi lên được áp dụng cho các trường hợp tinh dịch đồ bình thường hoặc gần bình thường Theo WHO (2010), đối với mẫu tinh dịch quá kém (thiểu hoặc nhược tinh) phương pháp ly tâm thang nồng độ sẽ được ưu tiên sử dụng hơn so với phương pháp bơi lên [68]

1.3.3 Nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trước bảo quản lạnh sâu tinh trùng người

Lọc rửa tinh trùng là kỹ thuật rất quan trọng trong hỗ trợ sinh sản Việc

đưa ra được phương pháp tối ưu tách tinh trùng để giữ cho tinh trùng có chức năng nhất trong việc thụ tinh là cần thiết

Trong nghiên cứu “So sánh chất lượng tinh trùng sau bảo quản lạnh trong hơi nitơ và trong nitơ lỏng ở mẫu tinh trùng tươi và mẫu tinh trùng đã lọc rửa”, Saritha K.R (2001) thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ sống của tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng di động sau bảo quản lạnh khi trữ lạnh trong hơi nitơ

lỏng hoặc trong nitơ lỏng (p>0,05) Tuy nhiên, các tỷ lệ này giảm đáng kể sau bảo quản lạnh ở mẫu đã lọc rửa so với mẫu tươi [56]

Năm 2001, nghiên cứu của Donnelly E.T và cộng sự cho kết quả: tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới sau rã đông ở mẫu tinh trùng đã được chuẩn bị bằng thang nồng độ Percoll hoặc bằng phương pháp bơi lên thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mẫu tinh trùng tươi và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê giữa hai phương pháp lọc rửa: bơi lên và thang nồng độ Percoll Sự nguyên vẹn của DNA sau rã đông ở mẫu tinh trùng tươi cũng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với mẫu tinh trùng đã được lọc rửa [27]

Như vậy, tinh trùng tươi đông lạnh dường như đề kháng tốt hơn với hiện tượng shock lạnh so với tinh trùng đã được lọc rửa và chất lượng tinh trùng sau rã đông phụ thuộc chủ yếu vào chất lượng mẫu tinh trùng trước khi bảo quản

Trong nghiên cứu “Đánh giá khả năng sống của tinh trùng sau rã đông ở các mẫu thiểu tinh và mẫu bình thường được lọc rửa bằng hai phương pháp bơi lên và thang nồng độ Percoll trước khi bảo quản lạnh”, Counsel M (2004)

đã kết luận: lọc rửa bằng phương pháp bơi lên đã làm tăng khả năng sống của tinh trùng sau rã đông ở cả mẫu bình thường và mẫu thiểu tinh (p<0,01) và lọc rửa bằng thang nồng độ Percoll đã cải thiện đáng kể khả năng sống của tinh trùng sau rã đông ở mẫu thiểu tinh (22,4%±1,0, p<0,01) nhưng không làm tăng khả năng sống ở mẫu bình thường (30,8%±1,8) [24]

Nhiều tác giả cho rằng, nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật qua tinh dịch trong BQL trong nitơ lỏng là rất cao và phương pháp lọc rửa tinh trùng trước khi bảo quản đã đảm bảo sự an toàn trong HTSS [18],[24],[30]

Theo Saritha K.R (2001), sự lây nhiễm HCV, HIV trong tinh dịch là rất cao HCV có thể sống sót trong nitơ lỏng ở -196oC và đề nghị lọc rửa tinh trùng trước bảo quản lạnh, tốt nhất là trữ lạnh bằng hơi nitơ lỏng [56]

Trong nghiên cứu về nguy cơ lây nhiễm chéo HCV qua tinh dịch trong HTSS, Abou-Setta Ahmed M (2004) đã kết luận: Lọc rửa tinh trùng bằng thang nồng độ Percoll đã loại bỏ được HCV, cytomegalovirus, bạch cầu, tinh trùng bất thường [18]

Ở trong nước, đã có nghiên cứu của Nguyễn Phương Thảo Tiên (2007)

về chất lượng tinh trùng người sau BQL sâu ở những mẫu tinh dịch bình thường Tác giả đã đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về BQL sâu các mẫu tinh trùng bất thường [13] Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này Nghiên cứu của chúng tôi được phát triển trên cơ sở của những nghiên cứu trước nhằm đóng góp một tài liệu tham khảo về lĩnh vực BQL sâu các mẫu tinh trùng bất thường của người

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG

30 mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bất thường về độ di động của tinh trùng (mẫu nhược tinh) Các mẫu được bảo quản lạnh sâu (-196oC) tại phòng bảo quản mô, Bộ môn Mô - Phôi học, Trường Đại học Y Hà Nội

- Tiêu chuẩn lựa chọn:

+ Các mẫu tinh dịch được chọn có:

• Bất thường về độ di động của tinh trùng: di động tinh trùng dưới mức bình thường theo tiêu chuẩn của WHO 1999 (tỷ lệ tinh trùng di động A+B < 50%)

+ Các mẫu tinh dịch nghiên cứu được lấy từ đối tượng:

• Nam giới trong độ tuổi : 20 đến 50 tuổi

• Kiêng xuất tinh từ 3 đến 5 ngày

• Không sốt, không dùng thuốc, không uống rượu tại thời điểm lấy mẫu

- Tiêu chuẩn loại trừ:

Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trên các mẫu nhược tinh nên để đảm bảo cho chất lượng của mẫu sau BQL được tốt hơn, để đảm bảo tính thống nhất của mẫu nghiên cứu, giảm sai số hệ thống, chúng tôi loại trừ ra khỏi nghiên cứu các mẫu:

• Không đủ điều kiện trong tiêu chuẩn lựa chọn

• Thể tích tinh dịch < 3ml

• Mật độ tinh trùng < 40 triệu/ml

• Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới < 20%

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu can thiệp Đánh giá trước và sau can thiệp

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu:

Nghiên cứu chủ đích trên 30 mẫu tinh dịch

2.2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu:

Từ tháng 6/2011 đến tháng 8/2011, tại phòng bảo quản mô Bộ môn Mô

- Phôi học, Trường Đại học Y Hà Nội

• Chọn đối tượng nghiên cứu theo đúng tiêu chuẩn chọn

• Tập huấn cho nhóm nghiên cứu về kỹ thuật làm xét nghiệm, phân tích xét nghiệm và ghi chép kết quả nghiên cứu

• Dụng cụ, máy móc: được chuẩn hóa Hóa chất đảm bảo chất lượng

2.2.6 Quy trình nghiên cứu:

Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:

2.3 KỸ THUẬT VÀ CHỈ TIÊU NGHIÊN CỨU

2.3.1 Kỹ thuật nghiên cứu:

2.3.1.1 Kỹ thuật lấy và xét nghiệm tinh dịch:

Mẫu tinh dịch được bệnh nhân tự lấy trong một phòng riêng bằng tay Tinh dịch được đựng trong một cốc chuyên dụng miệng rộng có chia vạch thể tích, đã ghi sẵn tên bệnh nhân và ngày giờ lấy mẫu Cốc đựng tinh dịch được đặt trong tủ ấm 37oC, trong 30 phút để tinh dịch ly giải hoàn toàn Sau đó mẫu tinh dịch được đánh giá các chỉ số theo tiêu chuẩn WHO (1999), đang được áp dụng thường quy tại Bộ môn Mô Phôi học-Trường Đại học Y Hà Nội

- Đo thể tích tinh dịch bằng cốc đong có chia độ theo thể tích (ml)

- Xác định độ quánh tinh dịch bằng cách dùng pipette, hút nhẹ tinh dịch vào một pipette 5ml, sau đó để cho chảy tự do và ghi nhận độ kéo dài của giọt tinh dịch

- Đo độ pH tinh dịch: dùng giấy chỉ thị màu pH, so màu với bảng so màu mẫu

WHO (1999) phân chia mức độ di động của tinh trùng làm 4 loại:

Loại A: Tinh trùng di động tiến tới nhanh

Loại B: Tinh trùng di động tiến tới chậm

Loại C: Tinh trùng di động tại chỗ

Loại D: Tinh trùng không di động

Đếm tổng cộng 200 tinh trùng trên vi trường bằng máy bách phân bạch cầu Sau đó tính tỷ lệ phần trăm mỗi loại

- Đánh giá mật độ tinh trùng:

Không cần pha loãng tinh dịch, bất động tinh trùng bằng nhiệt trước khi đếm, đơn vị tính: triệu tinh trùng/ ml tinh dịch

- Đánh giá hình thái:

Phiến đồ tinh dịch được nhuộm Giemsa, gồm các bước:

Dàn phiến đồ → để khô tự nhiên → cố định bằng cồn 100% → nhuộm trong dung dịch giemsa

Phân loại hình thái tinh trùng: đếm 200 tinh trùng dưới kính hiển vi có

độ phóng đại 1000 lần, không đếm những tinh trùng nằm chồng lên nhau hoặc quấn vào nhau Phân loại tinh trùng bình thường, bất thường đầu cổ, bất thường đuôi, bất thường phối hợp; tính tỷ lệ phần trăm mỗi loại

Xác định các loại tế bào khác trong phiến đồ: tinh trùng non, bạch cầu,

vi khuẩn

- Đánh giá tỷ lệ tinh trùng sống: phương pháp nhuộm Eosin

Nguyên lý: Những tinh trùng còn sống được đánh giá qua tính nguyên vẹn của màng bào tương tinh trùng Khi tinh trùng chết, màng bào tương đầu tinh trùng bị tổn thương nên đầu tinh trùng sẽ bắt màu thuốc nhuộm Eosin, có màu hồng Tinh trùng sống không bắt màu thuốc nhuộm sẽ trắng sáng

Kỹ thuật:

- Nhỏ 30 µl tinh dịch lên lam kính

- Nhỏ thêm 20 µl Eosin 1%, trộn đều 2 giọt trong 30 giây, đậy lamelle

- Đếm tổng số 200 tinh trùng dưới vật kính 40x, trên nhiều vi trường để xác định tinh trùng sống

c Cách đánh giá mẫu tinh dịch bình thường: theo tiêu chuẩn tinh dịch đồ

bình thường của WHO (1999), có bổ sung tiêu chuẩn của Kruger:

+ Thể tích ≥ 2 ml + pH ≥ 7,2 + Mật độ tinh trùng ≥ 20 triệu tt/ ml + Độ ly giải < 30 phút + Độ quánh nhỏ giọt bằng pipette Paster, giọt dài < 2cm + Di động ≥ 25% di động tiến tới nhanh (loại A) hoặc ≥ 50% di động tiến tới nhanh và chậm (loại A+B) + Hình thái bình thường ≥ 15% + Tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh ≥ 40 triệu + Tỷ lệ sống ≥ 75% + Bạch cầu < 1 triệu/ml

2.3.1.2 Kỹ thuật chuẩn bị tinh trùng:

Mỗi mẫu tinh dịch được chia làm 2 phần:

• Phần không lọc rửa: 1,5ml tinh dịch, được chuẩn bị để bảo quản lạnh

• Phần lọc rửa: 1,5ml tinh dịch, được lọc rửa bằng phương pháp thang nồng độ Kỹ thuật lọc rửa được tiến hành theo qui trình của Bộ môn Mô-Phôi học, Trường Đại học Y Hà Nội:

+ Cho 1ml Sil select 45% vào tube 15ml đáy nhọn

+ Cho nhẹ nhàng 1ml Sil select 90% xuống đáy tube, dưới lớp Sil select 45% + Cho 1,5ml tinh dịch lên trên cùng

+ Ly tâm 400g trong vòng 15 phút

+ Hút bỏ dịch nổi, để lại khoảng 0,5ml cặn phía dưới

+ Cho cặn trên vào tube có chứa sẵn 2ml môi trường Ferticult Flushing, trộn đều, ly tâm 400g trong vòng 10 phút, hút bỏ dịch nổi, để lại 0,5ml cặn + Cho cặn trên vào 1ml môi trường Ferticult Flushing, trộn đều

Tinh dịch đã được lọc rửa đem đánh giá các thông số như ban đầu, sau

đó được bảo quản lạnh

2.3.1.3 Kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng:

Cả mẫu tinh dịch tươi không lọc rửa và mẫu tinh dịch đã lọc rửa đều được bảo quản lạnh theo một quy trình chung

Mỗi một phần (1,5ml) tinh dịch tươi hoặc tinh dịch đã được lọc rửa được chia thành 3 phần bằng nhau để tiến hành nghiên cứu ở 3 thời điểm khác nhau Các bước tiến hành gồm:

- Cho môi trường bảo quản lạnh vào tinh dịch:

Sử dụng môi trường bảo quản lạnh Sperm FreezeTM (Ferti-Pro, Bỉ) Tinh dịch tươi đã ly giải hoàn toàn hoặc tinh dịch sau lọc rửa sẽ được bổ sung dung dịch Sperm Freeze bằng cách nhỏ từng giọt và lắc đều, theo tỷ lệ: 0,7ml/ 1ml tinh dịch Sau đó, mẫu được để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 15 phút

- Đóng gói:

+ Dán nhãn có các thông số (tên, tuổi, ngày, tháng, năm, mã số) vào cryovial loại 1,8ml Cryovial là tuýt nhựa chịu lạnh chuyên dụng để bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

+ Mỗi phần tinh dịch đã pha môi trường bảo quản được nạp vào 3 cryovial bằng pipette pasteur, sử dụng cho 3 giai đoạn nghiên cứu, sau đó vặn chặt nắp của cryovial để đông lạnh

- Hạ nhiệt độ:

Sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ trong hơi nitơ lỏng của labo bảo quản

mô, Bộ môn Mô-Phôi Đại học Y Hà Nội (hạ nhiệt độ ở cổ bình nitơ lỏng): + Mỗi giá nhôm chỉ cài 1 cryotube ở vị trí thấp nhất của giá nhôm

+ Đổ nitơ vào bình trữ, cột nitơ cao 28 cm

+ Hạ giá nhôm xuống cách mực nitơ 14 cm, dùng đầu dò cảm nhiệt xác định để đạt được nhiệt độ -10oC, để trong 6 phút

+ Hạ giá nhôm tiếp tục xuống cách mực nitơ 11cm, dùng đầu dò cảm nhiệt xác định để đạt được nhiệt độ -120oC, để trong 20 phút

+ Dìm từ từ vào nitơ lỏng trong 5 phút: -120oC → -196oC

- Lưu trữ: Trong bình nitơ lỏng trữ mẫu chuyên dụng

2.3.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu:

- Tỉ lệ tinh trùng di động (tiến tới và không tiến tới)

- Tỉ lệ tinh trùng di động tiến tới

- Tỉ lệ tinh trùng sống, chết

- Tỉ lệ tinh trùng hình thái bình thường, bất thường đầu và cổ

- So sánh các chỉ số trước và sau bảo quản:

+ Chỉ số CSF di động = % tinh trùng di động trước bảo quản% tinh trùng di động sau bảo quản x 100%

+ Chỉ số CSF di động tiến tới = % tinh trùng di động tiến tới trước bảo quản% tinh trùng di động tiến tới sau bảo quản x 100%

+ Tỷ lệ tinh trùng sống = % tinh trùng sống sau bảo quản

% tinh trùng sống trước bảo quản x 100%

+ Tỷ lệ TT hình thái bình thường = % TT có hình thái bình thường sau bảo quản

% TT có hình thái bình thường trước bảo quản x 100%

- So sánh các chỉ số giữa 2 mẫu tinh trùng được bảo quản: mẫu tinh trùng tươi và mẫu tinh trùng sau lọc rửa

2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích bảo vệ, nâng cao sức khỏe cho người bệnh và đóng góp một phần cho lĩnh vực hỗ trợ sinh sản

- Các mẫu tinh dịch nghiên cứu được lấy từ nguồn bệnh nhân đến làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Bộ môn Mô - Phôi học và được sự cho phép của Chủ nhiệm bộ môn

- Các mẫu tinh dịch sẽ được hủy bỏ ngay sau quá trình nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Từ tháng 6/2011 đến tháng 8/2011, 30 mẫu tinh dịch nghiên cứu đã được lấy tại phòng xét nghiệm của Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội Những mẫu tinh dịch này được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn của WHO (1999)

và đáp ứng được tiêu chuẩn chọn mẫu của nghiên cứu, được bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -196oC, trong nitơ lỏng theo hai phương pháp: bảo quản mẫu tươi không lọc rửa và bảo quản mẫu sau khi lọc rửa Các mẫu tinh dịch được đánh giá sau các khoảng thời gian bảo quản : 1 ngày, 10 ngày và 30 ngày

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU TINH DỊCH NGHIÊN CỨU

3.1.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo tỷ lệ tinh trùng di động (PR)

Căn cứ theo tiêu chuẩn đánh giá tinh dịch đồ của WHO 2010, chúng tôi lấy giá trị 32% là ranh giới để phân loại mẫu nghiên cứu

Trong số 30 mẫu nghiên cứu, có 11 mẫu có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% (chiếm 37%) và 19 mẫu có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới từ 32% đến 50% (chiếm 63%) (biểu đồ 3.1)

3.1.2 lứa tuổi

Trong nhóm bệnh nhân nhược tinh có tuổi > 40, có đến 50% bệnh nhân

có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới dưới 32% tức là bệnh nhân có tinh trùng rất

yếu (theo WHO 2010)

Nhóm bệnh nhân nhược tinh gặp nhiều nhất có độ tuổi từ 30-40 tuổi Đây cũng là độ tuổi thường gặp của bệnh nhân đến khám vô sinh

Phân bố bệnh nhân theo độ tuổi được thể hiện ở biểu đồ 3.2

63%

30< Tuổi ≤ 40 40< Tuổi ≤50

3.2 CHẤT LƢỢNG MẪU TINH TRÙNG SAU LỌC RỬA

Sau khi lọc rửa, các chỉ số chất lượng tinh trùng đã có sự thay đổi đáng

kể so với trước lọc rửa (bảng 3.1)

Bảng 3.1: So sánh một số chỉ số về chất lượng tinh trùng trước và sau lọc rửa

- Tỷ lệ tinh trùng không bắt màu thuốc nhuộm eosin sau lọc rửa giảm đi

có ý nghĩa thống kê so với trước lọc rửa (p < 0,001)

Quan sát trên tiêu bản nhuộm eosin, ở những mẫu tinh dịch được lọc rửa, khả năng di động của tinh trùng tăng lên rõ rệt nhưng tỷ lệ tinh trùng không bắt màu eosin lại giảm đi có ý nghĩa thống kê Đồng thời, các vụn tế bào và tinh tương gần như được loại bỏ hoàn toàn

Hình 3.1 Hình ảnh vi thể mẫu tinh dịch trước lọc rửa (nhuộm Eosin; 400X)

1 Tinh trùng sống; 2 Tinh trùng chết; 3 Tinh tương và các mảnh vụn tế bào

Hình 3.2 Hình ảnh vi thể mẫu tinh dịch sau lọc rửa (nhuộm Eosin; 400X)

Sau BQL, khả năng di động của tinh trùng giảm, đặc biệt là giảm rõ rệt

tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới (bảng 3.2)

Bảng 3.2: So sánh tỷ lệ (%) TT di động và tỷ lệ (%) TT di động tiến tới

trước và sau BQL 1 ngày, 10 ngày, 30 ngày

Thời điểm

nghiên cứu Các chỉ số

TT di động

tiến tới (%)

p (so với trước BQ) - < 0,001 < 0,001 < 0,001 Bảng 3.2 cho thấy:

- Tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng tiến tới sau bảo quản ở tất cả các khoảng thời gian bảo quản đều giảm Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với

p < 0,001

- Tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới sau bảo quản

có giá trị trung bình thấp nhất ở khoảng thời gian bảo quản 30 ngày, cao nhất

ở khoảng thời gian bảo quản 1 ngày và đều thấp hơn so với trước bảo quản

- Sau thời gian BQL 1 ngày, tỷ lệ tinh trùng di động và tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới đã giảm đi rất nhiều so với trước bảo quản (p < 0,001)

3.3.2 Khả năng sống của tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu nhƣợc tinh đã đƣợc lọc rửa

Sau BQL, khả năng sống của tinh trùng giảm (bảng 3.3)

Bảng 3.3: So sánh tỷ lệ (%) tinh trùng sống trước và sau bảo quản lạnh

1 ngày, 10 ngày, 30 ngày

3.3.3 Sự biến đổi về hình thái vi thể tinh trùng sau bảo quản lạnh ở những mẫu nhƣợc tinh đã đƣợc lọc rửa

Sau BQL, tỷ lệ tinh trùng có hình thái bình thường giảm so với trước bảo quản (bảng 3.4)