Đặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em năm 2009 tại bệnh viện nhi thụy điển

Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do RV chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào ñiều trị tại một số Bệnh Viện Nhi lớn của Việt Nam.. Trước yêu cầu ñòi h

VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHO¸ LUËN TèT NGHIÖP KHO¸ LUËN TèT NGHIÖP

ðề tài:

ðặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em

năm 2009 tại Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển

Người hướng dẫn :PGS.TS Lê Thị Luân Sinh viên thực hiện :Vũ Văn Chính

Lớp :06 - 05

Hà Nội - 05/2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thị Luân – Phó Giám ñốc Trung tâm Khoa học sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, ñã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện ñề tài và hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Mai Hương, cùng toàn thể các cán bộ công tác tại Phòng Kiểm ðịnh thuộc Trung tâm Nghiên cứu

và sản xuất Vắc xin và sinh phẩm y tế, các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học, Viện ðại học Mở Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ, dạy bảo trong suốt quá trình học tập và thực hiện ñề tài Cuối cùng em xin cảm ơn gia ñình và cảm ơn bạn bè ñã ñộng viên, khuyến khích, giúp ñỡ em trong những năm học qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Vũ Văn Chính

CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADRV Animal Derived Rotavirus

AVE Viral Elution Buffer – Dung dịch dùng ñể tách chiết RNA từ

DNA Axid Deoxyribonucleic

MMU 18006 Chủng Rota virus nguồn gốc từ khỉ Rhesus

RIT 4237 Chủng Rota virus 4237 gây bệnh ở bò

RT – PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction – Phản ứng

chuỗi khuếch ñại sao chép ngược

AW1, AW2 Wash buffer1, Wash buffer2 – Dung dịch nước rửa dùng ñể

tách chiết RNA từ mẫu phân

MỤC LỤC

_Toc262481555

ðẶT VẤN ðỀ 5

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN RV 8

1.1.1 Tình hình thế giới 8

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam 8

1.2 PHÂN LOẠI 9

1.3 HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC 9

1.3.1 Hình thái 9

1.3.2 Cấu trúc 10

1.4 PHÂN NHĨM VÀ CÁC TYP HUYẾT THANH 17

1.4.1 Phân nhĩm 17

1.4.2 Các typ huyết thanh 17

1.5 TÍNH CHẤT LÝ HĨA [4] 18

1.5.1 Sức đề kháng với nhiệt độ 18

1.5.2 Tính bền vững với pH 18

1.5.3 Các tính chất khác 18

1.6 SỰ NHÂN LÊN CỦA RV TRONG TẾ BÀO 19

1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH 22

1.7.1 Khả năng gây bệnh thực nghiệm 22

1.7.2 Khả năng gây bệnh cho người 23

1.8 CƠ CHẾ GÂY BỆNH 23

1.9 ðẶC ðIỂM LÂM SÀNG 24

1.10 DỊCH TỄ HỌC CĂN BỆNH TIÊU CHẢY CẤP 24

1.10.1 ðường lây truyền 24

1.10.2 Mùa bệnh 24

1.10.3 Lứa tuối mắc bệnh 25

1.10.4 Miễn dịch 25

1.11 SỰ PHÂN BỐ TỒN CẦU CÁC CHỦNG RV 26

1.11.1 Trên thế giới 26

1.11.2 Tại Việt Nam 29

1.12 CHẨN ðỐN RV 29

1.12.1 Chẩn đốn trực tiếp 29

1.12.2 Chẩn đốn gián tiếp 30

1.13 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN VACXIN PHỊNG BỆNH TCC 31

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 33

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Mẫu bệnh phẩm 33

2.1.3 Hố chất, dụng cụ, máy mĩc dùng cho chẩn đốn mẫu phân bằng

phương pháp ELISA 33

2.1.4 Nguyên vật liệu sử dụng cho tách chiết RNA từ mẫu phân 34

2.1.5 Nguyên vật liệu và hĩa chất sử dụng cho quá trình chạy PCR 34

2.1.6 Nguyên vật liệu và máy mĩc sử dụng cho chạy điện di 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Phương pháp miễn dịch - enzyme (ELISA) 38

2.2.2 Tách RNA từ mẫu phân theo Kit Qiagen 40

2.2.3 Các bước phản ứng chuỗi khuếch đại sao chép ngược xác định kiểu gen P và G 41

2.2.4 Chạy điện di và đọc kết quả 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 XÁC ðỊNH TỶ LỆ TCC DO RV VÀO BỆNH VIỆN NHI THỤY ðIỂN NĂM 2009 46

3.2 TỶ LỆ TRẺ MẮC TCC DO RV PHÂN BỐ THEO MÙA, GIỚI TÍNH, THEO NHĨM TUỔI TẠI BỆNH VIỆN NHI THUỴ ðIỂN NĂM 2009 48

3.2.1 Phân bố theo mùa 48

3.2.2 Phân bố theo giới tính 49

3.2.3 Phân bố theo nhĩm tuổi 51

3.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT PHÂN VÀ CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA TRẺ BỊ TIÊU CHẢY CẤP TẠI BỆNH VIỆN NHI THỤY ðIỂN NĂM 2009 52

3.3.1 Tính chất phân 52

3.3.2 Các triệu chứng mắc phải 53

3.4 ðẶC TÍNH CÁC CHỦNG RV GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN NHI THỤY ðIỂN NĂM 2009 54

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

Danh mục hình ảnh

Hình 1:Rotavirus ñược chụp dưới kính hiển vi ñiện tử [15] Error!

Bookmark not defined

Hình 2 : Cấu trúc chung của RV[11] Error! Bookmark not defined Hình 3 Ba lớp capsid của RV Error! Bookmark not defined

Hình 4 Capsid kép của virus (bên trái) và lớp capsid trong (bên phải)

Error! Bookmark not defined Hình 5 Lớp capsid trong của hạt virus Error! Bookmark not defined Hình 6 Lớp capsid ngoài Error! Bookmark not defined Hình 7 Genome và protein của RV Error! Bookmark not defined

Hình 8: giám sát sự phânbố của các chủng virusError! Bookmark not

defined

Hình 9 Sự nhân lên của RV trong tế bào Error! Bookmark not defined

Hình 10 Tỷ lệ mắc TTC do RV tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm 2009

Error! Bookmark not defined

Hình 11: Tỷ lệ trẻ em mắc bệnh TCC theo tháng tại Bệnh Viện Nhi Thụy

ðiển năm 2009 .Error! Bookmark not defined

Hình 12: Tỷ lệ mắc TTC do RV phân bố theo giới tính tại Bệnh Viện Nhi

Thụy ðiển năm 2009 Error! Bookmark not defined Hình 13 Tỷ lệ trẻ mắc TTC do RV ở các nhóm tuổiError! Bookmark not

defined

Hình 14: Tỷ lệ các kiểu gen P lưu hành tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm

2009 Error! Bookmark not defined

Kiểu gen G : G3 chiếm tỷ lệ nhiều nhất 77,04% Ngoài G4 không thấy xuất hiện thì các kiểu gen G tương ứng lần lượt tiếp theo là G1 chiếm 10,88%, G0 chiếm 7,55%, Gmix chiếm 2,42%, G9 chiếm 1,51% và cuối cùng là G2

chiếm 0,61% .Error! Bookmark not defined

Hình 15: Tỷ lệ các kiểu gen G lưu hành tại Bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm

2009 Error! Bookmark not defined

Hình 16:Tỷ lệ các chủng RV lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển năm

2009 Error! Bookmark not defined

Hình 17 Kết quả các kiểu gen P lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển

năm 2009 Error! Bookmark not defined

Hình 18 Kết quả các kiểu gen G lưu hành tại bệnh viện Nhi Thụy ðiển

năm 2009 Error! Bookmark not defined

ðẶT VẤN ðỀ

Rota virus (RV) ñược phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1973, là một virus RNA sợi ñơn, thuộc họ Reoviridae Tiêu chảy cấp do Rotavirus là bệnh nhiễm khuẩn dạ dày ruột cấp do virus Rota gây nên Bệnh rất thường gặp ở trẻ em và trẻ nhỏ, ñặc biệt là lứa tuổi từ 3 tháng ñến 2 tuổi Trong 5 năm ñầu ñời, hầu như không trẻ nào thoát khỏi tiêu chảy cấp do virus rota Bệnh cũng có thể xảy ra ở người lớn và thường nhẹ hơn.Trên thế giới hàng năm có khoảng trên 600 nghìn trẻ chết vì tiêu chảy do virus rota, chiếm 5%

số ca chết vì mọi nguyên nhân ở trẻ em dưới 5 tuổi [19]

Trong vòng 5 năm (1973-1978) RV ñã ñược công nhận là nguyên nhân phổ biến nhất thường gây bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên khắp thế giới, nhất là trẻ em dưới 5 tuổi Có khoảng 1/3 trường hợp tiêu chảy nặng do RV ở trẻ em phải nằm viện Theo ước tính của Tổ chức Y Tế Thế Giới, năm 1991 có 3,5 triệu trẻ em bị chết vì tiêu chảy [5]

Ở Mỹ, RV là nguyên nhân của 2,7 triệu ca viêm dạ dày ruột ở trẻ em hàng năm, trong số khoảng gần 60.000 ca vào bệnh viện có khoảng 37 ca

tử vong Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng ở các nước ôn ñới có tới 50% trường hợp tiêu chảy do RV [5]

Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do RV chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào ñiều trị tại một số Bệnh Viện Nhi lớn của Việt Nam Và là bệnh phổ biến ñứng thứ 2 sau nhiễm trùng hô hấp RV nhóm A gây ra hơn 90% tổng số ca nhiễm viêm dạ dày ruột do RV của người, nhóm B chủ yếu gây ra bệnh ở người lớn, nhóm C ít gặp hơn

Từ năm 1998-2003 các nhà khoa học ñã tiến hành nghiên cứu về RV tại 6 bệnh viện ở 4 thành phố của Việt Nam Hơn 10.000 trẻ em dưới 5 tuổi nhập viện do RV, 55% số mẫu có kết quả dương tính và tỷ lệ phát hiện RV thay ñổi từ 44% ñến 62% [18]

Tiêu chảy do RV ở trẻ em là một gánh nặng ñối với tất cả các nước trên Thế Giới Do tính chất nguy hiểm của bệnh nên hiện nay nhiều nước trên Thế Giới cũng như ở Việt Nam ñang ñặc biệt quan tâm và mở rộng các nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp ngăn chặn, làm giảm tỷ lệ mắc và tử vong do căn bệnh này

Năm 1998 vacxin rota shieed ñã ñược cấp phép sử dụng tại Mỹ nhưng năm 1999 ñã ngừng sử dụng do có thể tăng nguy cơ lồng ruột ở trẻ

Sự lan rộng của các typ huyết thanh phức tạp khác nhau của RV ñã gây khó khăn trong tiến trình phát triển vacxin Tuy nhiên rất may mắn, vacxin Rotarix và Rotateq ñược sử dụng trong trị liệu thử nghiệm hiện nay do Mecrk và Glaxo Smith Kline tạo ra ñã ñịnh hình cho loại vacxin tổng hợp trong tương lai [9]

Nghiên cứu giám sát tiêu chảy do RV giữ vai trò ñặc biệt quan trọng,

là tiền ñề cho nghiên cứu biện pháp phòng bệnh này tại Việt Nam, giúp bảo

vệ sức khỏe cho cộng ñồng ñặc biệt là ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Trước yêu cầu ñòi hỏi của thực tiễn trên chúng tôi tiến hành ñề tài nghiên cứu:

“ðặc tính sinh học của virus rota gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em năm 2009 tại Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển”

Mục ñích:

- Xác ñịnh tỷ lệ bệnh tiêu chảy cấp do virus rota tại Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển năm 2009 và các mối liên quan với các yếu tố tuổi, giới tính,

mùa Tìm hiểu các triệu chứng phổ biến khi mắc bệnh và tình trạng phân của bệnh nhân

- Xác ñịnh các typ RV gây bệnh phổ biến ở Bệnh Viện Nhi Thủy ðiển năm 2009

Yêu cầu:

Tiến hành các thí nghiệm phân tích các mẫu phân của trẻ bị tiêu chảy cấp ñược thu thập từ Bệnh Viện Nhi Thụy ðiển năm 2009

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ PHÁT HIỆN RV

1.1.1 Tình hình thế giới

Từ những năm 1950, một số tác giả ựã ựề cập tới nguyên nhân tiêu chảy cấp do virus mà trước ựó gọi là Ộtiêu chảy không rõ nguyên nhânỢ Vào năm 1974, Thomas Henry Flewett-nhà virus học người Anh ựã ựặt tên cho virus này là ỘrotavirusỢ sau khi quan sát chúng dưới kắnh hiển

vi ựiện tử, virus rota trông giống như một cái bánh xe (Rota trong tiếng

Latin có nghĩa là vòng tròn) 4 năm sau ựó cái tên này mới chắnh thức ựược

ựặt cho loại virus này Flewett và Bryden, Midleton cũng ựề cập tới vai trò của rotavirus trong bệnh viêm dạ dày-ruột Sau này, những nghiên cứu về hình thái học bằng nhuộm âm bản những lát cắt cực mỏng các tổ chức nhiễm virus Rota, quan sát dưới kắnh hiển vi ựiện tử ựã cho phép xác ựịnh virus Rota thuộc họ Reoviridae [3]

1.1.2 Tình hình tại Việt Nam

Tại Việt Nam, mãi ựến năm 1980 mới nghiên cứu và xác ựịnh virus Rota là nguyên nhân chắnh gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em đó là một bệnh rất phổ biến ựứng thứ hai sau nhiễm trùng hô hấp cấp tắnh ở trẻ em

Tới năm 1982 ựã triển khai chương trình phòng chống tiêu chảy, ựến nay tỷ lệ trẻ mắc bệnh tiêu hoá giảm dần hàng năm Tuy nhiên, vào những thời ựiểm thời tiết thay ựổi, nhất là mùa nắng nóng trẻ dễ mắc nhiều loại bệnh trong ựó có tiêu chảy

Tiêu chảy cấp thể nặng tiếp tục là một gánh nặng cho trẻ, mỗi gia ựình và toàn xã hội ở Việt Nam

1.2 PHÂN LOẠI

Virus rota là một chi thuộc họ Reoviridae, gồm một số nhóm và nhiều typ huyết thanh Hạt rotavirion là một cấu trúc capsid ba lớp, phức tạp và không có vỏ, bao bọc xung quanh bộ gene chứa 11 ñoạn RNA Có 6 protein cấu trúc và 6 protein không cấu trúc Rotavirus ñược chia thành các nhóm huyết thanh từ A ñến E Các nhóm từ A ñến C gây nhiễm trùng ở người và tất cả mọi nhóm ñều có thể gây nhiêm trùng ở ñộng vật có vú Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em

Kích thước

(nm)

Số ñoạn RNA

Khối lượng phân tử của

Người và các ñộng vật có xương sống

có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn Tên rota virus từ tiếng Latinh,

“Rota” có nghĩa là bánh xe bắt ñầu từ hình thái của nó [4]

Hình 1:Rotavirus ñược chụp dưới kính hiển vi ñiện tử [15]

1.3.2 Cấu trúc

Dưới kính hiển vi ñiện tử, RV có dạng khối cầu 20 mặt, ñường kính khoảng 75nm Chuỗi nucleocapsid của virus ñược tạo thành bởi ba vòng xoắn ñồng tâm gồm 11 ñoạn RNA kép Hạt rotavirus có hai lớp áo protein bao ngoài Mỗi ñoạn dsRNA mã hóa cho một protein cần thiết cho sự tồn tại và nhân lên của virus

Capsid của RV có dạng ñối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp ñối xứng xoắn [7]

- Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7

- Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6

- Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3 Trong ñó VP2

là protein bao quanh RNA

Các nghiên cứu bằng kĩ thuật ñiện di miễn dịch và kính hiển vi ñiện

tử ñã khẳng ñịnh : Capsid trong mang kháng nguyên ñặc hiệu nhóm Capsid ngoài mang kháng nguyên ñặc hiệu typ [4]

Hình 4 Capsid kép của virus (bên trái) và lớp capsid trong (bên phải)

Hình 5 Lớp capsid trong của hạt virus

1.3.2.2 Genome

Genome của RV là RNA sợi ñôi có 11 ñoạn kí hiệu từ 1->11.Có ñộ lớn khoảng 18.555 cặp base Mỗi gen có trọng lượng phân tử từ 2.105 -> 2,2.106 (Dalton), mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc Trừ gen 9 và gen 11, mỗi chuỗi mã hóa hóa cho hai phân tử protein Trọng lượng 11 ñoạn ước tính khoảng 10.106 ñến 14.106 (Dalton) [4]

ðiện di trên gel acrylamid thấy 11 ñoạn gen của RV ñược chia ra làm 4 khu vực Những gen này ñược ñánh số theo thứ tự phân bố của chúng trên bản gel, chẳng hạn gen nào di chuyển chậm nhất ñược ñánh số

1.3.2.3 Protein

Protein cấu trúc

Hạt virus chứa ít nhất 6 protein cấu trúc:

- Các ñoạn 1, 2, 3 và 6 mã hóa cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6

- VP1 là enzyme RNA polymerase nằm trong lõi hạt virus, tham gia vào quá trình phiên mã tạo ra các phân tử mRNA và tạo ra các bản sao genome RNA cho các hạt virion mới

- VP2 là lớp lõi của hạt virion và liên kết với genome RNA

- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzyme Guanylyl transferase, có vai trò gắn mũ vào ñầu 5’ trong quá trình cải biến sau phiên mã phân tử mRNA, bảo vệ mRNA khỏi sự phân huỷ của các nuclease

- Ba protein mang tính ñặc hiệu kháng nguyên của virus là VP4,VP6

- ðoạn gen 9 mã hóa cho protein VP7 VP7 có bản chất là glycoprotein là kháng nguyên trung hòa ñặc hiệu cho typ huyết thanh và VP7 ñinh ra typ G của virus [4,7]

- VP6 là kháng nguyên chung cho dưới nhóm của RV [4]

- Các gai VP4 nhô ra từ lớp vỏ VP6 Phần VP4 trải dài hướng vào trong và tương tác với VP7 và protein capsid trong VP6 Sự tương tác VP4-VP7, VP4-VP6 bao hàm rằng VP4 có thể tham gia duy trì chính xác hình dạng giữa hai lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng như phạm vi ảnh hưởng chức năng VP7 là glycoprotein tạo ra lớp vỏ ngoài của virus bao gồm 780 phân tử, VP7 tương tác với phần chop của VP6 [6]

Protein không cấu trúc

- Các ñoạn gen còn lại (5, 7, 8 hoặc 9 tùy chủng, 10 và 11) mã hóa cho các protein không cấu trúc lần lượt là: NSP1 (NS53), NP2 (NS35), NSP3 (NS34), NSP4 (NS28), NSP5 (NS26)

- NSP1 tạo ra từ gen 5 là một protein không cấu trúc liên kết RNA

- NSP2 là một protein liên kết RNA tích lũy trong thể vùi tế bào chất (viroplasma) cần thiết cho quá trình sao chép genome của virus

Bảng 2 Các gen và protein của RV [6]

ðoạn

gen Protein

Trọng lượng phân tử (Dalton)

Vị trí trên hạt virus Chức năng

Không có vai trò cho sinh trưởng virus

(NS34) 44.816

Vỏ trong capsid

Cấu trúc và là kháng nguyên ñặc trưng loài

(NS34) 34.600

Protein không cấu trúc

Làm tăng hoạt tính mRNA virus và ngừng tổng hợp protein tế bào

(NS35) 36.700

Protein không cấu trúc protein cấu trúc

NTPase liên quan trong việc ñóng gói RNA

ngoài

Cấu trúc và kháng nguyên trung hòa

- NSP3 thì liên kết mRNA của virus trong những tế bào nhiễm bệnh

có thể dừng qua trình tổng hợp protein tế bào

- NSP4 là ñộc tố trong ruột người bệnh tiêu chảy và là ñộc tố ruột của virus ñầu tiên ñược phát hiện

- NSP5 ñược mã hóa bởi gen 11 của RV nhóm A và trong tế bào nhiễm NSP5 ñược tích lũy trong thể vùi tế bào chất

- NSP6 là protein liên kết axit nucleic và ñược mã hóa bởi gen 11 Theo Roseto và cộng sự, bằng kĩ thuật ñông khô ñã xác ñịnh RV có 132 capsome ñược sắp xếp ñối xứng lệch Họ cũng chỉ ra rằng lớp ngoài có các

lỗ nhỏ tương ứng với các lỗ của vỏ capsit trong Sau này Ludert và các cộng sự cũng khẳng ñịnh cấu trúc capsit trong của RV bằng kĩ thuật phá vỡ hạt virus và kĩ thuật tương tự

Quan sát dưới kính hiển vi ñiện tử cho thấy cấu trúc 3 lớp, 2 lớp, 1 lớp lõi hạt virus ñiển hình Cấu trúc lớp kép và lõi có thể là sản phẩm của việc biến ñổi liên tục của hạt 3 lớp

Nghiên cứu về Rota bằng kính hiển vi ñiện tử lạnh cho thấy : VP4 hiện diện trên vỏ ngoài capsit như một loại gai ngắn có kích thước 10 – 12nm Trong lượng phân tử 88000 Dal chiếm 1,5% protein của hạt virus VP4 ñóng vai trò thứ yếu cấu tạo vỏ capsit ngoài và ñược mã hóa bởi gen 4 của các chủng Rota [12]

- VP7 có trọng lượng phân tử 34000 Dal nhưng lại cấu tạo nên 30% protein hạt virus VP7 nằm ở vỏ capit ngoài và ñịnh hình nên bề mặt nhẵn của vỏ ngoài

Hình 7 Genome và protein của RV

1.4 PHÂN NHÓM VÀ CÁC TYP HUYẾT THANH

1.4.1 Phân nhóm

Theo Lambert J.P (1992) virus rota ñược chia thành năm nhóm A, B,

C, D và E Nhóm A có hai phân nhóm 1 và 2, phân nhóm 1 có typ huyết thanh 2, phân nhóm hai có typ huyết thanh 1, 3 và 4

Baoming (1995) chia virus rota thành 7 nhóm ; A, B, C, D, E, F và

G, trong ñó chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và ñộng vật Nhóm

D, E, F, G chỉ thấy ở ñộng vật ở ñộng vật Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em Nhóm B, C thường gây ra những cụ dịch lẻ tẻ, hay gặp ở trẻ lớn và người trưởng thành [4]

1.4.2 Các typ huyết thanh

Typ huyết thanh của rota virus ñược ñặc trưng bởi hai protein capsid lớp ngoài là VP4 và VP7 ñược mã hóa bởi hai ñoạn gen khác nhau [14] VP4 là một loại protein chống phân tách protease – protein P và VP7 là một loại glycoprotein – protein G [4]

14 typ huyết thanh G ñã ñược nhận dạng ở rota virus nhóm A Các typ 1, 2, 3 và 4 là các typ huyết thanh chiếm ña số vòn lại các typ 6, 8, 9,

10 chiếm thiểu số trong các typ huyết thanh gây bệnh ở người [19]

20 typ huyết thanh P ñã ñược phát hiện, 9 trong số ñó phát hiện ở người là P1, P2A, P3, P4, P5A, P7, P8, P11, P14 và P19

Về mặt lý thuyết sẽ có rất nhiều chủng virus rota của người khác nhau bởi sự kết hợp của các typ huyết thanh G và P Nhưng thật may mắn trên thế giới chỉ có bốn chủng RV chủ yếu phân bố G1P8, G3P8, G4P8, G2P4 ðây là một thuận lợi cho mục ñích phát triển vaccine Tuy nhiên sự lưu hành của các chủng virus rota có khác nhau ñáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thông thường lại phân bố ở một vài quốc

gia ñang phát triển, chẳng hạn P6 kết hợp với typ huyết thanh G9 chiếm 9,5% tổng số các chủng RV ở Ấn ðộ

Ở Việt Nam theo nghiên cứu năm 2000 – 2001 chủng G1P8 chiếm

dễ bị bất hoạt ở nhiệt ñộ cao trên 450 Nếu ñông tan băng nhiều lần thì virus mất khả năng gây nhiễm trùng Virus có khả năng tồn tại lâu trong buồng bệnh nhân nên tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện khá cao

1.5.2 Tính bền vững với pH

RV bền vững với pH ở diện tích rộng từ pH 3 ñến pH 10 nhờ ñó RV

có thể tồn tại và phát triển tốt trong ruột người

1.5.3 Các tính chất khác

- Tính nhạy cảm: Khả năng gây nhiễm trùng của RV tùy thuộc vào

sự có mặt của lớp vỏ capsid RV nhạy cảm với EDTA (ethylendiamintetra)

G1P8 G2P4 G3P8 G4P8 Hỗn hợp Các loại khác

EDTA có khả năng phá vỡ lớp vỏ capsit và làm mất khả năng nhiễm trùng của virus

Sodium thyocianate biến hạt virus có hai lớp thành hạt virus chỉ có một lớp capsit Sodium dodecyl 0,1%, phenol, formalin, betapropiolaction

và ựặc biệt là ethanol 95% là chất khử trùng hiệu quả nhất làm mất lớp vỏ capsid virus

- Tắnh ựề kháng : RV nói chung ựề kháng fluorocacbon, ete, chloroform deoxycholate và ựung dịch không ion RV không chụ tác dụng của kháng sinh, chỉ dúng kháng sinh trong trường hợp bội nhiễm hay nhiễm khuẩn phối hợp

1.6 SỰ NHÂN LÊN CỦA RV TRONG TẾ BÀO

RV bám vào bề mặt tế bào lông nhung ruột non dẫn ựến sự thay ựổi cấu trúc và chức năng của biểu mô Nhờ 3 loại protein vỏ VP7, VP6, VP4

mà virus ựề kháng với pH dạ dày và một số enzyme tiêu hóa của ruột.Virus xâm nhập vào tế bào theo lối nhập bào qua mối tương tác ựặc hiệu giữa protein bề mặt VP4 với thụ thể tế bào, sau ựó tạo thành một bóng gọi là endosome Các phân tử protein ở lớp ngoài (gai VP4 và VP7 ) phá vỡ lớp màng ngoài endosome tạo ra sự khác biệt về nồng ựộ canxi đó là nguyên nhân phân giải phân tử trimer VP7 thành VP5 va VP8 , capsid trong không

bị phân hủy nên lúc này hạt virus ựược gọi là hạt cận virus hay dưới virus (SVP Ờ subviral particle) Việc tách vỏ ngoài của RV ở người phụ thuộc trypin Virus xử lý trước bằng trysin sẽ thâm nhập trực tiếp vào tế bào chất qua màng tế bào [4]

- Quá trình sao chép xảy ra hoàn toàn trong tế bào chất

- Tế bào không chứa các enzyme dùng cho sao chép sợi kép RNA vì thế virus phải tự cung cấp các enzym cần thiết

- RNA sợi (-) ñược dùng làm khuôn ñể sao chép sợi (+) nhờ enzym RNA polymeraza phụ thuộc RNA Sợi (+) này dùng ñể tổng hợp các protein ñồng thời phiên mã tạo RNA sợi (-) Khi sợi (-) ñược tổng hợp hoàn toàn nó duy trì việc liên kết với sợi (+)

- Các ñoạn RNA sợi kép ñược hình thành trong các hạt virus mới và các RNA sợi kép hay các RNA ñơn sợi âm không bao giờ tồn tại tự do trong các tế bào nhiễm

- Các hạt virus chưa hoàn chỉnh hình thành trong quá trình liên kết với nguyên sinh chất của virus sẽ ñược hoàn chỉnh nhờ sự nảy chồi qua màng lưới nội chất tế bào Trong quá trình này các hạt virus cần các protein capsid lớp ngoài của chúng

- Sự phân giải tế bào sẽ giải phóng các hạt virus khỏi các tế bào nhiễm Các giai ñoạn chi tiết của quá trình sao chép của RV ñược mô tả dưới ñây :

Giai ñoạn hấp phụ xâm nhập và cởi vỏ

Các ñiểm tiếp nhận ñặc hiệu (receptor) trên bề mặt tế bào chưa hoàn toàn ñược biết rõ Nhưng các nghiên cứu về sự gắn của chủng SA11 lên các

tế bào MA104 cho thấy có khoảng 13 nghìn ñơn vị tiếp nhận trên một tế bào Sự gắn khởi ñầu phụ thuộc vào natri và axit sialic trên màng tế bào Sau khi gắn vào tế bào khoảng 60 ñến 90 phút, virus xâm nhập vào tế bào nhờ enzyme phân giải protein Enzym lysosome của tế bào có tác dụng phá

vỡ capsid lớp ngoài virus

Sự xâm nhập của virus rota người phụ thuộc vào việc tách vỏ ngoài của virus bằng trypsin Virus ñã ñược xử lý trước bằng trypsin sẽ trực tiếp xâm nhập qua màng tế bào vào trong bào tương tế bào

Một giả thuyết khác cho rằng, những hạt virus ñã ñược hoạt hóa bằng trysin dính vào màng tế bào sẽ bơm trực tiếp acid nucleic qua khe hở

hình thành giữa capsomer và lỗ trên màng tế bào Cơ chế này tương tự như phóng acid nucleic vào tế bào vi khuẩn của phage

Những hạt virus chưa ñược xử lý bằng trysin sẽ vào tế bào bằng con ñường thực bào, những virion này sau khi gắn vào màng tế bào khoảng

20 phút sẽ vào trong lysosome

Giai ñoạn tổng hợp và sao chép

Khi RNA của virus ñã vào trong tế bào tương tế bào cảm thụ thì quá trình sao chép sẽ ñược tiến hành Quá trình dịch mã không ñồng ñều, các bản sao là những sợi RNA dương sao chép từ sợi RNA âm Sợi RNA dương và sợi âm xuất hiện ở ba giờ ñầu sau nhiễm trùng Sau ba giờ mức

ñộ phiên mã dần lên và kéo dài từ 9 ñến 12 giờ Tại thời ñiểm này lượng RNA sợi dương là tối ña Tỷ lệ tổng hợp RNA dương và âm thay ñổi trong suốt quá trình nhiễm trùng và mức ñộ tổng hợp tối ña sợi âm xuất hiện vài giờ trước khi lượng RNA sợi dương ñược tổng hợp tối ña

Các protein của virus ñược tổng hợp ñồng thời với sự sao chép RNA của virus Các protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7

có tác dụng tạo capsid của virus Các protein không cấu trúc bao gồm NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RNA

Giai ñoạn lắp ráp và giải phóng

RNA sợi kép tạo thành sẽ ñược lắp ráp với các protein cấu trúc tạo thành hạt virus hoàn chỉnh trong bào tương tế bào và ñược giải phóng ra ngoài tế bào bằng cách ly giải tế bào chủ hoặc nảy chồi

1.7 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH [4]

1.7.1 Khả năng gây bệnh thực nghiệm

RV có khả năng gây viêm dạ dày ruột cấp ở ñộng vật mới sinh như thỏ mèo, dê, khỉ, bê

Một số chủng gây bệnh cho bò như RIT 4237 và WC3 có miễn dịch chéo với chủng gây bệnh cho người, ñược sử dụng làm vaccine phòng bệnh cho người

Trên thực nghiệm một số chủng virus tỏa ở người gây bệnh tiêu chảy hoặc nhiễm trùng không triệu chứng ở ñộng vật mới sinh như bê và lợn con thực nghiệm, lợn con bình thường, khỉ Rhesus và Cynomolgus, cừu thực nghiệm, chó con và chuột mới sinh

Hình 9 Sự nhân lên của RV trong tế bào

1.7.2 Khả năng gây bệnh cho người

1.7.2.1 Khả năng gây bệnh cho trẻ em

RV là nguyên nhân hàng ñầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn ñến tiêu chảy ở trẻ em, ñặc biêt là trẻ từ 6 ñến 24 tháng tuổi Trẻ sơ sinh hiếm khi bị bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện rất nhẹ Một nghiên cứu cho thấy chỉ 10 – 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm RV có biểu hiện lâm sàng Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan ñến kháng thể từ mẹ truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trypsin trong sữa mẹ, enzyme pancreatic chưa hoàn chỉnh…Như vậy dù sữa mẹ không phải là phòng ñược nhiễm RV nhưng có thể phòng ñược bệnh tiêu chảy nặng

Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, RV còn có thể gây viêm ruột hoại

tử, lồng ruột, tắc mật, xuất huyết ñường niệu, nhiễm trùng huyết… Tuy nhiên hiện nay chưa có bằng chứng ñiển hình có tính thuyết phục về vấn ñề này

1.7.2.2 Khả năng gây bệnh cho người lớn

Nhiễm trùng do RV cũng khá phổ biến ở người lớn Theo một nghiên cứu khoảng 55% người lớn khi tiếp xúc với trẻ em bị viêm dạ dày ruột do RV có bằng chứng lượng kháng thể tăng trong thời gian con cái họ mắc bệnh Một nghiên cứu khác cho thấy 11-70% người lớn bị nhiễm trùng

ñã biẻu hiện thành bệnh tiêu chảy Bệnh thường do virus nhóm B, người mắc bệnh có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy mãn tính

1.8 CƠ CHẾ GÂY BỆNH

RV là căn nguyên thường gặp nhất trong bệnh ỉa chảy ở trẻ em dưới

2 tuổi, ñặc biệt là dưới 12 tháng Virus ñộc lực xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và nhân lên chủ yếu ở niêm mạc tá tràng, chúng phá hủy lớp tế bào trụ, làm lớp tế bào này bị biến dạng, do ñó làm ứ ñọng các chất

trong lòng ruột,ựặc biệt là carbonhydrat , làm áp suất thẩm thấu tăng, kéo nước ra ngoài, gây ỉa chảy nhiều lần trong ngày và phân rất nhiều nước [3]

1.9 đẶC đIỂM LÂM SÀNG

Thời gian ủ bệnh của RV từ 1 Ờ 2 ngày Bệnh nhân ựột ngột bị nôn mửa kèm tiêu chảy (ở 80% trẻ bị nhiễm) và kéo dài từ 2 Ờ 6 ngày Khoảng 30% trường hợp bị sốt cao (390) Khi mắc RV thường xuất hiện các triệu chứng của ựường hô hấp nhưng không có bằng chứng nào cho thấy virus nhân lên ở ựường hô hấp Khoảng 50% trường hợp viêm ruột, dạ dày do nhiễm RV cần ựiều trị tại bệnh viện Với trẻ bị suy giảm miễn dịch có thể gây bệnh nghiệm trọng và kéo dài RV cũng gây nhiễm tiềm ẩn ở tuổi thiếu niên và người trưởng thành Tại các nước ựang phát triển, mỗi năm có 5 triệu dưới hai tuổi chết vì tiêu chảy thì trong ựó có triệu chứng RV [7]

1.10 DỊCH TỄ HỌC CĂN BỆNH TIÊU CHẢY CẤP

1.10.1 đường lây truyền [4]

RV chủ yếu lây truyền theo ựường phân miệng ngoài ra còn có thể lây theo ựường hô hấp Bệnh hiếm khi truyền từ ựộng vật sang người Trẻ

em có thể nhiễm cả trước và sau khi ốm kèm tiêu chảy đôi khi chúng có thể ựưa virus tới những thành viên khác trong gia ựình và những người có tiếp xúc gần gũi RV có thể gây tiêu chảy ở cả người lớn chăm sóc trẻ bị bệnh

Ở Mỹ, RV gây bệnh theo mùa , ựạt cao ựiểm từ tháng 11 ựến tháng

5, với mức ựộ lưu hành bắt ựầu từ phắa Tây Nam lan sang vùng đông Bắc [4]

Ở Việt Nam theo đoàn Thị Ngọc Anh (1987) các tháng 11, 12 và một tỷ lệ phát hiện virus là 25-39,5 % so với các tháng 4, 5, 6 là 5 % - 10% [1]

Theo chương trình giám sát ựã công bố năm 2001, sự phân bố bệnh tiêu chảy theo lứa tuổi ở tất cả các lứa tuổi ựều không giống nhau

Tại Việt Nam trẻ dưới 3 tháng tuổi ắt mắc bệnh do sữa mẹ có tỷ lệ IgA khá cao Kháng thể này có thể kéo dài tới khi trẻ 2 tuổi, do vậy trẻ bú sữa mẹ ựược miễn dịch tự nhiên nên ắt mắc bệnh hơn

1.10.4 Miễn dịch

Các loại kháng thể ựóng vai trò trong quá trình bảo vệ là :

- Kháng thể tiết : IgA tiết trong sữa mẹ chiếm tỷ lệ cao và có thể tồn tại ựến 24 tháng, do ựó trẻ bú sữa mẹ ựược bảo vệ trước sự tấn công của

RV Kháng thể trong sữa là kháng thể trung hoà [6] IgA tiết ở niêm mạc ruột non có vai trò bảo vệ chắnh chống nhiễm RV typ 2 Vì vậy vacxin sử dụng theo ựường uống sẽ tạo miễn dịch cao hơn [8]

- Kháng thể dịch thể : IgM xuất hiện sớm nhất trong máu, cao nhất vào giai ñoạn cấp tính của bệnh giảm sau 10 ngày IgG ñạt mức thấp nhất trong giai ñoạn cấp tính và tăng cao ở giai ñoạn phục hồi [8]

Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào chưa ñược ñiều tra cụ thể

1.11 SỰ PHÂN BỐ TOÀN CẦU CÁC CHỦNG RV

Có tổng số 45571 chủng thu thập từ năm 1973 ñến năm 2003 qua

124 công trình nghiên cứu ñược công bố từ năm 1989 ñến năm 2004 từ 52 quốc gia và 5 châu lục Tất cả chủng này ñã xác ñịnh thuộc typ G, 17996 chủng thuộc typ P và 16474 chủng ñã ñược xác ñịnh vừa thuộc typ G và typ P

1.11.1 Trên thế giới

Sự phân bố khác nhau của chủng RV ở các vùng khí hậu khác nhau

- Sự phân bố của các kiểu gen G [2]

+ Theo thống kê tại Nam Mỹ trong 2095 chủng RV ñược phân tích

có 57,5% là G1 ; 18,3% là G2 ; 4,4% là G3 ; 8,8% là G4 ; 2,3% là G5 ; và 8,6% là G9

+ Tại châu Phi trong 2133 chủng RV ñược phân tích có G1, G2, G3, G4, G8 và G9 tương ứng là 35,75% ; 20,3% ; 13,3% ; 14,2% ; 12,8 % và 3,7 %

+ Tại các nước châu Á trong số 13126 chủng phân tích có tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G10 và G12 tương úng là 60,3% ; 16,7% ; 6,5% ; 14,3% ; 1,7% ; 0,3% ; và 0,2%

+ Tại Bắc Mỹ trong 2892 chủng RV ñược phân tích có tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là 73,7% ; 11% ; 10,6% ; 2,7% ; 8,6%

+ Tại châu Âu trong 14475 chủng RV tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G6 và G9 tương ứng là 69.4% ; 10,2% ; 3,5% ; 15,5% ; 0,1% và 1,3%

+ Tại châu Úc trong 6995 chủng RV ñược phân tích tỷ kệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là : 74% ; 10,8% ; 1% ; 4,6% và 9,6%

- Sự phân bố của các kiểu gen P

Kiểu gen P8 và P4 chiếm hơn 90% tiêu chảy do RV Ngoại trừ ở châu Phi thì kiểu gen P6 có tỷ lệ cao (22,4%) ñứng thứ 2 sau P8 (51%)

Mỹ và châu Âu trong khi ñó chỉ xuất hiện trong 30% ca nhiễm ở Nam Mỹ

và châu Á, chỉ khoảng 23% ở châu Phi Trong ñó cần phải kể ñến là sự phát hiện một số chủng P-G bất thường như P4G1, P8G2, P4G3, P4G4 với tần suất tương ñối cao (trong các khu vực khác nhau trên thế giới có thể gợi ý tính di truyền bền vững và khả năng tiềm tàng lây lan của chúng trong cộng ñồng)

Sự xuất hiện các chủng bất thường có thể ñược giải thích bằng các nguyên sau sau ñây [7] :

Genome RV khi sao chép ñã xảy ra ñột biến ñiểm và ñột biến này duy trì trong hạt

Do sự sắp xếp lại gen Khi 2 typ huyết thanh cùng gây nhiễm vào một tế bào sẽ xảy ra hoán vị kháng nguyên

Virus ñộng vật có thể gây nhiễm cho người do ñó làm tăng hoạt tính gây nhiễm (ñã có bằng chứng cho thấy ADRV (Animal Derived Rotavirus) nhóm B của người có nguồn gốc từ ñộng vật)

RV gây bệnh mãn tính ở người suy giảm miễn dịch có thể sắp xếp lại genome và tạo ra các ñoạn RNA bất thường

Các yếu tố kể trên có thể cùng một lúc xảy ra Ví dụ vừa sắp xếp lại genome, vừa xảy ra ñột biến

Tần số các mẫu không thể ñịnh typ khi sử dụng phương pháp EIA nằm trong khoảng 8-46,2%, có thể các chủng ñột biến ñã tránh ñược sự nhận biết của các kháng thể ñơn dòng hoặc do sự có mặt của các typ huyết thanh bất thường không phát hiện ñược bởi các kháng thể ñơn dòng vẫn thường ñược sử dụng ñể xác ñịnh RV ở người bằng phương pháp EIA Ứng dụng RT-PCR xác ñịnh genome RV ñã làm giảm số lượng các chủng không thể ñịnh typ Tuy nhiên , những kĩ thuật này còn gặp phải những hạn chế vốn có Các chủng chứa các ñột biến lớn ở các vùng bám primer vẫn không thể xác ñịnh ñược Vẫn còn một số nghiên cứu kết hợp EIA và RT-PCR và lai các ñầu dò, tuy vậy khoảng 7,8% - 26,6% các chủng không thể ñịnh typ

Sự phân bố của các typ P và G dao ñộng theo thời gian

Sự phân bố G và P có sự thay ñổi theo thời gian Trong nghiên cứu

10 năm liên tiếp (1987-1997) ở Bangladesh cho thấy sự dao ñộng hàng năm

là một ví dụ tiêu biểu sự phân bố của các typ huyết thanh G1, G2, G3, G4

và G9

- Trong suốt 3 năm ñầu tiên G2 là typ huyết thanh phổ biến nhất, tiếp theo là các typ G1 và G4

- Năm thứ 4 các typ G4 là phổ biến nhất và chiếm ưu thế ñến năm

1995 Năm 1995 các typ G9 nổi lên và chiếm ưu thế , các typ G4 hiếm gặp

hơn Năm 1996 và 1997 typ G9 phổ biến nhất được xác định trong nước này với tần suất tương ứng là 34,4% và 53%

Như vậy ta thấy các typ P và G của RV trong cùng một khu vực cũng khơng ổn định theo các năm, do đĩ việc nghiên cứu giám sát tiêu chảy do

RV tại các nước là cần thiết để cĩ hướng nghiên cứu biện pháp phịng bệnh hợp lý

1.11.2 Tại Việt Nam

Theo kết quả nghiên cứu tại 6 bệnh viện ở Việt Nam : miền Bắc gồm Bệnh viện Nhi Trung Ương, Bệnh viện Xanh Pơn, Bệnh viện Nhi Hải Phịng Miền Nam gồm Bệnh viện Nhi Khánh Hồ (Nha Trang), Bệnh viện Nhi ðồng I TPHCM, Bệnh viện Nhi ðồng II TPHCM thu được kết quả sau [18] :

Kiểu gen G : Trong số 221 chủng nghiên cứu từ 7/1998 đến 6/1999 thu được kiểu gen G2 phổ biến nhất (53%), G4 (17%), G1 (13%), G3 (3,6%), G9 (1,3%), kiểu hỗn hợp là 9% và khơng xác định là 2,1%

Kiểu gen P : Trong số 140 chủng nghiên cứu phổ biến nhất 4 chủng

là P8 liên kết với G1, G3, G4 và P4G2 tương ứng 74% các chủng lưu hành tại Việt Nam Ngồi ra cịn xác định 2 chủng với kiểu gen P6 liên kết với G3 và G4

1.12 CHẨN ðỐN RV

1.12.1 Chẩn đốn trực tiếp

- Nuơi cấy xác định : Cĩ thể nuơi cấy trên tế bào thận của bào thai người, tế bào thận khỉ , tế bào thận bị Sau đĩ phát hiện virus bằng phản ứng trung hồ giảm đám hoại tử hoặc ELISA Vịêc nuơi cấy RV trên tế bào cịn gặp nhiều khĩ khăn nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu vì vậy người

ta phải dùng các phương pháp khác để chẩn đốn [1,8]

- Kỹ thuật kính hiển vi điện tử : ðây là phương pháp phát hiện trực tiếp RV trong bệnh phẩm và kỹ thuật chẩn đốn nhanh , đặc hiệu , tuy nhiên độ nhạy khơng cao và khá đắt tiền, rất khĩ thực hiện khi cĩ nhiều mẫu bệnh phẩm [8]

- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp : ðây là phương pháp phát hiện virus trong phân, mảnh thiết ruột nhờ kháng thể gắn huỳnh quang [6]

- Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex : Hạt Latex được gắn với kháng thể kháng RV để chẩn đốn kháng nguyên của virus ðây là kỹ thuật chấn đốn nhanh , khơng cần nhiều trang thiết bị [8]

- Kỹ thuật điện di : Nguyên lý các mảnh kép phân tử RNA của RV

cĩ trọng lượng phân tử khác nhau nên dễ dàng tách ra khi điện di trên gel polyacrylamid hoặc agarose Kỹ thuật này cĩ độ nhạy,đặc hiệu cao,dễ áp dụng trên nhiều bệnh phẩm [8]

- Kỹ thuật RT – PCR : Kỹ thuật này cĩ giá trị chuẩn đốn bệnh cao, cho phép xác định trực tiếp RV trong bệnh phẩm nhờ khả năng khuếch đại sao chép ngược số lượng các đoạn RNA đặc hiệu trên hệ gen của virus [6]

- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA) : Phương pháp này dựa vào sự kết hợp giữa kháng thế với kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên trong phân trẻ em Kỹ thuật này độ nhạy cao, dễ áp dụng khi cĩ nhiều bệnh phẩm Hiện nay kỹ thuật ELISA được sử dụng rộng rãi trên thế giới để phát hiện RV [6 8]

1.12.2 Chẩn đốn gián tiếp

Bằng các kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng RV, gồm :

- Phản ứng trung hồ trên tế bào thận khỉ bào thai

- Phản ứng kết hợp bổ thế : Dùng kháng nguyên là RV ở người tinh khiết, phân lập từ phân bệnh nhân để phát hiện RV

- Phản ứng ức chế gây nhưng kết hồng cầu thụ động : Cĩ thể dùng phàn ứng này để định lượng IgG, phân biệt được lần nhiễm thứ nhất với lần nhiễm thứ hai Phản ứng này nhạy hơn phản ứng kết hợp bổ thế

Vì tỷ lệ nhiễm virus ở quần thể dân cư khá cao nên các phương pháp phát hiện kháng thể kháng RV ít cĩ ý nghĩa chẩn đốn [12]

1.13 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN VACXIN PHỊNG BỆNH TCC

- Ứng cử viên đầu tiên của vacxin RV là vacxin đơn giá

“Monovalent vaccines” sử dụng chủng RV WC3 được phân lập từ vật chủ

là bị hoặc từ khỉ Rhesus ðây là loại vacxin uống sống giảm độc uống một liều duy nhất Vắc xin này an tồn và cĩ thể ngăn chặn được bệnh tiêu chảy

do RV ở trẻ em

- Vacxin thứ hai là các vacxin đa giá “Multivalent vaccines” được sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen Một gen trong hệ gen của chủng RV động vật được thay thế bởi gen của RV người, gen này

mã hố cho VP7 [4,6]

- Rota Shield là vacxin tứ liên “Tetravalent vaccines” được phát triển bởi chủng RV MMU180006, là vacxin sống giảm độc lực uống được sản xuất từ chủng RV ở khỉ Rhesus (RRV-TV) Chủng này cĩ cùng đặc tính trung hồ với các chủng RV G3 của người, MMU18006 phù hợp cho việc phát triển vacxin bởi vì nĩ phát triển tốt trong nuơi cấy tế bào So với các vacxin dùng các chủng RV bị, MMU 18006 an tồn và tạo miễn dịch tốt Các thử nghiệm lâm sàng ở trẻ em tại Bắc Mỹ, Nam Mỹ và châu Âu cho thấy RotaShield và vắc xin an tồn và rất hiệu quả Vắc xin này được cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ được sử dụng vắc xin tương