tóm tắt luận án tiến sĩ xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu, bệnh cũng như các tính trạng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường và các tính trạng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

- -

NGUYỄN THỊ LAN HOA

ÁC ĐỊNH CH THỊ PH N T LI N T G N HÁNG BỆNH ANH L N C Y BÔNG C

Chuyên ngành D

TÓM TẮT LUẬN ÁN TI N SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2013

T ườ Đại h c Nông nghiệp Hà Nội

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễ Vă V ết

Viện Khoa h c Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Thị Ng c Huệ

M Đ U

1 Tí ấp ế ủa đ

Bông vải là một cây trồng lấy sợi tự nhiên và cây lấy dầu hàng đầu và quan trọng nhất thế giới được trồng tập trung tại nhiều khu vực ở hơn 80 nước trên thế giới, từ Châu Phi, Châu Mỹ, Châu Á, chiếm 2,5% diện tích canh tác hàng năm tính trên toàn cầu và đạt sản lượng trên 25 triệu tấn Ngành trồng bông ở các nước luôn phải đối mặt với thách thức là bệnh dịch hại bông

rong các loại bệnh hại bông, bệnh anh l n (cotton blue disease - CBD) là

loại bệnh gây hại quan trọng ở cây bông vải và được lan truyền bằng vector truyền

bệnh là rệp bông Aphis gossypii Ở nước ta, bệnh anh l n có thể làm giảm 10-15%

năng suất bông trung bình cả năm, có khi lên đến 30% Đây là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn cho việc mở rộng diện tích và nâng cao năng suất của ngành bông Việt Nam

Con đường lan truyền của bệnh trong tự nhiên nhờ côn tr ng môi giới là rệp

bông (Aphis gossipii) mà việc phòng trừ, tiêu diệt là khó thực hiện và gây tổn hại môi

trường Vì thế, sử dụng giống kháng là lựa chọn tối ưu nhất trong công tác quản lý bệnh cũng như giải quyết các vấn đề liên quan đến môi trường

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu, bệnh cũng như các tính trạng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường và các tính trạng về năng suất, chất lượng đã được định vị trên bản đồ

hệ gen của cây bông vải Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite - SSR) cho cây bông là một thế hệ chỉ thị mới, thân thiện với người sử dụng và cũng dễ dàng áp dụng giữa các quần thể lập bản đồ khác nhau, được sử dụng hiệu quả trong chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử Đây là công cụ hữu hiệu trong chiến lược cải tiến giống bông vải của nhiều quốc gia uy nhiên, đối với gen kháng bệnh anh l n ở bông, cho đến nay vẫn còn rất ít các công trình nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh, cũng như lập bản đồ phân tử gen kháng phục vụ cho công tác chọn tạo giống bông vải kháng bệnh anh l n

Mặc d đa phần các giống bông đang được trồng lấy sợi trên thế giới là bông

tứ bội, nhưng trong các ngân hàng gen cây bông, bông cỏ lưỡng bội Châu Á G

arboreum được đánh giá là nguồn gen vật liệu mang nhiều đặc tính kháng sâu bệnh,

chống chịu với điều kiện bất thuận (Qureshi và cs., 2004b; Adams và Palmer, 2003a) rong ngân hàng cây bông ở nước ta, giống bông cỏ Nghệ An là giống địa phương đã được đánh giá sơ bộ có khả năng kháng được bệnh anh l n ở Việt Nam Vì thế, công tác đánh giá chi tiết, nghiên cứu ác định cơ sở di truyền, lập bản đồ định vị gen kháng góp phần thúc đẩy việc khai thác, sử dụng các nguồn gen này trong các chương trình chọn giống bông kháng bệnh anh l n ở nước ta

Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản uất bông, nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học trợ giúp cho công tác chọn tạo giống bông kháng bệnh, chúng tôi đã tiến hành đề

tài "

a oa ễ ủa đ

Việc đánh giá đa dạng di truyền, thiết lập bản đồ gen kháng và ác định chỉ thị gen kháng bệnh anh l n ở cây bông cỏ Nghệ An là một kết quả mới trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen cây bông nói chung và di truyền tính kháng bệnh anh l n nói riêng ở giống bông cỏ

Việc ác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh anh l n ở giống bông cỏ Nghệ An không chỉ nhằm ác định nguồn gen mà còn mở ra khả năng khai thác ứng dụng trong chọn tạo giống bông kháng bệnh anh l n ở nước ta

3 Mụ ê ủa đ

Đề tài “ kế ge k g bệ xa ù ở y bô g

" được chúng tôi thực hiện nhằm tìm hiểu cơ sở di truyền tính kháng bệnh anh l n

ở cây bông ở mức phân tử, cung cấp cơ sở khoa học cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, góp phần tăng hiệu quả của công tác phòng trừ bệnh trong sản uất bông ở nước ta

Những mục tiêu cụ thể của đề tài như sau:

- Xác định được di truyền tính kháng bệnh anh l n ở cây bông cỏ

- Xác định được chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh anh l n ở cây bông cỏ

4 N ữ đó óp mớ ủa l ậ á

- Lần đầu tiên ở Việt Nam, đề tài đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 14 nhóm liên kết tương ứng với 13 nhiễm sắc thể trên hệ gen A ở cây bông cỏ Châu Á

G arboreum dựa trên chỉ thị phân tử SSR

- Đây là công trình đầu tiên ở nước ta ác định được vị trí gen kháng bệnh anh l n trên bản đồ di truyền ở dòng bông cỏ địa phương XL002 có nguồn gốc thu thập tại Nghệ An

- Đây cũng là công trình đầu tiên ác định được các chỉ thị SSR liên kết với gen kháng bệnh anh l n trên cây bông cỏ, trong đó có 2 chỉ thị liên kết ở hai phía của gen kháng có thể sử dụng trong chọn tạo giống kháng bệnh anh l n với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

5 Đ ượ p ạm ê

- Đối tượng nghiên cứu gồm:

+ Các dòng/giống bông cỏ có nguồn gốc thu thập từ tập đoàn giống bông có nguồn gốc địa lý và các đặc điểm nông sinh học, khả năng chống chịu khác nhau

+ Các cặp mồi SSR đã được định vị trên khắp hệ gen cây bông được chọn lọc

từ các bản đồ di truyền của các loài bông đã được công bố

+ Bệnh anh l n hại bông, liên quan đến côn tr ng môi giới truyền bệnh là rệp bông

- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm, hệ thống nhà lưới, nhà kính của Viện i truyền Nông nghiệp, à Nội và Viện nghiên cứu Bông NN Nha ố, Ninh huận

CHƯƠNG I

T NG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ S HOA HỌC C A Đ TÀI

1.1 C Y BÔNG VÀ NGHI N CỨU ĐA DẠNG DI TRUY N

Cây bông là cây trồng lâu năm được trồng như cây trồng hàng năm Cây bông

thuộc họ Malvaceae, chi Gossypium Chi Gossypium có nhiều loài, rất đa dạng và

được phân loài dựa trên phân bố địa lý, đặc điểm hình thái và các nghiên cứu giải phẫu tế bào học iện nay, chi bông đã được phát hiện có 49 loài và thêm một số loài mới được phát hiện

uy nhiên, bông trồng trọt để lấy sợi chỉ có 4 loài: bao gồm hai dạng nhị bội hệ

gen A (2n=2x=26) là G herbaceum (A1); G arboreum (A2) và hai dạng song lưỡng bội khác nguồn A (2n=4 =52) là G hirsutum (AD1) và G.barbadense (AD2) (Guo

và cs., 2007; Iqbal và cs., 2001; Mei và cs., 2004)

Cho đến nay, trong số các chỉ thị phân tử, SSR đã được ứng dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông (Frelichowski và cs., 2006; Han và cs., 2006; Kalivas và cs., 2011; Kantarzi và cs., 2006; Liu và cs., 2000b; Nguyen và cs., 2004; Park và cs., 2005; Wu và cs., 2007; Zhang và cs., 2011) và nhiều ứng dụng đa dạng trong nghiên cứu di truyền thực vật và chọn giống MAS (Kalivas và cs., 2011; Zhang và cs., 2008) hần lớn các công trình phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR đều tập trung nghiên cứu đa dạng dưới loài giữa các giống bông tứ bội phổ

biến nhất là G hirsutum (A )2 hoặc nghiên cứu đa dạng trong/giữa các loài bông tứ bội thuộc hai loài bông G hirsutum (AD)2 và G barbadense (A )1, là hai loại bông chiếm

tỷ trọng lớn trên toàn thế giới ết quả nghiên cứu đa dạng di truyền cho thấy vật liệu bông trong các chương trình chọn tạo giống bông tại y lạp, Úc, Mỹ, Braxil có nền di truyền hẹp (Bertini và cs., 2006; Chen và Du, 2006; Gutierrez và cs., 2002; Kalivas và cs.,2011) Nguồn gen bông được sử dụng trong các chương trình giống của các nước cũng đang ngày càng bị thu hẹp về đa dạng di truyền (Gutierrez và cs., 2002)

Đứng trước sự suy giảm đa dạng di truyền trong các chương trình giống bông tứ bội, nguồn gen bông nhị bội với nền di truyền rộng và mang nhiều đặc tính có triển vọng về chất lượng ơ, năng suất, khả năng chống chịu với sâu bệnh và các điều kiện sống bất lợi, gần đây bắt đầu nhận được quan tâm từ các chương trình nghiên cứu genome và chương trình giống của nhiều quốc gia (Chen và cs., 2007) Những thông tin cụ thể hơn về đa dạng và mối quan hệ di truyền trong các loài bông nhị bội có thể cung cấp thông tin quan trọng về khả năng sử dụng những nguồn gen di truyền này

cho các chương trình cải tiến giống Nhóm các loài bông có hệ gen A, G arboreum

và G herbaceum, hai loài bông trồng trọt còn tồn tại cho đến ngày nay có quan hệ di

truyền gần nhất với tổ tiên hệ gen A trong bông tứ bội là một nguồn đa dạng di truyền cho các chương trình phát triển cây bông tứ bội (Chen và cs., 2007)

Cho đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền bông nhị bội có

hệ gen A được công bố Công trình nghiên cứu đa dạng di truyền duy nhất về bông cỏ

Châu Á G arboreum được công bố là của nhóm tác giả rung Quốc Nghiên cứu điều tra một cách hệ thống cho thấy các alen SSR thu được trên G arboreum khác

biệt so với ở bông tứ bội ết quả đánh giá cho thấy hệ số biến động di truyền mức

phân tử ở bông cỏ G arboreum ở rung Quốc cao hơn nghiên cứu trước đó trên tập

đoàn bông lưu giữ tại Mỹ (Desai và cs., 2006; Hirut và cs., 2007), và cao hơn ở bông

G hirsutum, đặc biệt so với các nhóm giống triển vọng (Hirut và cs., 2007)

1 NHỮNG NGHI N CỨU V BỆNH ANH L N HẠI BÔNG

Bệnh anh l n có rất nhiều tên gọi khác nhau ở các quốc gia phát hiện ra nó như bệnh anh lá, bệnh cuốn lá, bệnh khảm, bệnh khảm gân uy nhiều tên gọi, nhưng triệu chứng mô tả bệnh tại các v ng đều thống nhất Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã khẳng định bệnh anh l n được truyền trong tự nhiên nhờ môi giới

duy nhất là rệp bông (Aphis gossypii Glover) (Cauquil, 1977)theo phương thức bền

vững (Costa, 1957; Kennedy, 1950; Kennedy và cs., 1962; Sarindu và Siddhipongse, 1980a; Tarr, 1964)nhưng không truyền từ rệp mẹ mang virut sang rệp con (Nguyễn

hị hanh Bình, 1999) Các dạng rệp trưởng thành có cánh, trưởng thành không cánh, rệp non ở những tuổi cuối đều có thể truyền được bệnh ầu hết các công trình công bố đều kết luận: bệnh cũng có thể lây truyền nhân tạo qua con đường ghép cây (Dyck, 1977; Escober và cs., 1963), nhưng không lây truyền qua dịch cây, đất, tàn dư cây bông và hạt giống ( rần hế Lâm, 2007; Brown, 1992) Những đặc điểm trên của vector rệp truyền bệnh anh l n khiến cho bệnh nhanh chóng lây lan và khó kiểm soát

ại một số nước trên thế giới, bệnh anh l n đã được công nhận là do virut gây

ra dựa vào các triệu chứng và một số đặc điểm về con đường lan truyền của bệnh (Hillocks, 1992; Watkins, 1981) Công trình của Correa và cs (2005) đã mô tả ở mức

độ phân tử một loại virut có liên quan đến bệnh anh l n hại bông ở Braxin và ác nhận

được một loại virut liên quan đến bệnh là một thành viên của chi Polerovirut thuộc họ

Luteoviridae, định danh là virut “l n oăn lá bông” – CLRDV (Cotton leafroll dwarf

virut), bác bỏ khả năng nó là một dạng tái tổ hợp được giả thuyết trước đó Các loại virut mới phân lập có liên quan đến các triệu chứng không điển hình của bệnh anh l n như lá hóa đỏ và úa mép lá có thể hình thành do tái tổ hợp ựa vào cách phân loại

bằng cây phát sinh họ virut Luteoviridae, nhóm tác giả cho rằng ba chủng (isolates) virut mới phân lập này đại diện cho các chủng virut mới thuộc chi Polerovirut

Nghiên cứu gần đây nhất của iste´fano và cs (2010) lần đầu tiên đã giải mã toàn bộ hệ gen gồm chuỗi ARN mạch đơn của virut liên quan đến bệnh anh l n được phân lập tại Ac-hen-ti-na hân loại dựa trên so sánh trình tự cho thấy virut này là một

nhánh của chủng Polerovirut Những phân tích so sánh sự tương đồng về trình tự và

cây phân loại phát sinh cho thấy chủng virut này đã được tạm định danh là CLDV

trước đó tại Bra in là một chi mới của một chủng virut mới của chi Polerovirut

Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh anh l n ở Việt Nam cũng cho rằng virut gây bệnh có thể là virut hình cầu có kích thước nhỏ dưới 30mm, hoặc thuộc nhóm

Luteovirut (phỏng đoán qua phương thức lan truyền theo phương thức bền vững và

không truyền cơ học qua dịch cây)

ừ năm 1995, với những cây bông có triệu chứng bệnh anh l n điển hình, Vũ riệu Mân và cs đã d ng phương pháp cắt lát cực mỏng và kính hiển vi điện tử để chuẩn đoán tác nhân gây bệnh Các tác giả đã tìm thấy virut trong tế bào lá bệnh và cho rằng virut này thuộc nhóm Potyvirus (Vũ riệu Mân và cs., 1995) Tuy nhiên, cho đến nay nghiên cứu loại virut gây bệnh này vẫn chưa được định danh và cơ chế

kháng bệnh anh l n ở bông vẫn chưa được làm sáng tỏ

rên thế giới, tính kháng bệnh anh l n được ác định là di truyền đơn gen trội

ở một số giống thuộc loài G.hirsutum và có nguồn gốc từ loài G arboreum

Ở nước ta, Viện nghiên cứu Bông và NN Nha ố đã ác định được một số đầu dòng bông cỏ Nghệ An có khả năng kháng hoàn toàn đối với bệnh anh l n Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng bệnh anh l n của các dòng bông cỏ Nghệ An bước đầu cho thấy tính kháng bệnh anh l n được quy định bởi đơn gen trội (Đặng Minh âm, 2006) Đây là nguồn gen kháng bệnh quý cần được đánh giá để khai thác sử dụng

1.3 NGHI N CỨU LẬP BẢN ĐỒ DI TRUY N VÀ TI M NĂNG ỨNG DỤNG

TRONG CẢI TI N GIỐNG C Y BÔNG GOSSYPIUM L

Bản đồ di truyền hiện đại được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các loại chỉ thị RFL , ALF , RA , S S, SSR ) Chỉ thị SSRs được sử dụng để lập bản đồ di truyền cũng như bản đồ gen và Q Ls trên bông o mức độ đa hình A N trong loài bông thấp, bản đồ liên kết cây bông được lập với mật độ chỉ thị cao chỉ đối với các quần thể F2 và quần thể lai trở lại khác loài giữa G hirsutum và G

barbadense (Guo và cs., 2007; Lacape và cs., 2005; Rong và cs., 2004)giữa G hirsutum x G tomentosum (Waghmare và cs., 2005a; Waghmare và cs., 2005b)và giữa

G mustelinum x G hirsutum (Chen, 2007) Bản đồ tham khảo đã được thiết lập trên

thông tin của 28 bản đồ bông đã được công bố và được chia sẻ toàn cầu

uy nhiên, cho đến nay, bản đồ liên kết duy nhất được ây dựng trên quần thể

F2 của cây bông cỏ G arboreum dựa trên các chỉ thị SSR mới được công bố (Ma và

cs., 2008) ết quả chỉ thu được 267 chỉ thị cho đa hình và đã định vị được các locut SSR này phân bố thành 13 nhóm liên kết với tổng chiều dài lập bản đồ là 2.508cM, khoảng cách giữa các chỉ thị trung bình đạt 9,4cM, khoảng cách lớn nhất giữa hai chỉ thị là 40cM trên nhóm 11 và gần nhất là 0,3cM trên nhóm 1

Các bản đồ gen và Q Ls ở bông phần lớn liên quan đến năng suất và thành phần năng suất, chất lượng ơ, kiểu dạng cây, ngày nở hoa và tính kháng với các bệnh như bệnh giác ban và héo rũ, kháng tuyến tr ng, và khả năng phục hồi bất dục Bản đồ gen kháng bệnh anh l n đầu tiên đã được công bố vào năm 2010 với các chỉ thị SN và SSR liên kết với khoảng cách từ 0,5-5,4cM

Cho đến nay, nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống MAS vẫn đang ở giai đoạn mới bắt đầu, và đã được ứng dụng trong cải tiến tính trạng chất lượng ơ và một số bệnh tuyến tr ng

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU

1 VẬT LIỆU NGHI N CỨU

rong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các vật liệu sau để nghiên cứu:

- Giống bông:

+ 31 dòng/giống bông cỏ địa phương và nhập nội được lưu giữ trong tập đoàn bông Việt Nam Các dòng/giống bông cỏ châu Á này có nguồn gốc từ các tỉnh thành trong nước và các ngân hàng gen bông của Ấn Độ và Liên Xô cũ (Bảng 2.1)

+ Giống bông 16-2 là giống nhiễm bệnh cao được sử dụng làm đối chứng nhiễm trong các thí nghiệm trong nhà lưới

- Nguồn bệnh:

+ Nguồn bệnh là những cây bông bị bệnh anh l n thu thập tại Ninh huận với triệu chứng điển hình

+ Véc tơ truyền bệnh là rệp bông được nuôi trên cây bông nhiễm bệnh

- Các vật liệu hóa chất d ng trong nghiên cứu:

+ Các cặp mồi SSR được thiết kế cho bông được chọn lọc từ 8915 cặp mồi đã được lập bản đồ trên hệ genome cây bông tại Cotton Marker atabase: http://www cottonmarker.org; Cotton Genome atabase: http://cottondb.org; các bản đồ liên kết genome cây bông đã công bố

+ Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử

+ huốc trừ sâu và phân bón vi sinh, N, P, K

NỘI DUNG NGHI N CỨU

- Đánh giá nguồn vật liệu tạo quần thể lập bản đồ

- Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng bệnh anh l n thông qua đánh giá kiểu hình tính kháng của quần thể F2

- Nghiên cứu ây dựng bản đồ liên kết ở cây bông cỏ sử dụng chỉ thị phân tử SSR

- Lập bản đồ gen kháng bệnh anh l n và ác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng

3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHI N CỨU

3.1 T ờ a ê

Các thí nghiệm đánh giá tính kháng được tiến hành trong vụ mưa và vụ khô các năm 2009-2010 hí nghiệm nghiên cứu sinh học phân tử được thực hiện từ 2009-2011

3 Địa đ ểm ê

- Các nghiên cứu đánh giá tính kháng bệnh của đề tài được thực hiện tại hệ thống nhà lưới chống rầy/rệp của Viện Nghiên cứu Bông và hát triển NN Nha ố

- Các thí nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử được thực hiện tại hòng

Sinh học hân tử, Viện i truyền Nông nghiệp

4 PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU

4.1 P ươ p áp đá á đa dạ d ủa á bô ỏ sử dụ các ỉ ị SSR

- A N tổng số được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp C AB

- hản ứng CR cho các cặp mồi SSR được tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler ổng dung dịch phản ứng là 15µl bao gồm 30ng A N tổng số, 0,15µM mồi, 0,2mM dNTPs, 1X dịch đệm CR, 2,5mM MgCl2 và 0,5 đơn vị aq TaKaRa Điều kiện phản ứng CR như sau: 950C - 7 phút; 40 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 2 phút; giữ mẫu ở 40C

- Điện di và phân tích số liệu: Sản phẩm CR được kiểm tra trên gel agarose 3,5% hoặc gel polyacrylamid không biến tính 8% tuỳ thuộc vào độ phân giải và kích thước của các alen với hiệu điện thế từ 100V-250V trong thời gian từ 2-3 giờ trong dung dịch đệm BE1X và được hiện băng bằng nhuộm Ethidium

- Sơ đồ hình cây được ây dựng dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1978), theo phương pháp U GMA bằng phần mềm popgene được biến đổi theo phương pháp ây dựng cây phân loại của YLI Version 3.5, các băng được ghi nhận theo mã hóa: có băng đánh số 1, không có băng đánh số 0

- hoảng cách di truyền giữa các cá thể được tính theo Nei (1978) : Số liệu

A N được phân tích tính toán theo phần mềm O GEN v.1.31 - ệ số đa dạng gen

hay giá trị thông tin đa hình giữa các chỉ thị (PIC, Polymorphism Information

Content) được tính theo Weir (1990)

4 P í d e q đị í á bệ xa lù ở bô

- hí nghiệm phân tích tính kháng bệnh của các giống trong tập đoàn được gieo trồng trong nhà lưới chống rầy và được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần lặp đánh giá từ 30-35/mẫu giống

- hí nghiệm lai tạo các quần thể F1, F2, BC1F1 được thực hiện và thu riêng hạt đối với từng cặp lai để thu hạt phục vụ cho công tác đánh giá bệnh

- hí nghiệm đánh giá bệnh được tiến hành đồng thời với các quần thể F1, F2,

BC1F1 trong nhà lưới, đánh giá từng cá thể con lai Các cá thể được bố trí ngẫu nhiên trong từng lô thí nghiệm

+ hương pháp lây nhiễm và đánh giá bệnh anh l n trong điều kiện nhân tạo theo phương pháp của Nguyễn hị hanh Bình (1999) Lây nhiễm: Giai đoạn cây con 10-15 ngày tuổi, truyền bằng rệp mang mầm bệnh được lấy từ cây nhiễm chuẩn có các triệu chứng điển hình với mật độ 15-25 con/cây hun thuốc diệt rệp sau 48 giờ

+ Các chỉ số bệnh được theo dõi và đánh giá:

 hời gian ủ bệnh: hời gian từ lúc lây nhiễm bằng rệp đến lúc uất hiện bệnh

 hang điểm cấp bệnh: Đánh giá mức độ bệnh được ghi nhận sau 30-45 ngày lây nhiễm theo thang điểm 4 cấp của Cauquil Vaisayre (1971) và được mô tả chi tiết hơn bởi Junior và cs (2008)

- hân tích thống kê:

+ Đối với đánh giá tính kháng của các giống trong tập đoàn: ính tỷ lệ bệnh ( LB) theo phương pháp của (Vũ Đình Ninh, 1972) và chỉ số cấp bệnh trung bình (CBTB) tính theo Fang (2010):

( )

rong đó: A: ổng số cây bị bệnh a: Số cây bị bệnh ở mỗi cấp

B: ổng số cây nghiên cứu n: rị số cấp bệnh tương ứng với số cây a+ Đối với thí nghiệm ác định di truyền tính kháng ở quần thể F2 và BC1F1: kiểm định giả thuyết “phân bố chuẩn thực nghiệm ph hợp với giả thuyết lý thuyết” được thực hiện thông qua kiểm định χ2

- Xác định nhóm liên kết genome và khoảng cách di truyền giữa các chỉ thị bằng chỉ thị phân tử SSR và chương trình Mapmaker v.3.0

- Xác định vị trí gen kháng trên bản đồ nhiễm sắc thể và ác định khoảng cách

từ các chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh dựa trên quần thể phân ly F2, bản đồ liên kết di truyền và chương trình phần mềm Mapmaker/QTL v 1.1

CHƯƠNG III

T QUÁ NGHI N CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 ĐÁNH GIÁ NGUỒN VẬT LIỆU TẠO LẬP QU N THỂ LẬP BẢN ĐỒ

Mục đích của việc đánh giá vật liệu này nhằm: ác định chính ác tính kháng bệnh của nguồn gen kháng là dòng bông cỏ XL002 và chọn lọc được một số nguồn gen đối lập về tính kháng và có khoảng cách di truyền thích hợp sử dụng làm bố mẹ trong lai tạo quần thể lập bản đồ gen kháng bệnh anh l n ở cây bông cỏ

3.1.1 Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của các nguồn gen bông cỏ vật l ệ

a y bô g b bệ xa ù (b) ệ bô g

Hì 3.1 Ả ệp bô ạ ê bô l D16-2

Kết quả đánh giá một số các đặc điểm hình thái, chỉ tiêu về chất năng suất chất lượng ơ cho thấy các giống bông cỏ tuy không có lợi thế về các đặc điểm chất lượng và năng suất, nhưng những biến động về các chỉ tiêu hình thái và yếu tố cấu thành năng suất khá đa dạng và phong phú, đảm bảo cung cấp vật liệu cho nghiên cứu tiếp theo chọn cặp bố mẹ để tạo quần thể lập bản đồ gen kháng bệnh anh l n trong tập đoàn

3.1.2 Đá á í á bệ xa lù ở mộ s dò / bô ỏ ậ l ệ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 31 nguồn gen bông cỏ có nguồn gốc thu thập khác nhau từ các địa phương ở Việt Nam, Ấn Độ và Liên Xô cũ và dòng bông cỏ XL002 Đối chứng là giống bông luồi 16-2

hi bắt đầu tiến hành thí nghiệm lây nhiễm bằng thả rệp, tất cả các cây bông luồi 16-2 nuôi rệp đều biểu hiện nhiễm bệnh điển hình ở độ 3-4, mật độ rệp trên lá lớn có lá lên đến gần 100 con/lá (hình 3.1)

ết quả đánh giá bệnh sau lây nhiễm cho thấy tất cả các giống bông cỏ đều

nhiễm bệnh với tỷ lệ 100%, cấp bệnh trung bình thu được từ 3 lần lặp đều lớn từ 3,5 đến 4,0 Đa số các giống nhiễm đều ở cấp nhiễm cao nhất là cấp 4 Giống đối chứng D16-2 có tỷ lệ nhiễm 100% và cấp bệnh trung bình là 4,0, với thời gian ủ bệnh trung bình tính trên 3 lần lặp lại là 10,4 ngày ết quả này cho thấy, chỉ cần lây nhiễm 1 lần bằng rệp bông cũng đã cho kết quả là 100% mẫu nhiễm bệnh, và điều này chứng tỏ phương pháp lây nhiễm đạt hiệu quả đối với đánh giá bệnh ết quả đánh giá còn cho thấy dòng bông cỏ XL002 chỉ có 1 cây nhiễm bệnh ở cấp 1 trong cả 3 lần lặp, đạt cấp bệnh trung bình là 4 cấp bệnh là 4,0 (hình 3.2)

hí nghiệm lây nhiễm nhân tạo này chứng tỏ dòng XL002 là nguồn gen mang gen kháng bệnh hiệu quả

ỷ lệ bệnh (%)

3.1.3 á đị đa ì d , xá đị oả á d ủa á

đồ di truyền của cây bông tứ bội (song lưỡng bội) có bộ nhiễm sắc thể A đã được công bố và được thiết kế từ các thư viện genome cây bông A N tổng số được tách chiết bằng cách trộn lẫn lá non của 5-10 cá thể/mẫu giống được sử dụng để làm khuôn mẫu cho các phản ứng CR rong quá trình phân tích A N, tên các giống

bông được mã hóa bằng mã phần số trong mã số tập đoàn được ghi trong bảng 2.1 hảo sát 100 chỉ thị SSR trên 31 nguồn gen bông cỏ G arboreum nghiên cứu,

chúng tôi thu được 15 chỉ thị cho đa hình giữa các nguồn gen bông cỏ nghiên cứu, cho tổng số 55 băng đa hình trên 31 nguồn gen bông cỏ Số băng đa hình đạt trung bình 3,67 trong nghiên cứu này đạt cao hơn so với nghiên cứu của Gutiérrez (2002) với 60 cặp mồi đa hình cho khuyếch đại tại 69 locut với 139 băng đa hình và trung bình là 2 băng đa hình/locut Nhưng trung bình lại đạt thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Zhang và cs (2011) (4,37) và Liu và cs (2000b) (5 băng đa hình/chỉ thị) trên bông luồi G hirsutum uy nhiên, trung bình số băng đa hình của nghiên cứu này đạt cao hơn báo cáo của Liu (2006) về nghiên cứu đa dạng di truyền của 40 giống bông cỏ trong tập đoàn bông cỏ hạt nhân của rung Quốc với một số giống có nguồn gốc từ Nhật Bản và Mỹ Nghiên cứu của Liu đã thu được trung bình băng đa hình là 2,33 trên số biến thiên băng với từng chỉ thị từ 1-8 trên tổng số 75 chỉ thị đa hình, tuy nhiên biến động băng đa hình trên từng chỉ thị của nghiên cứu này lại thấp hơn so với nghiên cứu của Liu (2006) Sự biến động về số băng đa hình trung bình khác nhau giữa các nghiên cứu trên có thể là do nguồn vật liệu sử dụng đánh giá đa dạng khác nhau

Giá trị hệ số đa dạng gen ( IC) phản ánh rất chính ác mức độ đa hình giữa các kiểu gen d ng trong nghiên cứu, tính riêng rẽ đối với mỗi chỉ thị đa hình Ở nghiên cứu này, giá trị IC thay đổi từ 0,39 đến 0,67 với giá trị trung bình là 0,56, là giá trị tương đối cao so với nhiều nghiên cứu khác trên cây bông cũng như trên các đối tượng thực vật khác Giá trị IC đạt được tương đương với công trình của Lacape (2007) (trung bình 0,55) trên các đối tượng các loài bông khác nhau và cao hơn nghiên cứu của Liu (2000b) (trung bình 0,31) với c ng một phương pháp nghiên cứu Điều này cho thấy các mẫu giống sử dụng trong nghiên cứu có nền di truyền đủ đa dạng cho tập đoàn bông cỏ lưu giữ ở Việt Nam Công trình của Zhang và cs (2011)

đã lấy mốc giá trị IC>0,5 để ây dựng bộ chỉ SSR cho bông luồi tứ bội, như vậy công trình này có 10/15 chỉ thị không tr ng với 40 chỉ thị mà Zhang đã đề uất có giá trị IC>0,5 và có thể sử dụng để nghiên cứu tạo lập bộ chỉ thị cho nghiên cứu đa

dạng di truyền trên bông cỏ nước ta

tự lặp kép (lặp 2 loại trình tự như mồi BNL2656 và BNL3284), mức đa dạng alen thu được đều đạt thấp hơn so với mức trung bình là 3,67 alen/locut và IC là 0,56 uy nhiên, chiều dài trình tự lặp lại và số lần lặp dường như không có liên hệ với các chỉ số

đa dạng alen, chỉ thị NAU5074 có trình tự lặp 6 nucleotit nhưng vẫn cho đa hình số alen (4) và IC (0,65) cao tương đương với các trình tự lặp 2 nu khác Về độ dài của trình tự mồi, hầu hết các mồi có trình tự ngắn hơn hoặc bằng 20, d là chỉ thị lặp đơn hay lặp kép đều cho số đa hình lớn hơn trung bình, nhưng có 2 chỉ thị BNL2960 và STV002 là ngoại lệ vì chỉ khuyếch đại được 3 alen trên trung bình 3,67 alen

3.1.3.2 P í oả d ru ề ủ ố ụ vụ ặ , ạo quầ ể ậ ả ồ

ựa vào số liệu các băng A N ghi nhận được của mỗi giống bông với các chỉ thị đa hình, ma trận về mối quan hệ di truyền trong từng cặp giống được thiết lập

Số liệu A N được đưa vào ử lý trên chương trình opgene v.3.1 ết quả trên

ma trận cho thấy các giống trong nghiên cứu có tương đồng di truyền từng cặp biến động từ 0,03 đến 0,98 hoảng cách di truyền giữa các giống biến động khá lớn từ 0,14 đến 3,35 Sơ đồ hình cây ây dựng dựa trên phương pháp U GMA theo khoảng cách

di truyền của Nei s (1978) đã phân thành 2 nhóm rõ rệt, trong đó dòng XL002 c ng với hai giống Cỏ hú hánh (BC5) và giống 91-B-36 (BC78) tách thành một nhóm 28 dòng/giống còn lại đã cụm thành 1 nhóm lớn gồm 4 phân nhóm nhỏ ết quả phân tích

đa dạng di truyền của 31 dòng/giống bông Cỏ chứng tỏ nguồn vật liệu nghiên cứu có nền di truyền đa dạng thích hợp cho chọn lựa các cặp giống bố mẹ để ây dựng quần thể lập bản đồ Ngoài ra, các chỉ thị SSR trong nghiên cứu này có thể tiếp tục được sử dụng trong nghiên cứu đa hình giữa các cặp giống bông Cỏ bố mẹ (bảng 3.4, hình 3.5)