Báo cáo nghiên cứu khoa học: "Nhân nhanh In vitro lan kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) – một loài Lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng." potx

TẠP CHÍ KHOA HỌC, ðại học Huế, Số 64, 2011 NHÂN NHANH IN VITRO LAN KIM ðIỆP DENDROBIUM CHRYSOTOXUM – MỘT LOÀI LAN RỪNG CÓ NGUY CƠ TUYTUYỆT CHỦNG Nguyễn Văn Song Viện Tài nguyên, Môi

TẠP CHÍ KHOA HỌC, ðại học Huế, Số 64, 2011

NHÂN NHANH IN VITRO LAN KIM ðIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) –

MỘT LOÀI LAN RỪNG CÓ NGUY CƠ TUYTUYỆT CHỦNG

Nguyễn Văn Song Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, ðại học Huế Phan Hùng Vĩnh, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Quảng Nam Trương Thị Bích Phượng, Trường ðại học Khoa học, ðại học Huế

TÓM TẮT

Chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Kim ñiệp Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 3 tháng tuổi Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường MS cơ bản có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA là thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro

Từ khóa: Dendrobium chrysotoxum, hạt lan, lan quý hiếm, nhân nhanh, protocorm

1 Mở ñầu

Lan Kim ñiệp (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan rừng Việt Nam phân bố chủ

yếu ở vùng Tây Nguyên, có hoa lớn màu vàng tươi Cánh môi có ñốm vàng cam ñậm ở giữa, mép có lông mịn Hoa nở vào dịp tết từ tháng 1 ñến tháng 2 [2] Loài lan này ñang ñứng trước nguy cơ sẽ bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên trong một tương lai gần [1] ðối với nhiều loài lan hiếm, bị ñe dọa hay nguy cấp trong tự nhiên thường ñược bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm bằng hạt [13] Các loài lan sống biểu sinh thường ñược nhân giống từ hạt, sử dụng việc nuôi cấy không cộng sinh [5]

Hạt lan phát triển rất kém ngay cả khi ñã chín, chúng phụ thuộc vào sự nhiễm nấm ñể nảy mầm và phát triển trong tự nhiên Phương pháp nuôi cấy không cộng sinh ñược phát triển sau nghiên cứu của Knudson (1922) [8], hạt lan có thể nảy mầm trên môi trường muối khoáng ñơn giản có chứa ñường Phương pháp này ñã trở thành kỹ

thuật chuẩn cho nảy mầm hạt lan [9] Ở Ecuador, phương thức nảy mầm hạt lan in vitro

cũng là một phần quan trọng của chương trình bảo tồn và nhân giống các loài lan hiếm, cung cấp cây con cho chương trình phục hồi rừng tái sinh [15] Với công nghệ nhân

giống in vitro hiện nay hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn ñến một

triệu cây con [4]

Trong thời gian qua, ñã có một số tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu nhân giống bằng hạt ở các loài lan khác nhau Luan và ñồng tác giả (2006), ñã nuôi cấy hạt

một số loài Dendrobium sp Dactylorhiza fuchsia Một loài lan có trong sách ñỏ của vùng Baltic cũng ñược nuôi cấy thành công từ hạt của quả còn xanh [11], Geodorum densiflorum ñã ñược nhân giống in vitro [7], Calanthe sieboldii cũng ñược cho nảy mầm từ quả 80 ngày tuổi [17], Cypripedium macranthos ñược nhân giống bằng hạt [19], Epidendrum ibaguense ñược cho nảy mầm không cộng sinh [10]

Kim ñiệp là một loài lan ñẹp, thuộc nhóm nguy cấp, tuy nhiên ñến nay theo tài liệu chúng tôi có ñược thì chỉ có Roy và cs (2007) nghiên cứu sự hình thành protocorm thông qua tạo callus từ ñỉnh chồi Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu nhân nhanh lan Kim ñiệp bằng nuôi cấy hạt nhằm mục ñích bảo tồn loài lan có nguy cơ tuyệt chủng này ñồng thời tạo nguồn nguyên liệu ban ñầu cho sản xuất hoa lan

2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là quả lan Kim ñiệp (Dendrobium chrysotoxum) 3 tháng

tuổi thu hái từ cây ngoài tự nhiên

2 2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khử trùng mẫu

Quả lan ñược ngâm trong nước xà phòng loãng và rửa kỹ dưới dòng nước chảy, sau ñó khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 2 phút, tiếp ñến khử trùng bề mặt vỏ quả bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút Cuối cùng, quả ñược rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng

2.2.2 Nảy mầm và phát sinh protocorm

Hạt lan thu từ quả ñã khử trùng ñược cấy lên môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% nước dừa (CW), 0,5-2,5 mg/l benzylamino purine (BAP), và 0,2-1,5 mg/l napththaleneacetic acid (NAA) ñể thăm dò khả năng nảy mầm và phát sinh protocorm

2.2.3 Nhân nhanh protocorm

Các protocorm sau khi hình thành sẽ ñược cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản

có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 15% CW, bổ sung BAP, kinetin, NAA riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng ñộ khác nhau ñể thăm dò khả năng nảy mầm và nhân protocorm

2.2.4 Phát triển chồi từ protocorm

Các protocorm sau khi nhân nhanh ñược cấy lên môi trường MS cơ bản có 8 g/l agar, 30 g/l sucrose, 1 g/l than hoạt tính bổ sung 15% CW và các chất kích thích sinh trưởng (BAP, NAA và kinetin) riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng ñộ khác nhau ñể thăm

dò khả năng phát triển chồi

2.2.5 Tạo rễ từ chồi in vitro

Các chồi thu ñược từ các thí nghiệm trên ñược tách riêng rẽ và cấy lên môi trường cơ bản MS có 8 g/l agar; 30 g/l sacharose bổ sung NAA từ 0,1 - 1,5 mg/l hoặc 1,0 mg/l NAA phối hợp với kinetin (0,3 - 1,5 mg/l) ñể thăm dò khả năng hình thành và

phát triển của rễ từ chồi in vitro sau 6 tuần nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro ñược duy trì ở nhiệt ñộ 25 ± 2oC, cường ñộ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày

2.2.6 Chuyển cây con trồng ngoài ñiều kiện tự nhiên

Các cây con tái sinh hoàn chỉnh (cao 3,0 - 4,5 cm, có 2 - 5 rễ) ñược huấn luyện thích nghi với ñiều kiện bên ngoài Sau ñó cây con ñược trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ (tỷ lệ 1:2) ở chế ñộ che sáng 50 % và tưới phun sương Xác ñịnh tỷ lệ sống sót của cây con sau 4 tuần chăm sóc

2.3 Xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần (n ≥ 30) ñể tính trung bình mẫu và phân tích

Duncan (p < 0,05) bằng chương trình SAS

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Sự nẩy mầm và phát sinh protocorm

Bảng 1 Ảnh hưởng của BAP và NAA ñến khả năng nảy mầm và hình thành protocorm của hạt

Nồng ñộ chất kích thích sinh trưởng

(mg/l)

Khả năng nảy mầm và phát sinh

protocorm

BAP

NAA

Chú thích:

- : Không bổ sung chất kích thích sinh trưởng;

++++ : tốt ; +++ : khá

++ : trung bình; +: kém

Các hạt lan ban ñầu có màu vàng chanh ñược nuôi cấy in vitro sau 2 tuần ñã

chuyển sang màu nâu vàng, rồi bắt ñầu trương lên Sau 3-4 tuần hạt tiếp tục trương to và

có hình cầu màu xanh nhạt do lục hóa Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy ñược trình bày ở bảng 1

Số liệu ở bảng 1 cho thấy, BAP và NAA có tác dụng rõ rệt ñối với sự nảy mầm ñồng thời phát sinh protocorm của hạt so với ñối chứng (không bổ sung chất kích thích sinh trưởng) Môi trường có BAP (1,0 - 1,5 mg/l) có tác dụng tương ñương với môi trường có bổ sung 0,2 mg/l NAA Môi trường có 2,0 mg/l BAP kích thích sự nảy mầm

và phát sinh protocorm tốt nhất Kết quả nghiên cứu trên lan Nghinh xuân

(Rhynchostylis gigantea) cũng tương tự, nồng ñộ NAA thích hợp là 0,1 mg/l [3] Tuy nhiên, ở một số loài Dendrobium sp thì cần NAA ở nồng ñộ cao hơn lên ñến 0,5 mg/l

NAA [14]

3.2 Nhân nhanh protocorm

Hạt lan nảy mầm có thể sản xuất ra một khối tế bào chưa phân hóa rõ ràng ñược gọi là protocorm Tất cả những protocorm này sẽ tiếp tục phát triển trong nhiều tuần, nhiều tháng hay thậm chí nhiều năm phụ thuộc từng loài cho ñến khi ñủ lớn ñể tạo lá và

rễ [15]

Bảng 2 Ảnh hưởng của BAP, kinetin riêng rẽ hoặc kết hợp với NAA lên khả năng nhân nhanh

protocorm sau 6 tuần nuôi cấy

Chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Số Protocorm trung

bình/mẫu

LSD0,05 0,08

Chú thích: Các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05

Các protocorm sau khi hình thành ñược cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản,

bổ sung BAP, kinetin, NAA riêng rẽ hoặc phối hợp ở các nồng ñộ khác nhau ñể nhân nhanh protocorm Kết quả thu ñược sau 6 tuần nuôi cấy trình bày qua bảng 2 cho thấy, BAP có tác dụng tích cực ñến sự hình thành protocorm, nồng ñộ 2,0 mg/l BAP thích hợp nhất ñể phát sinh protocorm, số protocorm trung bình ñạt ñược cao nhất là 4,33

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Kalimuthu và cs (2006) trên Oncidium sp

và kết quả của Anjum và cs (2006) khi nghiên cứu trên D Malones Kinetin cũng có tác

dụng trong sự hình thành protocorm Môi trường có kinetin ở nồng ñộ 1,0 mg/l cho số protocorm cao nhất là 3,88 Sự kết hợp giữa NAA với BAP hoặc kinetin cho hiệu quả nhân protocorm tốt Số protocorm hình thành cao nhất 3,66 protocorm trên môi trường

có 1,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA và 3,60 protocorm trên môi trường có 1,0 mg/l kinetin

+ 0,5 mg/l NAA Nghiên cứu từ mẫu lá D Malones cũng cho số protocorm cao nhất

trên môi trường có 1,0 mg/l kietin + 0,5 mg/l NAA [6]

3.3 Phát sinh chồi từ protocorm

Kết quả phát sinh chồi từ protocorm sau 12 tuần nuôi cấy ñược trình bày ở bảng

3 cho thấy, NAA có tác dụng rõ rệt ñến sự phát triển chồi từ protocorm so với môi trường ñối chứng Trên môi trường có 0,7 mg/l NAA cho số số chồi/protocorm cao nhất

là 2,8 chồi/protocorm và sự phát triển chiều cao chồi lớn nhất (4,03 cm) ở môi trường

có 1,0 mg/l NAA Kinetin có tác dụng tích cực ñến sự phát triển chồi từ mẫu cấy, số chồi hình thành cao hơn so với môi trường có NAA, tuy nhiên, sự phát triển chiều cao chồi lại kém hơn Trên môi trường có 1,0 mg/l kinetin số chồi hình thành cao nhất là 3,16 chồi/protocorm, môi trường có 1,5 mg/l kinetin kích thích sự phát triển chiều cao chồi Kim ñiệp tương ñối tốt (3,68 cm) Sự phối hợp giữa BAP và NAA có tác ñộng khá tốt ñến sự hình thành chồi từ protocorm, số chồi thu ñược cao nhất ở môi trường có 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, chiều cao chồi lớn nhất ở môi trường có 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA Từ kết quả này cũng cho thấy, với tỷ lệ Cytokinin/Auxin (BAP/NAA) = 2 là thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi từ protocorm của lan Kim ñiệp Các tỷ lệ khác cho hiệu quả thấp, ñiều này cũng có thể do hàm lượng auxin nội sinh của mô ñã ảnh hưởng ñến khả năng tạo chồi của protocorm

3.4 Sự hình thành rễ của chồi in vitro

Chồi của loài Kim ñiệp thu ñược từ các thí nghiệm trên ñược tách riêng rẽ và cấy lên môi trường tạo rễ ñể khảo sát khả năng hình thành rễ Kết quả thí nghiệm sau 6 tuần theo dõi ñược trình bày ở bảng 4

Kết quả ở bảng 4 cho thấy, sự hình thành rễ của chồi in vitro tốt nhất trên môi

trường có 1,0 mg/l NAA (5,93 rễ/chồi) Chiều dài rễ tương ñương nhau trên các môi

trường có 0,1; 0,3; 0,5 mg/l NAA Chồi Kim ñiệp hình thành rễ kém trên môi trường có

sự kết hợp giữa kinetin và NAA

Bảng 3 Ảnh hưởng của BAP, kinetin và NAA lên khả năng phát sinh chồi từ protocorm

Chất kích thích sinh trưởng (mg/l) Số

chồi/protocorm Chiều cao chồi (cm)

- 2,0 0,7 2,65bc 3,25b

3.5 Chuyển cây con trồng ngoài ñiều kiện tự nhiên

Các bình cây con Kim ñiệp tái sinh hoàn chỉnh (cao 3,0 - 4,5 cm, có 2 - 5 rễ) ñược chuyển từ phòng nuôi cấy ra ngoài ñiều kiện tự nhiên, có ánh sáng ñầy ñủ, ở nhiệt

ñộ phòng trong khoảng 10 ngày ñể cây thích nghi dần Sau ñó, chuyển cây con ra khỏi bình nuôi cấy, rửa sạch môi trường, cắt ngắn rễ và nhúng vào dung dịch sát khuẩn (VIBEN-C 50BTN 0,25 - 0,3 %) trong thời gian 1 phút Cây con ñược trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ (tỷ lệ 1:2) ở chế ñộ che sáng 50 % và tưới nước phun sương Sau

2 tuần, cây con bắt ñầu hình thành rễ mới và hình thành lá mới sau 3 tuần chuyển ra vườn ươm Kết quả sau 1 tháng theo dõi, tỷ lệ sống sót ñạt 90,9 %

Bảng 4 Ảnh hưởng của chất KTST lên khả năng tạo rễ của chồi lan Kim ñiệp in vitro

Chất KTST (mg/l)

Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm)

4 Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi sơ bộ rút ra một số kết luận sau:

- Môi trường tốt nhất cho sự nảy mầm ñồng thời phát sinh protocorm của hạt là

MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP

- Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất (4,33 protocorm/mẫu) là MS cơ bản

có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP

- Môi trường MS cơ bản có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, bổ sung 15% nước dừa và kết hợp 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA hoặc 1 mg/l Kinetin là

thích hợp nhất cho sự phát sinh chồi từ protocorm và sự sinh trưởng của chồi in vitro

- Môi trường thích hợp cho tạo rễ là MS cơ bản có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, bổ sung 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA

E

Hình 1 A: Hạt lan nảy mầm sau 6 tuần trên môi trường có 2,0 mg/l BAP

B: Protocorm sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có 2,0 mg/l BAP

C: Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường có 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l

NAA sau 12 tuần nuôi cấy

D: Chồi in vitro tạo rễ sau 6 tuần trên môi trường có 1,0 mg/l NAA

E: Cây con trồng trên giá thể ngoài tự nhiên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Tiến Bân và các tác giả, Sách ñỏ Việt Nam – Phần II – Thực vật, Nxb Khoa

học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, 2007

[2] Trần Hợp, Phong lan Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Tp HCM, 1998

[3] Nguyễn Hoàng Lộc, Mai Văn Phô, ðiều tra sơ bộ thành phần loài họ lan ở Thừa Thiên Huế và bước ñầu bảo tồn in vitro một số loài phân bố ở ñây, Tạp chí Sinh học 22(3b),

(2000), 173-178

[4] Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, Cây Phong lan Dendrobium sp, Trường ðại học

Nông Lâm Tp HCM, 2001

[5] Alvarez-Pardo VM, Ferreira AG, Nunes VF, Seed disinfestation methods for in vitro cultivation of epiphyte orchids from Southern Brazil, Horticultura Brasileira 24, (2006),

217-220

[6] Anjum S, Zia M and Chaudhary MF, Investigations of different strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’, African Journal of

Biotechnology, 5(19), (2006), 1738-1743

[7] Bhadra SK, Hossain MM, In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schtr., an endangered orchid species, Plant Tissue Cult 13(2),

(2003), 165-171

[8] George EF, Hall MA and Jan de Klerk G., Plant propagation by tissue culture, 3rd

Edition, Vol 1 The background Spinger, the Netherlands, 2008

[9] Goh CJ, Ammirato PV, Evans DR, Sharp WR, Bajaj YPS, Orchids, Monopodials In: Handbook of Plant Cell Culture, McGraw-Hill, New York Vol 5,(1990), 598-633 [10] Hossain MM, Asymbiotic seed germination and in vitro seedling development of Epidendrum ibaguense Kunth (Orchidaceae), African Journal of Biotechnology 7(20),

(2008), 3614-3619

[11] Jakobsone G., Morphogenesis of wild orchid Dactylorhiza fuchsii in tissue culture,

Acta Universitatis Latviensis, Biology 745, (2008), 17–23

[12] Kalimuthu K, Senthilkumar R and Vijayakumar S., In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp (Dancing Dolls), African Journal of Biotechnology 6 (10), (2006),

1171-1174

[13] Kauth P., In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila lanceolata var lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master

thesis, University of Florida, 2005

[14] Luan VQ, Thien NQ, Khiem DV and Nhut DT., In vitro germination capacity and plant recover of some native and rare orchids, Proceedings of International Workshop

on Biotechnology in Agriculture, (2006), 175-177

[15] McKendrick S., In vitro germination of orchids: a manual, Ceiba Foundation for

Tropical Conservation, (2000), 1-17

[16] Murashige T, Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant 15, (1962), 473-497

[17] Park SY, Murthy HN and Paek KY., In-vitro seed germination of calanthe sieboldii,

an endangered orchid species, Joumal of Plant Biology 43(3), (2000), 158-161

[18] Roy J, Naha S, Majumdar M, Banerjee N., Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl, Plant Cell Tiss

Organ Cult, 90, (2007), 31-39

[19] Taniguchi H, Katsumi M, Yamamoto Y, Tatsumi Y, Sano CM, Choi YE and Sano H.,

In vitro proliferation and genetic diversity of Cypripedium macranthos var rebunense, Plant Biotechnology, 25, (2008), 341-346

IN VITRO PROPAGATION OF DENDROBIUM CHRYSOTOXUM - AN

ENDANGERED ORCHID SPECIES

Nguyen Van Song Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University

Phan Hung Vinh Quang Nam Department of Agricultural and Rural Development

Truong Thi Bich Phuong College of Sciences, Hue University

SUMMARY

We have carried out in vitro propagation of Dendrobium chrysotoxum In this report, the 3-month old seeds were used for propagation The suitable medium for seed germination accompanied with protocorm induction is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP and for protocorm propagation is basal MS with 20 g/l sucrose,

8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP The basal MS medium + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l activated charcoal + 15% CW and 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA was the most suitable for multi-shoot micropropagation from protocorm and the growing of in vitro shoots The suitable medium for rooting is MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 1,0 mg/l NAA

Key words: Dendrobium chrysotoxum, immature seeds, endangered orchid,

micropropagation, protocorm