Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QFPCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST

Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường các NST nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST một cách nhanh chóng và chính xác mà không cần phải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Hoàng Thị Ngọc Lan người thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

TS Trần Vân Khánh – Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn

PGS.TS Tạ Thành Văn –Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein–Cán bộ giảng dạy bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi nhiều kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài

Tiếp theo tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới:

Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Các thầy cô bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập

Các thầy cô bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội

đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Các anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà Nội đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại Trung tâm Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã giành cho tôi sự ủng hộ nhiệt tình, chia sẻ với tôi những lúc thành công cũng như khó khăn

Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng của bố mẹ

Sự yêu thương, động viên từ những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 10 năm 2011

Nguyễn Hoài Nam

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST” là đề

tài do bản thân tôi thực hiện Các số liệu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố

Tác giả

Nguyễn Hoài Nam

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFP Alfa feto-protein

AF Amniotic fluid

BP Base pair

ΒhCG Beta_human chronic gonadotropin

CVS Chrionic villus sample

DNA Deoxyribonucleic acid

DTBS Dị tật bẩm sinh

FISH Fluorescent in situ hybridization

NST Nhiễm sắc thể

PAPP-A Pregnancy – associated plasma protein A

PCR Polymerase chain reaction

PGD Preimplantation Genetic Diagnosis

PUBS Percutaneous umbilical blood sampling

QF-PCR Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic acid

SRT Short tandem repeat

Taq Theramus aquaticus

TOP Termination of pregnancy

uE 3 Unconjugated Estriol- Estriol không liên hợp

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3

1.1 Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường số lượng nhiễm sắc thể X,Y 3

1.1.1 Hội chứng Down (Trisomy 21) 3

1.1.2 Hội chứng Patau (Trisomy 13) 4

1.1.3 Hội chứng Edwards (Trisomy 18) 5

1.1.4 Hội chứng Klinefelter (XXY) 6

1.1.5 Hội chứng XYY 6

1.1.6 Hội chứng Trisomy X (Hội chứng siêu nữ) 6

1.1.7 Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner) 7

1.2 Một số phương pháp sàng lọc trước sinh 8

1.2.1 Siêu âm thai: 8

1.2.2 Test sàng lọc bộ ba (triple test : AFP, βhCG,uE3) 10

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH 12

1.3.1 Lấy mẫu di truyền 12

1.3.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào 14

1.3.3 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tử 15 1.3.4 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử: 16

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 23

2.1.2 Địa điểm lấy mẫu: 23

2.1.3 Địa điểm phân tích mẫu: 23

2.2 Thời gian nghiên cứu 23

2.3 Phương tiện nghiên cứu 23

2.3.1 Dụng cụ: 23

2.3.2 Hóa chất: 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 24

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu: 24

2.4.2 Kỹ thuật sử dụng: 24

2.5 Xử lý và phân tích số liệu 30

2.6 Vấn đề đạo đức của đề tài 31

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32

3.2 Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33

3.3 Minh họa kết quả QF-PCR của một số trường hợp 38

3.3.1 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 12 38

3.3.2 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41

3.3.3 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43

3.3.4 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45

3.3.5 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47

3.3.6 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 49

CHƯƠNG 4:BÀN LUẬN 53

4.1 Quy trình áp dụng kỹ thuật QF – PCR: 53

4.2 Giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội 55

4.2.1 Trường hợp chẩn đoán khác nhau giữa Karyotyp và QF-PCR 55

4.2.2 Độ chính xác của QF-PCR trong chẩn đoán bất thường lệch bội NST 59

4.3 Số lượng marker cần sử dụng trong chẩn đoán các hội chứng lệch bội NST và việc sử dụng các extra marker 60

4.4 Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật QF – PCR 62

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Những dấu hiệu bất thường hay gặp trên siêu âm ba tháng giữa và

các rối loạn NST tương ứng [19] 9

Bảng 1.2 Kết quả nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bất thường NST sử dụng QF – PCR [23] 20

Bảng 2.1: Các marker được sử dụng trong bộ kit Aneufast[12] 26

Bảng 2.2: Các marker được sử dụng trong từng lọ 28

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng 28

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR 29

Bảng 2.5 Hóa chất dùng cho 1 mẫu điện di 29

Bảng 2.6 Cách đọc kết quả tỉ lệ đỉnh [12] 30

Bảng 3.1 Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32

Bảng 3.2 Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33

Bảng 3.3 Độ chính xác của kỹ thuật QF – PCR so với kỹ thuật di truyền tế bào 34

Bảng 3.4 Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 21 35

Bảng 3.5 Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 18 36

Bảng 3.6 Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 13 37

Bảng 4.1 Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật QF – PCR [23] 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Kết quả điện di huỳnh quang trên máy ABI 17

Hình 1.2 Hai alen đồng hợp tử 17

Hình 1.3 Hai alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1 18

Hình 1.4 3 alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1:1 18

Hình 1.5 3 alen dị hợp tử tỉ lệ 2:1 19

Hình 1.6 Ba alen đồng hợp tử 19

Hình 2.1 Kết quả đo nồng độ DNA bằng máy quang phổ Nanodrop 25

Hình 3.1 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 12 38

Hình 3.2 Kết quả Karyotyp bệnh nhân số 12 40

Hình 3.3 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41

Hình 3.4 Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 21 42

Hình 3.5 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43

Hình 3.6 Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 17 44

Hình 3.7 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45

Hình 3.8 Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 11 46

Hình 3.9 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47

Hình 3.10 Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 13 48

Hình 3.11 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các marker thường dùng 49

Hình 3.12 Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các extra marker trong lọ XY 50

Hình 3.13 Kết quả karyotyp của bệnh nhân số 27 52

Hình 4.1 Kết quả karyotyp mẫu bệnh nhân kết luận 46,XY 56

Hình 4.2 Kết quả QF-PCR của mẫu bệnh nhân karyotyp kết luận 46,XY 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một trong những bất thường hay gặp ở thai nhi và trẻ sơ sinh, nhiều nghiên cứu thống kê đã xác định DTBS là một trong những nguyên nhân chính gây nên tử vong và bệnh tật của trẻ trong những năm đầu tiên của cuộc sống Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO)

dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 3 - 4% tổng số trẻ được sinh ra bao gồm cả trẻ sống và trẻ chết lúc sinh [34] Theo nghiên cứu của Phan Thị Hoan (2001) ở nhóm dân cư thuộc 4 tỉnh đồng bằng Sông Hồng cho thấy tỷ lệ DTBS chiếm 1,96% dân số điều tra [6] Một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường gặp như: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwarrd và một số hội chứng bất thường NST giới như: Klinefelter, Tuner Đa số trẻ sinh

ra mắc những hội chứng này đều ảnh hưởng tới khả năng sống và sự hòa nhập cộng đồng Hiện nay việc điều trị các bệnh di truyền còn gặp nhiều khó khăn,

vì vậy phòng và hạn chế bệnh di truyền cho trẻ sinh ra là việc cấp thiết nhằm giảm bớt gánh nặng về kinh tế cũng như tâm lý cho gia đình và xã hội Việc chẩn đoán sớm các DTBS thời kỳ phôi thai là cần thiết để có các biện pháp xử

lý phù hợp

Gần đây người ta phát hiện ra các trình tự lặp ngắn STR (short tandem repeat) có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên NST số 13, 18, 21,

X, Y Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng

ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di Do bất thường

số lượng alen tương ứng với bất thường các NST nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST một cách nhanh chóng và chính xác mà không cần phải nuôi cấy tế bào Kỹ thuật QF – PCR (quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) được gọi là phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại các STR Đây là

phương pháp xác định các dị tật về gen và NST hiệu quả nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác

Hiện nay ở Việt Nam, tại một số trung tâm lớn đã triển khai áp dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền Tuy nhiên chưa có đề tài nào đánh giá độ chính xác của kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh và chuẩn hóa quy trình để áp dụng vào điều kiện Việt Nam Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng dụng kỹ

thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST" với 2 mục tiêu sau:

1 Ứng dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST

2 Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một

số hội chứng lệch bội NST

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường

số lượng nhiễm sắc thể X,Y

Trong thực tế lâm sàng, bất thường NST gặp ở 50% các trường hợp gây sẩy thai, 10% các trường hợp đẻ sống Trong đó các bất thường thường gặp và gây ảnh hưởng tới khả năng hòa nhập cộng đồng và trí tuệ của trẻ là các hội chứng Down, Patau, Edward, hội chứng Kilinefelter, hội chứng Tuner và hội chứng trisomy X

1.1.1 Hội chứng Down (Trisomy 21) [7][10]

Là một trong những hội chứng rối loạn NST dạng lệch bội thường gặp nhất, tỷ lệ trung bình mắc hội chứng Down trong quần thể là 1/700 lần sinh

Cơ chế di truyền của bệnh: 92,5% là do 3 NST 21, 4,8% là do chuyển đoạn của NST 21 với các NST tâm đầu khác, một tỷ lệ thấp khoảng 2,7% thể khảm Trong những năm gần đây, người ta đã biết rõ rằng 80% trường hợp không phân ly của cặp NST 21 xảy ra ở lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân (Meiosis Ι), trong đó tỷ lệ ở mẹ chiếm 66,2% , ở cha 13,8% Còn 20% trường hợp không phân ly của các cặp NST 21 là xảy ra ở lần phân chia thứ hai của quá trình giản phân (Meiosis ΙΙ), trong đó tỷ lệ ở mẹ chiếm 11%, còn ở cha chiếm 9% Cũng có trường hợp cặp NST 21 không phân ly xảy ra trong những lần nguyên phân đầu tiên của hợp tử gây nên tình trạng khảm của thai hội chứng Down

Tiên lượng sống của bệnh nhân phụ thuộc vào việc có hay không có các dị tật nội tạng, đặc biệt loại dị tật ở tim kèm theo Đồng thời còn phụ

thuộc vào việc bệnh nhân có mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội hay không, mắc nhiều hay ít Tỷ lệ chết trong 5 năm đầu là 50% Có 8% sống được tới

40, 2,6% sống trên 50 tuổi

Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu tuy nhiên để khắc phục tình trạng phát triển thể chất kém người ta dùng hormon tăng trưởng

1.1.2 Hội chứng Patau (Trisomy 13) [7]

Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự mô tả đầy đủ vào năm 1960 Bệnh gặp với tần số 1/5000 đến 1/10000 trẻ sinh ra Tỷ lệ bệnh gặp ở nữ nhiều hơn nam

Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng khi sinh thấp hơn mức trung bình khoảng 900g và thường sinh thiếu tháng Các dấu hiệu lâm sàng bên ngoài của hội chứng này rất điển hình đến mức có thể dựa vào đó để nhận dạng và chẩn đoán bệnh

Các bất thường đặc trưng biểu hiện ở sọ và mặt: chu vi hộp sọ thường

bị giảm, đầu bé cùng với trán thấp và nghiêng, khe mắt hẹp, gốc mũi rộng, tai mọc thấp với vành tai biến dạng, khoảng cách giữa hai mắt giảm, da đầu thường bị loét, có u mạch máu ở vùng đầu và chẩm

Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hội chứng Patau là khe hở môi trên và vòm miệng, các khe hở thường là ở cả hai phía Trong số các bất thường của hệ thống cơ xương, hay gặp nhất là tật nhiều ngón ở cả hai tay và hai chân Những biến đổi của vân da tay được thấy là góc atd lớn

Ngoài ra, các DTBS ở tim chiếm 80% các trường hợp, ở hệ thống bài tiết trên 60%, ở hệ thống cơ quan sinh sản 75%

Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những trẻ Trisomy 13 không sống được lâu, 90% bệnh nhân bị chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chu sinh

1.1.3 Hội chứng Edwards (Trisomy 18) [7]

Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh đứng đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960 Đây là hội chứng do rối loạn NST đứng thứ 2 sau hội chứng Down.

Trẻ Trisomy 18 được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượng trung bình khoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng Các biểu hiện lâm sàng ở hội chứng này cũng đa dạng như ở hội chứng Patau

Các tổn thương cấu tạo của mặt và hệ thống cơ xương là ổn định, ở các trường hợp kinh điển, sọ não có dạng kéo dài nghiêng dần từ xương trán tới vùng thóp, hàm dưới và lỗ miệng bé, các khe mắt hẹp và ngắn Vành tai bị biến dạng và trong phần lớn các trường hợp có tai mọc thấp Các tật ở chi trên

là sự xếp lộn xộn của xương bàn, bất thường khớp giữa ngón Ι, bất thường ở bàn chân cũng có tới 80% các trường hợp Khe hở môi được gặp ở 50% các trường hợp, nhưng khác với hội chứng Patau ở chỗ thường chỉ khe hở môi ở một phía

Để góp phần chẩn đoán hội chứng Edwards, các đặc tính vân da có ý nghĩa đáng kể, vì ngoài những bất thường thấy ở các nếp lòng bàn tay, tỷ lệ vân cung ở các đầu ngón tay rất đặc trưng: có tới 95% bệnh nhân có tần số vân cung từ 5% trở lên, trong khi tần số bình thường là 2,5% Các trường hợp bất thường ở tim và mạch máu lớn chiếm tới 90,8% các trường hợp Thường

là, các tổn thương ở vách liên thất và các tật của van tim Ngoài ra, còn gặp những DTBS ở hàng loạt các cơ quan khác như: hệ thần kinh, tiêu hóa, hô hấp, bài tiết, sinh dục…

Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan, nên thời gian sống của các trẻ Trisomy 18 không được lâu Có tới 60% các trường hợp bị chết trước 3 tháng (trong đó 30% là trước 1 tháng) Chỉ 1 trong 10 trẻ bị bệnh là sống được đến 1 tuổi

1.1.4 Hội chứng Klinefelter (XXY)[7]

Là dạng bệnh NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng 1:1000 lần trẻ sơ sinh nam và thường gặp trong các trường hợp người mẹ lớn tuổi, trung bình là 32,3 tuổi Những biểu hiện lâm sàng ở tuổi niên thiếu của bệnh nhân Kinefelter thường chỉ là giảm trí tuệ nhẹ, học đọc viết khó khăn, người yếu nhưng lại thường có chiều cao cao hơn các trẻ cùng lứa tuổi do chân dài Ở tuổi trưởng thành mới thấy rõ những dấu hiệu phát triển lệch lạc

về giới tính đàn ông như tinh hoàn bé, mào tinh đôi khi lớn hơn tinh hoàn, mềm bóp không đau, không thấy tinh trùng trong tinh dịch nên vô sinh Ngoài

ra, còn thấy các bất thường của sự phát triển các dấu hiệu sinh dục phụ kiểu

nữ như: tuyến vú phát triển ở 25 - 50% các trường hợp, lớp mỡ dưới da dày, vai hẹp, hông rộng

1.1.5 Hội chứng XYY

Được Evans và cộng sự phát hiện năm 1977 khi phân tích, định loại NST ở các bé trai sơ sinh Tần số người có 47,XYY trong quần thể là 1/1000 nam giới nhưng tần số này tăng cao ở nơi giam giữ các phạm nhân, vì vậy NST Y thừa được gắn cho cái tên là NST tội phạm Lúc nhỏ, biểu hiện ngoài bình thường, thường có nhiều mụn trứng cá ở mặt Lúc dậy thì hầu hết trẻ lớn nhanh, dậy thì muộn hơn trẻ bình thường khoảng 6 tháng Răng lớn, gốc mũi nhô cao và không cân xứng, tai thấp Mặc dù người cao nhưng có xu hướng kém phát triển cơ ngực, cơ vai và cơ thắt lưng Có trường hợp sinh dục kém phát triển, tinh hoàn nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệch thấp Hầu hết có trí tuệ bình thường, một số chậm phát triển trí tuệ

1.1.6 Hội chứng Trisomy X (Hội chứng siêu nữ)[7]

Đặc điểm chung:

Hội chứng Trisomy X được gặp trong dân cư với tần số chung là khoảng 1,3: 1000 lần sinh con gái Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân

biệt người bệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ ràng về hình thái cũng như trí tuệ và thể lực Tuy nhiên, ở những người bệnh cũng có một số bất thường về chức năng sinh sản ở phụ nữ như vô kinh thứ phát, rối loạn kinh nguyệt, mãn kinh sớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt cao Những phụ nữ Trisomy X vẫn có khả năng sinh đẻ bình thường song nguy cơ các bất thường các NST ở con cái cao hơn những người khác

1.1.7 Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner),[33][7]

Ở trẻ em gái và thanh niên: người lùn chậm lớn và có những biểu hiện bất thường như khe mắt cụp, sụp mi, mép xệ, khẩu cái hình cug nhọn Tai thấp

và vểnh ra sau, tóc mọc thấp Cổ ngắn và rộng vì có nếp da hình cánh bướm nối liền từ xương chũm đến mỏm cùng vai Cẳng tay cong ra ngoài, ngắn đốt thứ tư Lồng ngực hình lá chắn, hai núm vú kém phát triển và xa nhau

Cơ quan sinh dục có rất ít hoặc không có lông mu, không có lông nách, đôi khi có dấu hiệu nam hóa với âm vật phì đại Tuyến sinh dục không phát triển, soi ổ bụng thấy 1 dải nhỏ màu trắng nhạt, trường hợp điển hình thấy tổ chức xơ Tử cung nhỏ, có thể chẻ đôi Giới tính thứ cấp không phát triển, tuyến vú không phát triển, vô kinh nguyên phát

Xét nghiệm: không có nội tiết tố nữ: estrogen và pregnandiol, tăng FSH, 17-cetosteroid thường thấp

Nguyên nhân và cơ chế phát sinh:

Nguyên nhân: do rối loạn NST giới tính X về số lượng hoặc cấu trúc + Khoảng trên 50% kiểu gen ở hội chứng Turner dạng 45,X;

+ Dạng khảm dòng tế bào 45,X với dòng tế khác gặp 15-20%số bệnh nhân mắc hội chứng Turner Các dạng thể khảm là 45,X/46,XX hoặc 45,X/47,XXX Ngoài ra có thể gặp thể 45,X/46,XY, người bệnh bất thường

cơ quan sinh dục ngoài, biểu hiện hoặc có hình thái nam hoặc mơ hồ giới tính hoặc hình thái nữ hoàn toàn

+ Dạng rối loạn cấu trúc NST X: NST X mất nhánh ngắn, nhánh dài…

Cơ chế phát sinh: 75% trường hợp 45,X là do rối loạn phân bào ở bố,

số còn lại có nguồn gốc từ mẹ

1.2 Một số phương pháp sàng lọc trước sinh

Trên thế giới và Việt Nam đã và đang áp dụng các phương pháp sau:

1.2.1 Siêu âm thai:

Trong chẩn đoán trước sinh, siêu âm được sử dụng lần đầu tiên vào những năm 1972 Sau đó siêu âm ngày càng được sử dụng rộng rãi và đã trở thành một phương tiện chẩn đoán quan trọng và không thể thiếu trong chương trình chăm sóc trước sinh Đây là phương pháp không xâm phạm thai, tương đối an toàn nên được xem là một trong những công cụ chủ yếu để sàng lọc và phát hiện các dị tật của thai

Giai đoạn 3 tháng đầu: để đo độ mờ da gáy (dày da gáy)

Độ dày khoảng mờ da gáy được tính là chiều dày tối đa của khoảng mờ dưới da, là chiều dày từ mặt ngoài da gáy tới xương trên đốt sống cổ Sự tăng

độ dày khoảng mờ da gáy liên quan đến các hội chứng bất thường NST như Turner, hội chứng Down, các lệch bội NST khác Sàng lọc sử dụng kết hợp tuổi của mẹ với độ dày khoảng mờ da gáy của thai tuần 10 - 14 ở nhóm thai phụ có nguy cơ cao đã được thực hiện vào những năm 1990, khoảng 80% thai

Trisomy 21 liên quan với tăng khoảng mờ da gáy (≥ 3mm) Độ dày da gáy tăng

theo tuổi thai nếu đo không chính xác sẽ gây nên kết quả dương tính giả [3]

Giai đoạn 3 tháng giữa:

Trong giai đoạn 3 tháng giữa siêu âm theo dõi sự phát triển của thai, rà soát có hệ thống toàn bộ giải phẫu của thai Giai đoạn này, siêu âm có thể phát hiện hầu hết các bất thường ở các cơ quan, định hướng tới tất cả các bệnh của thai từ đó có các chỉ định xét nghiệm chẩn đoán tìm nguyên nhân Ngoài

ra siêu âm còn có ý nghĩa chẩn đoán xác định các dị tật hình thái để có thể đưa ra quyết định chấm dứt thai kỳ[4], [2]

Bảng 1.1 Những dấu hiệu bất thường hay gặp trên siêu âm ba tháng giữa

và các rối loạn NST tương ứng [19]

Bất thường Trisomy 18 Trisomy 21 Trisomy 13 Turner

Giãn não thất + + +

Não trước không phân chia +

Nang đám rối mạch mạc +

Hội chứng Dandy Walker + +

Khe hở môi + +

Cằm nhỏ +

Giảm sản xương mũi +

Phù da gáy + + +

Nang bạch huyết +

Thoát vị hoành + +

Dị tật tim + + + +

Thoát vị rốn + +

Hẹp tá tràng +

Hẹp thực quản + +

Dị tật thận + + + +

Ngắn xương chi + + +

Thiếu ngón +

Ngón tay chồng nhau +

Thừa ngón +

Dính ngón

Bàn chân vẹo + +

Thai chậm phát triển + +

1.2.2 Test sàng lọc bộ ba (triple test : AFP, βhCG,uE 3 )

+ AFP (Alpha feto - protein) [24], [29], [11]

AFP là một protein đặc biệt của thai,được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1956 bởi Bergstrand và Czar AFP được sản xuất từ túi noãn hoàn và gan của

thai Túi noãn hoàn bị teo ở cuối của giai đoạn bào thai, từ tuần thứ 10 hoặc

tuần thứ 11 của thai và AFP chủ yếu do gan tổng hợp AFP được định lượng

trong huyết thanh thai, trong dịch ối hoặc trong huyết thanh mẹ Định lượng

AFP chủ yếu là ở huyết thanh mẹ vì khi thực hiện xét nghiệm này không xâm

phạm đến thai, tránh được những rủi ro có thể đến với thai và với mẹ

AFP trong huyết thanh mẹ tăng từ tuần thai thứ 10 tới tuần thai 30 - 32

rồi giảm dần AFP có nguồn gốc từ thai, khuyếch tán từ huyết thanh của thai

hoặc từ dịch ối qua bánh rau vào vòng tuần hoàn của mẹ AFP tăng cao trong

huyết thanh mẹ từ tuần thứ 12 - 14 Nồng độ MSAFP ổn định thường từ tuần

thai 15 - 18, vì vậy người ta cũng thường định lượng MSAFP trong khoảng

tuần thai này Giá trị trung bình của AFP ở tuần thai 15 - 18:

Huyết thanh thai : 1.510.000 ng/ml

Dịch ối : 10200 ng/ml

Huyết thanh mẹ : 30,6 ng/ml

Nồng độ AFP thấp trong những trường hợp bất thường NST Ngoài ra nồng độ AFP huyết thanh mẹ còn phụ thuộc đặc điểm sinh lý và bệnh lý của

mẹ do đó cần hiệu chỉnh yếu tố này trong sàng lọc trước sinh

+ hCG (human chorionic gonadotropin)[24], [14], [8]

hCG là 1 glycoprotein gồm 2 chuỗi α và β do tế bào lá nuôi tiết ra ngay sau khi có hiện tượng trứng làm tổ Vào ngày thứ 8 sau khi thụ thai có thể thấy hCG trong nước tiểu, hCG tăng nhanh và tăng tối đa vào tuần thai 8-9 sau đó giảm dần đến tuần 11-12 và duy trì nồng độ như vậy cho đến khi gần

đẻ Nồng độ hCG tăng cao trong chửa trứng đặc biệt trong ung thư rau thai Nam giới và phụ nữ không mang thai có nồng độ hCG trong huyết thanh không quá 5mIU/ml

Quá trình phân hủy hCG diễn ra mạnh hơn ở những thai bất thường, các bệnh lý về rau hoặc ung thư và những ngày sau sinh Trong sàng lọc trước sinh, định lượng hCG toàn phần, βhCG được sử dụng như một dấu hiệu để phát hiện thai có nguy cơ bất thường NST[21]

+ uE 3 ( unconjugated Estriol hay Estriol không liên hợp )[24], [16]

uE3 do hoàng thể và rau thai bài tiết, từ tháng thứ 4 trở đi chỉ còn rau thai bài tiết Nồng độ uE3 tăng dần trong máu mẹ, cao nhất vào tháng thứ 9 và giảm dần khi chuyển dạ Nồng độ uE3 giảm chứng tỏ tình trạng suy yếu của bánh rau và thai nhi uE3 đi qua bánh rau vào vòng tuần hoàn mẹ vì vậy có thể định lượng nồng độ uE3 trong máu mẹ Trong quá trình có thai, nồng độ estriol liên hợp và estriol không liên hợp tăng dần, cao nhất vào khoảng tuần thứ 36 Cuối thời kỳ thai nghén nồng độ uE3 là 15ng/ml và estriol toàn phần là 250ng/ml Sau tuần 40, nồng độ estriol giảm đều khoảng 12%/tuần Thời gian bán hủy của estriol trong máu mẹ khoảng 30 - 60 phút điều này liên quan đến bảo quản mẫu để định lượng estriol Nồng độ estriol thấp kéo dài hoặc nồng

độ estriol giảm đột ngột gợi ý đến thai bệnh lý[13], [21]

Ngoài ra người ta còn sử dụng 1 số chất khác trong xét nghiệm sàng lọc như:

- Inhibin

Inhibin là 1 glycoprotein gồm 2 chuỗi α và β (gồm 2 loại βAβB)

Ở những người phụ nữ không có thai buồng trứng là nguồn cung cấp inhibin Khi có thai bánh rau và màng rau là nguồn bài tiết chủ yếu inhibin Nếu chuỗi α liên kết với βA gọi là inhibin–A ,hoặc chuỗi α liên kết với βB gọi

là inhibin–B Inhibin–A được sử dụng như 1 chất chỉ điểm huyết thanh và sàng lọc được 70% hội chứng Down với ngưỡng nồng độ 1,79 MoM

- PAPP - A (Pregnancy – associated plasma protein A)

PAPP - A là 1 glycoprotein có nguồn gốc từ bánh rau Nồng độ của nó trong huyết thanh mẹ tiếp tục tăng trong quá trình có thai Với thai Down PAPP – A trong huyết thanh người mẹ giảm trong 3 tháng đầu của thai kì [14] Định lượng PAPP – A được sử dụng trong 3 tháng đầu của thai để thay thế cho định lượng AFP

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

1.3.1 Lấy mẫu di truyền

Muốn chẩn đoán bất thường NST trước hết phải lấy được mẫu di truyền

từ thai nhi, có thể dùng các phương pháp sau

1.3.1.1 Lấy mẫu xâm phạm thai

bì đường tiết niệu của thai nhi Các tế bào này sẽ được tách DNA trực tiếp

hoặc nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để thu được lượng tế bào thai nhi nhiều hơn và giúp loại bỏ các tế bào máu của người mẹ lẫn vào Tuy nhiên phương pháp này cho chẩn đoán muộn (tuổi thai từ 15 - 18 tuần tuổi trở lên)

và gây ra những tai biến nhất định như :

- Sẩy thai: khoảng 0,5-1% Theo trường Đại học Thực hành Sản phụ khoa Mỹ, tỷ lệ sẩy thai do chọc ối vào khoảng 1/300-1/500[15]

- Chảy máu bánh rau: bánh rau chảy máu gây nhiễm tế bào máu mẹ trong dịch ối dẫn đến tình trạng khảm khi phân tích Biến chứng này ít xảy ra khi bánh rau nằm phía sau

- Biên chứng do bất đồng nhóm máu mẹ con Rh: 2 - 3% trường hợp chọc ối ba tháng giữa có thể gây chảy máu từ thai sang mẹ gây phản ứng miễn dịch đối với trường hợp mẹ Rh (-) Để tránh biến chứng này, có thể phòng bằng cách tiêm 100 - 300µg kháng thể RhD cho mẹ trước khi chọc ối

- Nhiễm trùng mẹ: rất hiếm gặp và có thể phòng tránh nếu đảm bảo nghiêm ngặt điều kiện vô trùng

- Rỉ ối hoặc thấm máu âm đạo: gặp khoảng 2 - 3% Nước ối chảy ra vài giờ sau khi chọc, sau đó tự cầm[3]

+ Sinh thiết tua rau (chrionic villus sample, CVS):

Sinh thiết tua rau được biết đến từ cuối những năm 1960, nhưng cho tới năm 1983 khi có sự hướng dẫn của siêu âm, chọc hút tua rau mới trở thành một kỹ thuật phổ biến để chẩn đoán trước sinh ở ba tháng đầu của thai Với mục đích phân tích karyotyp, tua rau sinh thiết có thể được sử dụng để nuôi cấy ngắn hạn qua đêm, nuôi cấy kinh điển (1 - 2 tuần) hoặc phân tích NST trực tiếp Phương pháp phân tích NST trực tiếp hoặc nuôi cấy ngắn hạn qua đêm cho kết quả trong vài giờ hoặc 1 ngày tuy nhiên phương pháp này cho kỹ thuật băng kém nên ít được sử dụng[25]

Hạn chế của kỹ thuật sinh thiết tua rau là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, tăng 0,8% so với chọc hút dịch ối kinh điển Theo nghiên cứu của Dunn K.L., Golmilow L., tỷ lệ sẩy thai của sinh thiết tua rau là 1,9 - 2,1% Một trong những hạn chế khác của sinh thiết tua rau là tình trạng khảm do lẫn tế bào mẹ hoặc sự phát triển quá nhanh của tế bào cytotrophoblast của rau[25]

+ Chọc hút máu cuống rốn (Percutaneous Umbilical Blodd Sampling):

Được thực hiện từ tuần thai thứ 18 bằng cách đưa một cây kim vào cuống rốn dưới sự hướng dẫn của siêu âm Tỷ lệ sẩy thai là khoảng 1 đến 2% cao hơn so với phương pháp chọc ối Vì vậy ngày nay, chọc hút máu cuống rốn chỉ áp dụng chẩn đoán các bệnh về máu

+ Kỹ thuật PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)

Kỹ thuật này được áp dụng cho những phôi thai hành thành từ phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm nhằm giúp việc chọn lọc phôi không bị rối loạn di truyền (loạn dưỡng cơ Duchenne, xơ nang tụy, hội chứng Down,…) trước khi cấy phôi vào tử cung

1.3.1.2 Lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai và đối với người mẹ Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:

+ Thu thập tế bào thai nhi từ máu mẹ

+ Tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu người mẹ

1.3.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào:

Các mẫu tế bào ối và tế bào tua rau sẽ được tiến hành xét nghiệm NST

theo phương pháp nuôi cấy tế bào kinh điển

1956 Tjio và Levan đã xác định được chính xác số lượng NST người là

46 bằng kỹ thuật nuôi cấy lympho máu ngoại vi Có 2 phương pháp xét

nghiệm NST: phương pháp trực tiếp và phương pháp nuôi cấy Trong phương pháp nuôi cấy gồm: phương pháp nuôi cấy ngắn hạn (24h) áp dụng cho những

mô phân chia mạnh và phương pháp nuôi cấy dài hạn (48 - 72h) áp dụng cho những mô phân chia kém hoặc không phân chia (trong môi trường nuôi cấy

có bổ sung chất kích thích PHA- phytohemagglutinin)[20]

Trước năm 1970 kỹ thuật nhuộm giêmsa thông thường chủ yếu phát hiện rối loạn số lượng NST Tuy nhiên, các nhà di truyền tế bào cũng chưa thể xác định được chính xác từng chiếc, đặc biệt là những biến đổi về hình thái, cấu trúc của các NST trong cùng một nhóm

Sau năm 1970 kỹ thuật nhuộm băng G và băng R đã được phát hiện và ứng dụng trong việc xác định NST[22] Phương pháp nhộm băng G cho phép xác định được các vùng của từng NST, các rối loạn của NST: Trisomy, đứt đoạn, Trisomy từng phần Mặc dù hiện nay đã phát triển kỹ thuật băng G với

độ phân giải cao nhưng vẫn chưa phát hiện được những rối loạn NST như nhân đoạn, mất đoạn nhỏ

Đối với băng R, mục đích và ý nghĩa sử dụng cũng giống như với băng

G, chỉ khác là hình ảnh các băng đậm nhạt ngược với băng G Hai phương pháp nhuộm đều có giá trị như nhau trong việc phát hiện rối loạn cấu trúc NST, tuy nhiên trong một số trường hợp người ta có thể kết hợp cả hai phương pháp nhuộm để có hiệu quả hơn trong việc pháp hiện các rối loạn cấu trúc NST

1.3.3 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tử:

Từ cuối những năm 80 kỹ thuật FISH (Fluorescent in situ hybridization) đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới để xác định những bất thường NST, đặc biệt là những rối loạn nhỏ Đây là một kỹ thuật đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì nó có thể thực hiện trên nhân tế bào gian

kì, không cần thời gian nuôi cấy, vì vậy cho kết quả sau một thời gian ngắn (24 - 48h), đáp ứng được yêu cầu cấp thiết của chẩn đoán trước sinh Mẫu tế bào ối có thể được lấy sớm từ tuần thứ 12 [28], [30], [32]

Kỹ thuật FISH sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, gọi

là DNA dò (các DNA dò này được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ hoặc bằng phương pháp hóa học) Các DNA dò sẽ được lai với trình tự của DNA trên tiêu bản NST ở kì giữa, đầu kì giữa hoặc gian kì Qua sự lai của DNA dò với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện và định vị được trình tự ấy qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang [5], [17]

Kỹ thuật FISH có những hạn chế như: giá thành của kỹ thuật cao hơn nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy thông thường Kết quả phụ thuộc vào chất lượng cũng như số lượng DNA mẫu, sự chuẩn bị tiêu bản và khả năng nhận biết màu sắc tín hiệu huỳnh quang của người đọc kết quả, có thể có hiện tượng âm tính giả Mặt khác kỹ thuật FISH đòi hỏi thiết bị và chuyên môn cao nên không thể triển khai rộng rãi trên quy mô lớn [9]

1.3.4 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử:

Năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật QF – PCR (Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) để xác định bất thường số lượng NST Từ năm 1998 đến năm 2001 một số phòng thí nghiệm

ở Anh và Châu Âu đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh bất thường số lượng NST

1.3.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật QF - PCR:

¾ Khái niệm về STR (short tandem repeat)

STR là đoạn trình tự lặp ngắn từ 2-3 bp, nằm ở các đoạn intron với số lần lặp lại tùy thuộc vào mỗi cá thể và mỗi vùng khác nhau trên NST, đoạn STR có tính đa hình rất cao và được phân bố khắp trong bộ gen, số lần lặp lại đặc trưng cho từng cá thể sẽ di truyền cho thế hệ sau

¾ Nguyên tắc của kỹ thuật QF-PCR

Kỹ thuật QF – PCR sử dụng đoạn mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại các vùng STR Các vùng STR được khuếch đại sẽ tạo ra các sản phẩm PCR

huỳnh quang khác nhau và được định lượng bằng điện di mao quản trên hệ thống máy sequencing ABI Kết quả sẽ hiển thị bằng các đỉnh (trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái sang phải, trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao các đỉnh)

Hình 1.1 Kết quả điện di huỳnh quang trên máy ABI

¾ Người bình thường:

Người bình thường có 2 alen, khi 2 alen đó đồng hợp tử (homozygous) tức

là vùng STR có cùng kích thước, sản phẩm PCR huỳnh quang tạo ra như

nhau, điện di mao quản sẽ cho 1 đỉnh duy nhất

Hình 1.2 Hai alen đồng hợp tử

Khi 2 alen đó dị hợp tử (heterozygous) tức đoạn STR khác nhau về số lần lặp lại, sản phẩm PCR huỳnh quang khác nhau về kích thước, kết quả điện

di mao quản sẽ cho 2 đỉnh khác nhau với tỉ lệ 1:1

Hình 1.3 Hai alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1

¾ Người bị hội chứng lệch bội:

Người bị hội chứng lệch bội NST mang 3 alen, khi 3 alen đều ở dị hợp

tử, các vùng STR sẽ khác nhau về số lần lặp lại, kết quả điện di mao quản sẽ

cho 3 đỉnh tương tứng với tỉ lệ 1:1:1 (Trisomyc Triallelic) [1]

Hình 1.4 3 alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1:1

Khi 3 alen có 2 alen đồng hợp, sẽ có 2 đoạn STR cùng số trình tự lặp lại, kết quả điện di mao quan sẽ cho 2 đỉnh với tỷ lệ 2:1 (Trisomyc Diallelic)[1]

Hình 1.5 3 alen dị hợp tử tỉ lệ 2:1

Khi 3 alen đều đồng hợp, các vùng STR sẽ có cùng kích thước, kết quả điện di mao quan sẽ cho sẽ chỉ cho 1 đỉnh duy nhất Trong trường hợp này không thể phân biệt được là có 2 hay 3 alen, khi đó cần phải khuếch đại thêm

1 vùng STR khác để xác định số alen

Hình 1.6 Ba alen đồng hợp tử

Dựa vào tỉ lệ giữa các đỉnh, số alen sẽ được xác định Do bất thường số

alen tương ứng với các NST nên phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn

đoán bất thường NST 1 cách nhanh chóng và chính xác

1.3.4.2 Độ chính xác của kỹ thuật:

Kết quả một số nghiên cứu ở bảng 1.2 cho thấy, 22504 mẫu ối đã được

chẩn đoán xác định bằng karyotype được sử dụng để tiến hành kỹ thuật

QF-PCR Tỷ lệ phát hiện bất thường số lượng NST ở các NST lựa chọn (13, 18,

21 và X, Y) là 98,6% Bất thường NST giới tính chiếm tỷ lệ âm tính giả cao

nhất (7/74), ngược lại chỉ có 3/551, 3/222 và 0/80 chẩn đoán nhầm lần lượt ở

Số dịch

ối

Số ca CVS

Số ca PUBS

Số ca TOP

NST/

số marker

Số ca phát hiện Trisomy/số ca Trisomy thực tế

Chú thích:

AF = Amniotic Fluid (dịch ối); CVS= Chorionic villous sampling (sinh thiết gai rau); PUBS = Percutaneous umbilical blood sampling (lấy máu cuống rốn); TOP = Termination of pregnancy (đình chỉ thai nghén)

1.3.4.3 Vai trò của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh:

Một số tác giả đề xuất QF - PCR phải được sử dụng như là xét nghiệm

bổ sung cho xét nghiệm tế bào quy ước hoặc có thể trở thành một phương pháp lựa chọn trong chẩn đoán trước sinh trong tương lai đối với các bất thường NST trên các tế bào phôi phân lập từ máu mẹ Ưu điểm của kỹ thuật là cho kết quả nhanh trong khi chờ đợi kết quả karyotyp đầy đủ và có thể giảm

lo âu cho người mẹ

Gần đây, Ogilvie (2003) và Leung cùng cộng sự, (2004) đã đề xuất thay thế phân tích di truyền tế bào trước sinh sau khi sàng lọc dương tính đối với hội chứng Down bằng kỹ thuật QF - PCR Nhóm tác giả đưa ra những thuận lợi của kỹ thuật này rõ ràng vượt trội so với những nhược điểm Việc sử dụng kỹ thuật QF - PCR dẫn đến câu trả lời nhanh hơn, giá thành hạ hơn và cơn co thắt tử cung ít hơn so với kỹ thuật di truyền tế bào quy ước và là một

kỹ thuật có độ chính xác cao trong chẩn đoán hay kiểm soát hội chứng Down

Tuy nhiên kỹ thuật này cũng có một số hạn chế như có thể bị sai do ảnh hưởng của tình trạng khảm, nhiễm tế bào mẹ, các đột biến mới, các sản phẩm thừa…

Tóm lại, kỹ thuật QF - PCR có rất nhiều ưu điểm vượt trội: cho phép rút gọn thời gian của một xét nghiệm xuống còn khoảng 5 giờ sau khi lấy mẫu, không đòi hỏi nuôi cấy tế bào nên không cần mẫu tươi hay vô khuẩn, thậm chí

có thể phân tích đối với các mẫu DNA đã bị đứt gãy như các mẫu máu khô, DNA nằm ngoài tế bào… Ngoài ra, do đặc điểm về quy trình của phương pháp này nên có thể triển khai trên quy mô lớn, với số lượng mẫu nhiều

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Mẫu bệnh: mẫu dịch ối của những phụ nữ mang thai có bất thường về NST được chẩn đoán xác định bằng kỹ thuật di truyền tế bào tại trường Đại học Y Hà Nội n = 29 mẫu và 1ml dịch ối/1 mẫu

Mẫu bình thường: mẫu dịch ối của những phụ nữ mang thai khỏe mạnh, không có bất thường về NST được chẩn đoán xác định bằng kỹ thuật di truyền tế bào trường Đại học Y Hà Nội n = 2 mẫu và 1 ml dịch ối/1 mẫu

2.1.2 Địa điểm lấy mẫu:

Mẫu ối được thu thập tại bộ môn Y sinh học – Di truyền trường Đại

học Y Hà Nội

2.1.3 Địa điểm phân tích mẫu:

Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein – Trường Đại học Y Hà Nội

2.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 1/2011 đến tháng 7/2011

2.3 Phương tiện nghiên cứu

2.3.1 Dụng cụ:

Dụng cụ phải tuyệt đối vô trùng (hấp ướt 1200C trong 20 phút)

- Máy PCR: Effpendorf (Đức)

- Tủ lạnh sâu: -30°C (SANYO), tủ ấm

- Máy điện di mao quản Agilent 3100 Bioanalyzer

- Máy đo nồng độ DNA

- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức)

- Pipet định mức, đầu côn các loại, ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối

2.3.2 Hóa chất:

- Hóa chất dùng tách chiết DNA: Kit Qiagen

- Hóa chất dùng cho phản ứng QF - PCR : bộ kit của hãng AneufastTM

- Hóa chất điện di huỳnh quang: Hi-DiTM Formamide, GeneScanTM-500 LIZTM Size Standard, Capillary 36, POP4, Buffer

2.4 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu mô tả

2.4.2 Kỹ thuật sử dụng:

Bằng kỹ thuật chọc ối (phụ lục 1) mẫu ối sẽ được thu thập tại bộ môn Y

Sinh học – Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội

2.4.2.1 Tách chiết DNA:

Tách chiết DNA là khâu đầu tiên để thực hiện quy trình phân tích gen Đây là bước rất quan trọng quyết định sự thành công của các kỹ thuật tiếp sau DNA tách chiết phải đảm bảo tinh sạch, không lẫn hóa chất và các thành

phần khác của tế bào Quy trình tách chiết như sau:

- Bước 1: Lấy 1ml dịch ối ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút bỏ dịch nổi

giữ lại 200µl dịch ối

- Bước 2: Cho 20µl protein K và 200µl Buffer AL, lắc 15 giây

- Bước 3: Ủ 56o C trong10 phút

- Bước 4: Thêm 200µl cồn 100 o, lắc 15 giây, ly tâm 10 giây

- Bước 5: Chuyển toàn bộ dung dịch từ ống Effendor sang cột lọc

- Bước 6: Ly tâm 8000 vòng/phút

- Bước 7: Chuyển cột lọc sang ống khác, bỏ phần ống và dịch dưới đi

- Bước 8: Cho 500 µl AW1, ly tâm 8000 vòng/phút

- Bước 9: Chuyển cột lọc sang ống sạch khác, bỏ phần ống và dịch

- Bước 10: Cho 500 µl AW2, ly tâm 14000 vòng/3 phút

- Bước 11: Chuyển cột lọc sang ống Effendor khác đã ghi mã số, bỏ

phần ống và dịch dưới, cho 80 µl Buffer AE để khoảng 2 phút Đem ly tâm

¾ Cách tiến hành:

- Tra 1µl mẫu vào giếng đo của máy Nanodrop

- Đo mật độ quang trên 2 bước sóng 260nm và 280nm

- Đọc kết quả trên màn hiển thị nồng độ DNA tính bằng ng/µl và OD

Hình 2.1 Kết quả đo nồng độ DNA bằng máy quang phổ Nanodrop

2.4.2.3 Khuếch đại các vùng STR bằng kỹ thuật QF-PCR

* Bộ kit của hãng Aneufast TM gồm:

- Mồi gắn huỳnh quang (marker)

- dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

- Taq DNA polymerase

- Đệm thích hợp

*Các marker được sử dụng trong bộ kit Aneufast TM :

Bảng 2.1: Các marker được sử dụng trong bộ kit Aneufast[12]

Marker Tỉ lệ dị hợp tử sản phẩm (bp)Kích thước Vị trí của mồi trên NST

¾ Bộ kit gồm có 29 marker trong đó:

- 7 marker chẩn đoán cho NST 21: D21S1414, D21S1411, D21S1446, D21S1437, D21S1008, D21S1412, D21S1435

- 7 marker chẩn đoán cho NST 18: D18S391, D18S390, D18S535, D18S386, D18S858, D18S499, D18S1002

- 6 marker chẩn đoán cho NST 13: D13S631, D13S634, D13S258, D13S258, D13S305, D13S628, D13S742

- 9 marker chẩn đoán cho NST giới Trong đó có marker SRY chẩn đoán riêng cho NST Y, marker SBMA, HPRT, DXS6803, DXS6809, DXS8377 chẩn đoán riêng cho NST X, marker AMXY, X22, DXYS218 chẩn đoán cho

cả NST X và Y

¾ Các marker này được chia làm 6 lọ trong mỗi lọ gồm các marker sau:

Bảng 2.2: Các marker được sử dụng trong từng lọ

Khi tiến hành kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán sự bất thường các NST,

thường thì chỉ cần dùng các marker ở lọ S1 và S2 Trong một số trường hợp

nghi ngờ hoặc cho kết quả không rõ ràng, các marker khác (lọ XY, lọ 13, lọ

18, lọ 21) sẽ được sử dụng, ở các lọ này ngoài các marker có trong S1, S2 còn

có thêm một số marker gọi là các extra marker

Kéo dài chuỗi cuối Duy trì

2.4.2.4 Điện di trên máy ABI 3100:

¾ Nguyên lý: Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực

dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng

- Sau khi trộn mẫu, biến tính bằng hệ thống máy PCR ABI Effpendorf ở

95oC trong thời gian 5 phút, sau đó chuyển sang ngâm trong đá bào 0oC trong thời gian ít nhất 3 phút

- Tiến hành tra mẫu vào khay, đặt thông số cho quá trình chạy Fragment trên phần mềm vận hành máy Thiết lập các thông số cho project phân tích: MGX _ Aneufast_ Bins, MGX _ Aneufast_ Panels, AneufastAnalysisMethod, AneufastPlotSettings, AneufastReportSettings, AneufastSizeStd bằng các lệnh import

- Đặt tên cho project của mỗi cá nhân sử dụng

- Chú ý, chọn Genescan theo kích thước GeneScan – 500 LIZ Size, quy trình được lựa chọn đối với ứng dụng Fragment POP4, mao quản 36

* Điện di mao quản cho phép phân tích các băng vạch có sự sai khác nhau chỉ một nucleotid Kết quả sẽ cho ta xác định được kích thước của các locus tương ứng với các alen của mỗi locus

1,6 : 1 đối với các alen ≥ 20bp Bình thường

Chẩn đoán người đó bị lệch bội NST khi có ít nhất 2 marker chẩn đoán cho cùng 1 NST có tỉ lệ 1:1:1 hoặc 2:1

Toàn bộ quy trình QF-PCR thực hiện từ khi lấy mẫu cho đến khi có kết quả khoảng 5 giờ, trong đó cần 30 phút tách chiết DNA, 2 giờ cho chạy PCR,

1 giờ 20 phút cho chạy điện di và 30 phút cho phân tích kết quả Như vậy, kỹ thuật QF-PCR rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các kỹ thuật cổ điển như:

kỹ thuật nhuộm băng NST mất 3 tuần, kỹ thuật FISH mất khoảng 2 ngày

2.5 Xử lý và phân tích số liệu

Các số liệu thu thập được sẽ được xử lý và phân tích theo phần mềm Excell

2.6 Vấn đề đạo đức của đề tài

Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là vì lợi ích của thai phụ nên:

- Đối tượng nghiên cứu được thông báo đúng về mục đích nghiên cứu giải thích những ưu điểm của các xét nghiệm cũng như các rủi ro của chọc ối

- Đề tài được tiến hành dựa trên sự tham gia tự nguyện của sản phụ, thai phụ tham gia chọc ối phải có đơn xin làm xét nghiệm

- Các thông tin về đối tượng nghiên cứu, kết quả chẩn đoán hoàn toàn được giữ bí mật

- Đối tượng nghiên cứu sẽ được thông báo phản hồi kết quả nghiên cứu

- Khám, tư vấn di truyền cho đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu chỉ được tiến hành sau khi được phép Hội đồng đạo đức, trường Đại học Y Hà Nội