Xác định giới hạn nền một số căn nguyên gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi.. Xác định căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi và tính nhạy cảm với kháng sinh củ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG
Người hướng dẫn khoa học:
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Trang 3BẢNG NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
cDNA Complimentary deoxiribonucleotid acid
CFU Colony Forming Unit (Đơn vị dạng khuẩn lạc)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phản ứng miễn dịch
tìm enzyme)
H influenzae Haemophilus influenzae
M catarrhalis Moraxella catarrhalis
MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối
thiểu)PBP Penicillin Binding Protein (Penicillin kết hợp với
protein)PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi khuyếch
đại gen)RSV Respiratory Syncytial Virus (Vi rút hợp bào hô hấp)
RT-PCR Reveser Transcriptation - Polymerase Chain Reaction
(Phiên mã ngược)
S pneumoniae Streptococcus pneumoniae (Phế cầu)
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
Trang 4Ở Việt Nam, NTHHC hiện đang có tỷ lệ mắc và tử vong cao, đứngđầu trong nhóm bệnh nhiễm trùng cấp tính Căn nguyên gây NTHHC rất
đa dạng: do vi khuẩn, vi rút hoặc ký sinh vật Đối với các nước phát triển,căn nguyên gây bệnh chủ yếu do vi rút, chiếm 80 - 90%; các vi rút gây
bệnh hay gặp là cúm, hợp bào đường hô hấp, Rhinovirus và Adenovirus Ở
các nước đang phát triển, căn nguyên gây bệnh lại chủ yếu do vi khuẩn
chiếm 75%; các vi khuẩn gây bệnh hay gặp là S pneumoniae, H.
influenzae và M catarrhalis Đây là những vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn
bình thường và gây bệnh có điều kiện, nên khi tìm thấy chúng vẫn chưakhẳng định chắc chắn đó là tác nhân gây bệnh Vì vậy, tìm ra giới hạn nền
để biết được đó là vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn bình thường hay tác nhâncủa bệnh là rất cần thiết WHO đã rất nỗ lực trong việc phòng chốngNTHHC ở phạm vi toàn cầu, nhưng tỷ lệ mắc và tử vong giảm chậm, do vikhuẩn thay đổi tính kháng kháng sinh, hạn chế hiệu quả điều trị
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện luận án: "Nghiên cứu
căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Nha Trang, năm 2009".
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1 Xác định giới hạn nền một số căn nguyên gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi.
2 Xác định căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi và tính nhạy cảm với kháng sinh của các vi khuẩn thường gặp
3 Tìm hiểu một số yếu tố liên quan đến căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi.
CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1 Nêu ra được giới hạn nền về mật độ vi khuẩn có trong bệnh phẩm họngmũi, làm cơ sở cho việc phân tích, đánh giá kết quả xét nghiệm chẩn đoánnhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở trẻ em
2 Xác định được sự phân bố tỷ lệ vi khuẩn, vi rút có khả năng gây bệnh ởtrẻ lành và trẻ dưới 5 tuổi mắc nhiễm trùng hô hấp cấp tính
3 Cập nhật được thông tin về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của một số
vi khuẩn gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở trẻ em và cho biết một số yếu
tố liên quan đến nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em
Trang 5CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án dày 125 trang không kể phần tài liệu tham khảo và phụ lục;gồm 4 chương, 38 bảng, 10 biểu đồ, 3 hình; 125 tài liệu tham khảo trong
và ngoài nước Bố cục luận án gồm: đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 35trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 26 trang, kết quả 31 trang,bàn luận 28 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang; 2 bài báo có liênquan đến luận án đã được công bố
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm giải phẫu, sinh lý, miễn dịch bộ máy hô hấp và hệ vi
khuẩn bình thường ở trẻ em
1.1.1 Đặc điểm về giải phẫu:
Bộ máy hô hấp được hình thành từ ngày thứ 20 - 22 của thời kỳ phôithai; tiếp tục phát triển về cấu tạo, chức năng cho đến khi trẻ ra đời và bộmáy hô hấp hoạt động được Nhưng về mặt cấu tạo và chức năng chưahoàn chỉnh; nên bộ máy hô hấp của trẻ còn tiếp tục phát triển đến tuổitrưởng thành
1.1.2 Đặc điểm về sinh lý:
Các đường dẫn khí ngắn, nhiễm trùng đường hô hấp trên dễ lan xuốngđường hô hấp dưới Sức cản đường hô hấp rất lớn, sự giãn nở của lồngngực kém Bệnh lý đường hô hấp do niêm mạc có nhiều mạch máu; nên dễ
bị xung huyết, phù nề, xuất tiết càng làm hẹp đường thở; nên sức cản tănglên, gây rối loạn thông khí
1.1.3 Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp trẻ em:
Vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, chúnggặp phải hệ thống bảo vệ đường hô hấp gồm: hàng rào niêm mạc, các yếu
tố thể dịch và các tế bào thực bào
1.1.4 Hệ vi khuẩn bình thường ở trẻ em:
- Vi khuẩn ở mũi: ở mũi có các vi khuẩn giả bạch hầu và tụ cầu, trong đó
đáng chú ý là tụ cầu vàng Có tới 20-50% người lành mang tụ cầu vàngtrong mũi và tỷ lệ này cao hơn ở những người làm việc trong môi trườngbệnh viện
- Vi khuẩn ở họng mũi: ở họng số lượng và chủng loại vi khuẩn khá phong
phú do từ miệng lan truyền như phế cầu, H influenzae, M catarhalis, S.
viridans Tuy vậy, tuỳ vị trí mà vi khuẩn có khả năng gây bệnh, đặc biệt ở
tuyến hạnh nhân thường có liên cầu nhóm A thường gây viêm họng vàbệnh thấp tim
- Vi khuẩn ở khí quản và phế quản: do đặc điểm cấu tạo, sinh lý có chất
niêm dịch, đại thực bào nên ở đường hô hấp dưới thường không có vikhuẩn
Trang 61.2 Căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp ở trẻ dưới 5 tuổi và tính nhạy cảm với kháng sinh
1.2.1 Tình hình nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
1.2.1.1 Nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi trên thế giới:
NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi, chiếm vị trí hàng đầu về tỷ lệ mắc bệnh và
tỷ lệ tử vong trên toàn thế giới Tỷ lệ tử vong do NTHHC ở các nước đangphát triển cao gấp 30 - 50 lần ở các nước phát triển Các nghiên cứu chothấy: ở các nước phát triển, căn nguyên gây NTHHC chủ yếu do vi rútchiếm 80 - 90% Còn ở các nước đang phát triển, căn nguyên lại chủ yếu
do vi khuẩn chiếm 75%
1.2.1.2 Nghiên cứu NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi tại Việt Nam:
Việt Nam NTHHC hiện có tỷ lệ mắc và tử vong cao chủ yếu ở trẻdưới 5 tuổi Theo báo cáo của chương trình quốc gia, phòng chốngNTHHC năm 2000: tỷ lệ mắc NTHHC của trẻ em nước ta là 65,8%, chiếm
tỷ lệ cao nhất trong các bệnh mắc phải ở cộng đồng
1.2.2 Căn nguyên vi rút gây NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
1.2.2.1 Vi rút cúm:
Vai trò gây bệnh: vi rút cúm lây truyền từ người sang người qua đường hô
hấp Triệu chứng lâm sàng hay gặp: sốt nhẹ, hắt hơi, đau đầu, ho, xuất tiếtnhiều Ở trẻ nhỏ bệnh có biểu hiện với các triệu chứng: sốt cao, co giật,viêm dạ dày - ruột Bệnh ở trẻ sơ sinh còn nặng hơn với các triệu chứng:viêm cơ tim, viêm phổi và có thể đưa đến biến chứng viêm não, dẫn tới tử vong
Chẩn đoán phòng thí nghiệm:
- Cách lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm cần được lấy trong giai đoạn sớm khi
bệnh mới khởi phát Bệnh phẩm tốt nhất cho chẩn đoán cúm là bệnh phẩmhọng mũi, kết hợp với bệnh phẩm họng miệng
- Bệnh phẩm cho chẩn đoán huyết thanh: máu ở giai đoạn cấp tính được
thu nhận càng sớm càng tốt Máu ở giai đoạn hồi phục được lấy sau 14-28ngày kể từ khi lấy máu cấp tính Huyết thanh được bảo quản ở -200C chotới khi làm xét nghiệm
- Phương pháp chẩn đoán:
+ Phân lập và định loại vi rút: bệnh phẩm trong môi trường vận chuyển
cấy vào khoang ối của phôi gà 9 ngày tuổi, ủ 48 giờ ở 330C, ủ ở 40C quađêm, thu dịch ối, xác định hiệu giá HA, nếu dương tính thì làm HI để xácđịnh týp và phân týp
+ Phát hiện vật liệu di truyền của vi rút: vật liệu di truyền của vi rút là
ARN sợi âm Kỹ thuật phân tử được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vậtliệu di truyền của vi rút cúm là RT-PCR
+ Các kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh và
nghiên cứu cúm: phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng ức chế ngưng kết
hồng cầu, kỹ thuật ELISA
Trang 71.2.2.2 Vi rút hợp bào đường hô hấp:
Vai trò gây bệnh: RSV lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt chất tiết
có vi rút Bệnh thường gặp ở trẻ từ 6 tuần đến 6 tháng tuổi Khởi phát vớicác dấu hiệu của viêm đường hô hấp trên: sốt, ho, chảy mũi Ở trẻ lớn,
nhiễm RSV thường có bệnh cảnh của nhiễm lạnh hoặc rất ít triệu chứng; do
vậy, chẩn đoán lâm sàng gặp rất nhiều khó khăn
Chẩn đoán phòng thí nghiệm: bệnh phẩm là dịch họng mũi nuôi cấy trong
tế bào cảm thụ để tìm tế bào khổng lồ Ngoài ra, chẩn đoán xác định bằngphương pháp miễn dịch huỳnh quang, PCR
1.2.2.3 Adenovirus:
Vai trò gây bệnh: vi rút gây ra nhiễm trùng cấp tính với đặc điểm: thời
gian ủ bệnh ngắn, đào thải vi rút kéo dài, bệnh thường nhẹ, nhưng viêmphổi ở trẻ nhỏ có thể gây tử vong Vi rút không nhân lên mà tồn tại lâu dàitrong tế bào, khi sức đề kháng cơ thể giảm mới nhân lên và gây bệnh
Chẩn đoán phòng thí nghiệm: sử dụng tế bào Hep 2 là tế bào cảm thụ đặc
hiệu với Adenovirus Các phiến nhựa nuôi cấy tế bào Hep 2, đã được gây
nhiễm bằng bệnh phẩm, nếu thấy hủy hoại tế bào trên 25%, tiến hành kỹ
thuật PCR hoặc miễn dịch huỳnh quang để xác định Adenovirus.
1.2.2.4 Rhinovirus:
Vai trò gây bệnh: Rhinovirus xâm nhập vào cơ thể do hít phải những hạt
dịch tiết đường hô hấp của người bệnh hoặc gián tiếp qua bàn tay, khăntay, đồ dùng, đồ chơi trẻ em bị nhiễm dịch tiết đường hô hấp có chứa virút Vi rút xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp trên và thường chỉ giớihạn gây bệnh ở đây
Chẩn đoán phòng thí nghiệm: chẩn đoán phòng thí nghiệm dựa vào phân
lập vi rút từ dịch tiết họng mũi, trên nuôi cấy tế bào Sử dụng kỹ thuật PCR
để xác định gen đặc hiệu của vi rút
1.2.3 Căn nguyên vi khuẩn gây NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
1.2.3.1 Phế cầu (S pneumoniae):
Vai trò gây bệnh: S pneumoniae thường cư trú ở vùng tỵ hầu của người
lành, với tỷ lệ cao từ 40 đến 70%; vi khuẩn có thể gây viêm đường hô hấp,
điển hình là viêm phổi Viêm phổi do S pneumoniae xảy ra sau khi đường
hô hấp bị tổn thương do nhiễm vi rút hoặc hoá chất S pneumoniae còn
gây viêm tai, viêm xoang, viêm họng; nhiễm khuẩn huyết và gây viêmmàng não ở trẻ em
Chẩn đoán phòng thí nghiệm:
* Nhuộm Gram: bệnh phẩm họng mũi ít có giá trị xác định căn nguyên gây
bệnh; vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và nếu xác định được vi khuẩn, có thể đó
là vi khuẩn thuộc hệ vi khuẩn bình thường
Trang 8* Nuôi cấy phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.
Tiêu chuẩn xác định phế cầu:
- Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5%: nhỏ, ướt, có xu hướng lõmgiữa, tan huyết alpha
- Tính chất vi khuẩn: Song cầu hình ngọn nến hay cặp mắt kính, bắt màuGram (+) và nhạy cảm optochin (đường kính vòng vô khuẩn ≥14mm) hoặc
ít nhạy cảm optochin, nhưng tan trong muối mật
Không phải là phế cầu khuẩn khi:
- Không nhạy cảm với optochin
- Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính < 14mm,không tan trong muối mật
1.2.3.2 H influenzae:
Vai trò gây bệnh: H influenzae ký sinh bắt buộc ở niêm mạc đường hô
hấp của người; khoảng 75% trẻ lành có mang H influenzae ở họng mũi
như là một thành viên của hệ vi khuẩn bình thường; người lớn thì tỷ lệ này
thấp hơn H influenzae có 2 loại chính: loại có vỏ có týp huyết thanh và
loại không vỏ không týp huyết thanh Loại không vỏ thường gây nhiễmkhuẩn nhẹ ở đường hô hấp trên như viêm amiđan, viêm tai giữa Loại có
vỏ gây ra các nhiễm trùng nặng như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết
Chẩn đoán phòng thí nghiệm:
* Nhuộm Gram: đánh giá số lượng các tế bào viêm và vi khuẩn ở trong,
ngoài tế bào theo +, ++, +++
* Nuôi cấy, phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.
Tiêu chuẩn xác định H influenzae:
- Cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu Gram (-), khuẩn lạc trong xám nhẹ, óng ánh, không gây tan huyết
- Phát triển thuần nhất trên môi trường chọn lọc
- Phát triển được cần có đủ yếu tố X và V
- Định týp sinh học với các phản ứng sinh hóa: ODC, URE và IND
- Định týp huyết thanh: chủng gây bệnh hầu hết thuộc typ b
1.2.3.3 Moraxella catarrhalis:
Vai trò gây bệnh: M catarrhalis là một trong ba căn nguyên thường gặp
gây viêm tai giữa ở trẻ em, chiếm từ 10-15% M catarrhalis là vi khuẩn
gây nhiễm trùng cơ hội cư trú ở đường hô hấp trên của trẻ khoẻ, viêm taigiữa thường xuất hiện sau khi tăng tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn từ nơi cư
trú; viêm phổi bắt đầu từ nhánh phế quản nhỏ của phổi 85% số chủng M.
catarrhalis phân lập được ở Mỹ, sinh β - lactamase
Chẩn đoán phòng thí nghiệm:
* Nhuộm Gram: bệnh phẩm là các chất dịch, mủ, máu tuỳ từng thể nhiễm
trùng Nhuộm Gram có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán M catarrhalis.
Trang 9* Nuôi cấy, phân lập: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.
Tiêu chuẩn để xác định M catarrhalis:
- Song cầu bắt mầu Gram (-)
- Không mọc trên Mac Conkey
- Không phân giải các loại đường
- ONPG (-), oxidase (+), catalase (+), DNase (+)
1.2.4 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi
và các kỹ thuật xác định mức nhạy cảm với kháng sinh:
1.2.4.1 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về độ nhạy cảm với kháng sinhcủa các vi khuẩn gây NKHHC, nhất là kháng sinh khuyến cáo trong điềutrị NKHHC cho thấy: mức đề kháng kháng sinh ngày một gia tăng
1.2.4.2 Các phương pháp kỹ thuật kháng sinh đồ:
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán (Kirby-Bauer):
* Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại
kháng sinh ở mức độ khác nhau và được biểu hiện ở sự khác nhau vềđường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh có chứamột đậm độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với kháng sinh
* Mục đích: tìm hiểu về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây
bệnh giúp cho lâm sàng phương hướng điều trị đúng với những kháng sinhđặc hiệu, góp phần đánh giá tình hình kháng thuốc của vi khuẩn
* Các bước thực hiện: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.
Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn:
(Minimum Inhibitory Concentration: MIC)
* Nguyên lý: nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi
đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vikhuẩn và bằng mắt thường có thể xác định được điều này
* Mục đích: kỹ thuật nhằm xác định chính xác nồng độ kháng sinh nhỏ
nhất ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi
cấy, từ đó xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
* Các bước thực hiện: theo thường quy của Tổ chức Y tế Thế giới.
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu:
- Nhóm chứng: 350 mẫu bệnh phẩm là dịch họng mũi lấy ở 350 trẻ khỏe
mạnh dưới 5 tuổi sống trên địa bàn 2 xã Vĩnh Thạnh và Vĩnh Phương củathành phố Nha Trang
- Nhóm bệnh: 441 mẫu bệnh phẩm là dịch họng mũi lấy ở 441 bệnh nhi
dưới 5 tuổi mắc nhiễm trùng hô hấp cấp tính tại khoa Nhi Bệnh viện Đakhoa tỉnh Khánh hòa
Trang 102.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả cắt
ngang có phân tích
2.2.2 Nội dung các bước nghiên cứu:
2.2.2.1 Đối với 350 mẫu bệnh phẩm lấy từ trẻ dưới 5 tuổi khỏe mạnh:
- Sử dụng phương pháp PCR và PCR định lượng xác định vi khuẩn cótrong bệnh phẩm
2.2.2.2 Đối với 441 mẫu bệnh phẩm lấy từ trẻ dưới 5 tuổi mắc NTHHC:
- Nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn
- Sử dụng phương pháp PCR và PCR định lượng xác định căn nguyên vikhuẩn
- Xác định mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh bằng phương phápnồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
- Sử dụng phương pháp PCR xác định gen kháng thuốc của S pneumoniae
và H influenzae.
- Sử dụng phương pháp Multiplex RT-PCR và Heminested PCR xác địnhcăn nguyên vi rút
2.2.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
2.2.3.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm họng mũi: theo thường qui của Tổ chức Y
tế Thế giới
2.2.3.2 Nuôi cấy, phân lập và xác định căn nguyên vi khuẩn: theo thường
qui của Tổ chức Y tế Thế giới và Viện Y học Nhiệt đới thuộc Đại họcNagasaki - Nhật Bản
2.2.3.3 Xác định S pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis bằng
phương pháp PCR và PCR định lượng
* Mục tiêu của phương pháp: thiết lập một xét nghiệm nhanh, nhậy và
có độ đặc hiệu cao để phát hiện và định lượng S pneumoniae, H.
influenzae và M catarrhalis ở bệnh phẩm họng mũi trẻ khoẻ mạnh và
trẻ dưới 5 tuổi mắc NKHHC dựa vào hệ thống PCR; xét nghiệm này sẽđược ứng dụng trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi khuẩn gâybệnh đường hô hấp ở Việt Nam Phản ứng PCR đa mồi để phát hiện ba
loại vi khuẩn S pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis và ba phản
ứng PCR định lượng dựa trên nguyên lý Syber Green để định lượngtừng loại vi khuẩn có trong bệnh phẩm họng mũi
* Các chủng vi khuẩn:Các chủng vi khuẩn thường hiện diện ở đường
hô hấp được thu thập và làm mẫu tham chiếu để phân tích tính đặchiệu
* Các mẫu bệnh phẩm họng mũi:
350 mẫu bệnh phẩm họng mũi lấy ở trẻ dưới 5 tuổi khoẻ mạnhthuộc 2 xã Vĩnh Thạnh, Vĩnh Phương của thành phố Nha Trang và 441mẫu bệnh phẩm họng mũi của bệnh nhi dưới 5 tuổi mắc NKHHC tạikhoa Nhi Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hoà Bệnh phẩm được lấy
Trang 11theo thường quy của WHO Bệnh phẩm ngay sau khi lấy được cất trong1ml môi trường STTG (sữa tách kem, đậu nành tryptone, glycerol,glucose) và được lưu trữ ở -800C cho đến khi làm xét nghiệm
* Tách DNA: theo quy trình kit thương mại QIA mini kit DNA của các
chủng vi khuẩn tham chiếu cũng được tách bằng kít QIAamp Sau khitách, DNA của vi khuẩn được xác định nồng độ và độ sạch bằng máy
đo quang của hãng Eppendorf AG của Đức Các mẫu DNA sau khi táchđược bảo quản ở -300C
* Thiết kế mồi:
Sử dụng 3 bộ mồi cho cả phản ứng PCR đa mồi và PCR định
lượng; trong đó, có 2 bộ mồi để phát hiện S pneumoniae và M.
catarrhalis được công bố bởi các nghiên cứu trước và một bộ mồi để
phát hiện H influenzae do phòng thí nghiệm chúng tôi thiết kế Tất cả
được liên kết, so sánh độ tương đồng bằng phần mềm MEGA 4.0 vàtrình tự primer mới được lựa chọn sao cho có ít nhất 1-4 cặp bases đầu
tiên ở đầu 3’ đặc hiệu cho H influenzae Bộ primer sau đó được kiểm
chứng lại bằng BLAST để xác định độ đặc hiệu
* Thực hiện PCR và PCR định lượng xác định S pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis:
Trước tiên thực hiện phản ứng PCR đa mồi để phát hiện đồng
thời S pneumoniae, H influenzae và M catarrhalis Những mẫu bệnh
phẩm âm tính với PCR đa mồi, được thẩm định lại bằng PCR đơn mồi.Đối với những mẫu bệnh phẩm dương tính được tiến hành xét
nghiệm PCR định lượng để xác định số lượng ba loại vi khuẩn S.
pneumoniae, H influenzae, M catarrhalis.
* Nhận định kết quả: đối với nhóm chứng các mẫu bệnh phẩm có vi
khuẩn được coi là dương tính; nhóm bệnh các mẫu bệnh phẩm có vikhuẩn ≥ 107 CFU/1ml được coi là dương tính
2.2.3.4 Phương pháp multiplex RT-PCR và heminested PCR xác định căn nguyên vi rút:
Bệnh phẩm dịch họng mũi được thu thập tại thời điểm trẻ nhập viện
và cho ngay vào ống đựng môi trường vận chuyển Mẫu bệnh phẩm đượcbảo quản tại -800C cho đến khi làm xét nghiệm Tách chiết ARN trong các
Trang 12mẫu bệnh phẩm thực hiện bằng bộ kit QIAamp Viral ARN minikit(QIAGEN Inc., Valencia, CA)
Sử dụng 4 phản ứng multiplex PCR để phát hiện 13 vi rút gây bệnh
đường hô hấp có trong bệnh phẩm: Rhinovirus, vi rút hợp bào đường hô hấp, vi rút cúm A và B, vi rút á cúm týp 1-4, Humanmetapneumovirus,
Adenovirus, Bocavirus, Coronavirus 229E & OC 43
* Tách chiết ARN: theo quy trình kit thương mại QIAgen (CHLB Đức).
* Phương pháp Multiplex RT-PCR:
* Mồi: Tùy thuộc vào các phản ứng PCR để sử dụng mồi.
* Phản ứng PCR: 940C/5phút, 940C/30giây, 560C/30giây, 720C/90giây X
35 chu kỳ, 720C/5phút; giữ ở 40C
* Điện di sản phẩm PCR:
Điện di sản phẩm PCR trên thạch 2% có ethidium bromide (10
l/100ml dung dịch agarose), hiệu điện thế 100V trong 30 phút Sử dụngthang trọng lượng phân tử 1000 bp Các băng DNA có thể quan sát vàđược chụp ảnh dưới tia UV
* Nhận định kết quả:
Rhinovirus – 254 bp
Adenovirus – 193 bp
* Kết quả chỉ đọc được khi:
Chứng dương là vi rút cúm, Rhinovirus, Adenovirus, RSV
Chứng âm phản ứng, chứng âm tách chiết: âm tính
Âm tính: xuất hiện sản phẩm PCR ở vị trí không đặc hiệu hoặckhông có sự hiện diện sản phẩm
Dương tính: sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài bằng chứng dương
♦ Phương pháp Heminested PCR:
* Mồi: Tùy thuộc vào các phản ứng PCR để sử dụng mồi.
* Phản ứng PCR: 940C/5phút, 940C/30giây, 550C/30giây, 720C/90giây X
30 chu kỳ, 720C/5phút; giữ ở 40C
* Nhận định kết quả:
- Vi rút cúm A – 151 bp
- Vi rút hợp bào đường hô hấp – 201bp
- Những mẫu dương tính với cả 2 lần chạy PCR được coi là dương tính
2.3.5.Phương pháp xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC):
- Mục đích: kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ
nhất của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi
khuẩn trong môi trường nuôi cấy
- Nguyên lý: nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi
đạt đến một nồng độ nhất định sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn
và bằng mắt thường có thể xác định được điều này
Trang 13- Chủng vi khuẩn cần xác định MIC:
152 chủng S pneumoniae và 104 chủng H influenzae đã được định danh và thuần khiết Chọn ngẫu nhiên 89 chủng S pneumoniae và 37 chủng H influenzae làm thử nghiệm MIC và phương pháp PCR xác định
gen kháng thuốc
- Các bước tiến hành: theo thường quy của tổ chức Y tế Thế giới.
- Đọc kết quả: đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh
thấp nhất Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vikhuẩn bị ức chế phát triển Kết quả MIC được so sánh với nồng độ ranhgiới kháng sinh, để phân biệt thành 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mứctrung gian
2.4 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
Kết quả nghiên cứu, được thu thập và xử lý theo phương pháp thống
kê y học, sử dụng phần mềm SPSS 16.0, Microsoft Office Excel 2009
Thuật toán thống kê được sử dụng trong nghiên cứu để tính tỷ lệ %,
Chi-square test, Fisher ′ s exact test được sử dụng để kiểm định mối liên quan
giữa các biến số định tính với mức ý nghĩa thống kê 95% (p<0,05) Kếtquả được trình bày dưới dạng các bảng số liệu và biểu đồ
2.5 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu:
Nghiên cứu được Hội đồng đạo đức Viện Vệ sinh Dịch tễ thông qua
và được thực hiện theo đúng nguyên tắc và chuẩn mực đạo đức trong Yhọc Gia đình các đối tượng được giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu
và đồng ý tham gia nghiên cứu Các thông tin riêng tư của đối tượng đượcđảm bảo giữ bí mật tuyệt đối Các xét nghiệm từ bệnh phẩm của các đốitượng tham gia nghiên cứu được hỗ trợ hoàn toàn kinh phí Đối tượngđược tư vấn, chăm sóc, điều trị như những bệnh nhi khác, kết quả xétnghiệm được dùng cho chẩn đoán, phòng bệnh và điều trị
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền một số căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
B ng 3.1 K t qu xác ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: định giới hạn nền của S pneumoniae: nh gi i h n n n c a S pneumoniae: ới hạn nền của S pneumoniae: ạn nền của S pneumoniae: ền của S pneumoniae: ủa S pneumoniae:
Nhóm trẻ
Sốlượng(n)
Ở nồng độ 105 CFU/1ml bệnh phẩm tỷ lệ S pneumoniae phân lập
được giữa 3 nhóm trẻ khác biệt không có ý nghĩa thông kê với p > 0,05 Ởnồng độ 107 CFU/1ml bệnh phẩm tỷ lệ S pneumoniae phân lập được
Trang 14giữa 3 nhóm trẻ khác biệt có ý nghĩa thông kê với p < 0,05 Trong đó, sự
chênh lệch về tỷ lệ S pneumoniae phân lập giữa nhóm viêm phổi có X
quang (+) với nhóm khỏe mạnh là 4,8 lần; giữa nhóm viêm phế quản vớinhóm khỏe mạnh là 1,2 lần
B ng 3.2 K t qu xác ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: định giới hạn nền của S pneumoniae: nh gi i h n n n c a H influenzae: ới hạn nền của S pneumoniae: ạn nền của S pneumoniae: ền của S pneumoniae: ủa S pneumoniae:
Ở nồng độ 105 và 106 CFU/1ml bệnh phẩm tỷ lệ H influenzae
phân lập được giữa 3 nhóm trẻ khác biệt không có ý nghĩa thông kê với p
> 0,05 Ở nồng độ 107 CFU/1ml bệnh phẩm tỷ lệ H influenzae phân lập
được giữa 3 nhóm trẻ khác biệt có ý nghĩa thông kê với p < 0,05 Trong
đó, sự chênh lệch về tỷ lệ H influenzae phân lập giữa nhóm viêm phế quản
với nhóm khỏe mạnh là 2,1 lần
3.2 Kết quả xác định căn nguyên gây NTHHC ở trẻ dưới 5 tuổi
3.2.1 Kết quả xác định căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi
3.2.1.1 Kết quả xác định vi khuẩn ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi:
B ng 3.4 K t qu xác ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: định giới hạn nền của S pneumoniae: nh các lo i vi khu n tr kho m nh d ài vi khuẩn ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ẩn ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ạn nền của S pneumoniae: ưới hạn nền của S pneumoniae: i 5 tu i: ổi:
Loài vi khuẩn
Âm tính Dương tính
Tổng cộng
Số lượng(n)
Tỷ lệ(%)
Số lượng(n)
Tỷ lệ(%)
Tổng số 350 mẫu bệnh phẩm họng mũi ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi
xác định được tỷ lệ các loài vi khuẩn: S pneumoniae là 50,3%, H.
influenzae là 31,4% và M catarrhalis là 58,0%
3.2.1.2 Kết quả xác định căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở trẻ dưới 5 tuổi:
B ng 3.9 T l c n nguyên vi khu n gây NKHHC 441 b nh ph m h ng m i ảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn nền của S pneumoniae: ỷ lệ căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở 441 bệnh phẩm họng mũi ệ căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở 441 bệnh phẩm họng mũi ăn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở 441 bệnh phẩm họng mũi ẩn ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ệ căn nguyên vi khuẩn gây NKHHC ở 441 bệnh phẩm họng mũi ẩn ở trẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ọng mũi ũi
c a tr d ủa S pneumoniae: ẻ khoẻ mạnh dưới 5 tuổi: ưới hạn nền của S pneumoniae: i 5 tu i: ổi:
