Đa hình điện di isozym esterase EST của các mẫu nghiên cứu Đa hình điện di isozym esterase trong các mẫu nghiên cứu đã được phát hiện sau điện di khi các gel được phân tích hoạt tính enz
Trang 1Đa hình điện di isozym esterase trong các loài thuộc
chi khoai môn (Colocasia) và chi khoai mùng
(Xanthosoma)
Nguyễn Bá Hoành (a)
Tóm tắt Trong bài viết này, chúng tôi trình bày mức độ đa hình điện di isozym esterase (EST) trong các loài thuộc chi khoai môn (colocasia) và chi khoai mùng (xanthosoma) Qua đó tìm thấy mối tương quan giữa đa hình điện di isozym EST và mức bội nhiễm sắc thể cũng như phân loại các mẫu khoai môn sọ dựa vào đa hình điện
di isozym EST
I mở đầu
Khoai môn sọ (colocasia esculenta) là cây trồng lấy củ quan trọng ở nhiều nước châu á và Thái Bình Dương Củ khoai môn sọ chứa hàm lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp và có nhiều khoáng chất, được sử dụng như là một loại rau sạch Cây khoai môn sọ được trồng ở khắp mọi nơi, đặc biệt có thể phát triển tốt trên vùng
đồi núi Vì vậy, cây khoai môn sọ rất phù hợp với định hướng phát triển ở vùng trung
du và miền núi, góp phần xóa đói giảm nghèo Tuy nhiên, những nghiên cứu di truyền
và chọn giống đối với loài cây trồng này ở nước ta còn quá ít và chỉ mới được bắt đầu trong những năm gần đây
Phân tích isozym bằng kỹ thuật điện di là một phương pháp hữu ích để đánh giá mức độ giống nhau về mặt di truyền trong các nhóm thực vật, phân biệt nguồn gốc
đa bội cũng như phân biệt dạng lưỡng bội và tam bội Theo Gottlieb (1982) thì số lượng isozym tăng lên thường quan sát thấy ở các loài thực vật đa bội khác nguồn (allopolyploidy) và phổ isozym có thể giúp ta giải thích được vấn đề nguồn gốc đa bội của các loài thực vật Hirai và cộng sự (1989) cho rằng, có thể phân biệt dạng khoai môn trồng lưỡng bội và tam bội bằng một số đặc điểm hình thái kết hợp với phổ điện
di các protein dự trữ trong củ Tanimoto (1986) và Lebot (1991) lại cho rằng, không thể phân biệt hai dạng bội NST này bằng phương pháp so sánh phổ điện di isozym [1]
Kết hợp giữa kỹ thuật điện di isozym với phân tích hình thái nông học, một số nhà khoa học đã báo cáo về sự đa dạng di truyền trong loài khoai môn sọ và bước đầu
đưa ra những kết luận về khả năng sử dụng các kỹ thuật này để phân loại các giống khoai môn sọ (Lebot, 1991; Nguyen, 1998, 1999, 2001, )
II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Với tổng cộng 60 mẫu giống thuộc các loài: khoai môn sọ (colocasia esculenta (L.) Schott, 49 mẫu giống), dọc mùng (colocasia gigantea (Bl.) Hook f., 3 mẫu giống), khoai mùng (xanthosoma, 8 mẫu giống) đã được thu thập từ một số huyện ở Nghệ
An và Thanh Hoá Các mẫu giống sau đó được đem trồng trong vườn thực nghiệm cho đến lúc ra lá non (khoảng 15 ngày) để sử dụng cho phân tích điện di isozym
Trang 2Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR 35-41
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Hệ enzym EST trong dịch chiết từ mô lá được phân tích bằng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamide, sử dụng hệ thống máy điện di ATTO - 6500 của Nhật Bản
Lấy mẫu vào sáng sớm, khoảng 50mg mẫu lá được nghiền nhỏ trong ống Eppendorf với 200àl dung dịch đệm chiết mẫu 0,5M Tris - HCl, pH 6,8 Nghiền mẫu phải được tiến hành trong điều kiện lạnh, có thể thêm một ít cát thủy tinh vào mẫu nghiền để rút ngắn thời gian nghiền mẫu Dịch nghiền thô được ly tâm với tốc độ 6000v/p, ở 4oC trong 5 phút
Các isozym EST được phân ly trong gel polyacrylamide, với gel tách có nồng
độ 7,5% và gel cô có nồng độ 4,0% Quá trình điện di được thực hiện trong đệm điện cực 0,025M Tris; 0,192M glycine; pH 8,3 tại nhiệt độ 4 - 80C
Phân tích hoạt tính isozym EST được tiến hành trong dung dịch α - naphthyl acetate; β - naphthyl acetate; Fast Blue RR Salt; aceton; đệm phosphate (pH 6,3)
2.3 Phân tích số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần độc lập đối với mỗi mẫu Sự xuất hiện
ổn định (1) hay không xuất hiện (0) của mỗi băng trên phổ điện di isozym EST được sử dụng như là một đặc trưng để mô tả biến dị của mẫu cây phân tích Các băng điện di isozym EST còn được phát hiện ở độ đậm nhạt của chúng Sự đa hình các băng điện di isozym EST được đánh giá bằng tổng số loại kiểu hình điện di (zymotype) quan sát
được Phân tích nhóm UPGMA đã được tiến hành để ước lượng quan hệ giữa các mẫu phân tích Tất cả các phép tính toán và vẽ sơ đồ hình cây đã được xử lý trên máy vi tính sử dụng phần mềm PHYLIP Version 3.6a của Felsenstein (2002)
III Kết quả và thảo luận
3.1 Đa hình điện di isozym esterase (EST) của các mẫu nghiên cứu
Đa hình điện di isozym esterase trong các mẫu nghiên cứu đã được phát hiện sau điện di khi các gel được phân tích hoạt tính enzym trong hỗn hợp dung dịch nhuộm gồm cơ chất đặc hiệu và thuốc nhuộm màu
Vị trí các isozym trên gel quan sát thấy như là những băng nhuộm màu hồng sẫm ảnh chụp phổ điện di isozym esterase của dịch chiết từ mô lá non của một số mẫu cây đã phân tích được thể hiện ở hình 1
Phân tích phổ điện di đã được tiến hành dựa vào cường độ nhuộm màu và tốc độ di chuyển tương đối (Rf) về phía cực dương của các băng isozym Trên phổ điện di có thể dễ dàng nhận thấy rằng có ít nhất 12 băng isozym esterase có tốc độ di chuyển tương đối và cường độ nhuộm màu khác nhau
Sự biến dị được xác định dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện trên gel
điện di đồ của mỗi vị trí isozym Ngoài ra, sự sai khác về hoạt tính của cùng một vị
Trang 3trí isozym trong các mẫu phân tích cũng đ−ợc quan sát để so sánh biến dị của các cây có bộ NST khác nhau
NL5 NL4 NL3 NL2 NL1 QX3 NL10 NL9 NL8 NL7 NL12 QX2 ĐL1 AS3 QL7 YT4 QH10 AS12 NĐ9 QL1 CC9 NĐ3 QH7 QH2
Một số kiểu hình điện di isozym esterase trong các loài colocasia và xanthosoma đ−ợc minh hoạ trong hình 2
Băng Rf
1 0,91
2 0,88
3 0,86
4 0,83
5 0,81
6 0,78
7 0,72 8 0,68
9 0,65 10 0,58 11 0,50 12 0,45
C e C g Xa
Hình 2 Sơ đồ minh hoạ một số kiểu hình điện di isozym esterase trong các cây
colocasia esculenta (c.e), colocasia gigantea (c g) và xanthosoma (xa)
Băng di chuyển nhanh nhất (Rf = 0,91) quan sát thấy trong tất cả các cây khoai mùng xanthosoma nh−ng không quan sát thấy trong các cây khoai môn sọ colocasia
(+)
(-) Hình 1 Điện di đồ isozym esterase của một số mẫu nghiên cứu
(-) (+)
Trang 4Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR 35-41
Sự biến dị quan sát thấy trên điện di đồ ở vùng isozym gồm 6 băng di chuyển nhanh (vùng hoạt tính gần về phía cực dương) trong phổ điện di các cây colocasia với
5 kiểu hình: hai kiểu hình 2 băng có tốc độ di chuyển tương đối là Rf = (0,88, 0,86) và
Rf = (0,83, 0,81), một kiểu hình 3 băng (0,88, 0,86, 0,81), một kiểu hình 4 băng (0,88, 0,86, 0,83, 0,81) và một kiểu hình 5 băng (0,88, 0,86, 0,83, 0,81, 0,78) Tuy nhiên, ở các cây C gigantea thì chỉ thấy xuất hiện các băng Rf= 0,88 trong vùng này
Sự biến dị quan sát thấy ở vùng giữa của phổ điện di các cây C.esculenta (gồm 4 băng isozym di chuyển tương đối nhanh) với 5 kiểu hình điện di: một kiểu hình điện di 1 băng có tốc độ di chuyển tương đối là Rf = 0,72; một kiểu hình 2 băng (0,72, 0,68); hai kiểu hình 3 băng (0,72, 0,68, 0,65) và (0,72, 0,65, 0,58); một kiểu hình gồm tất cả 4 băng ở vùng này Băng điện di các cây C gigantea đơn giản hơn, chỉ có 2 băng ở vùng này và biến dị trong các cây C gigantea không phát hiện thấy Vùng này cũng quan sát thấy ít biến dị trong các cây khoai mùng (xanthosoma)
Có ít nhất 2 băng điện di isozym quan sát thấy ở vùng di chuyển chậm của các isozym (về phía cực âm) trong một số cây khoai sọ tam bội Biến dị cũng quan sát thấy ở vùng này
Theo Nguyen và cộng sự (1998), có ít nhất 4 locus esterase ở loài khoai môn lưỡng bội (c esculenta) trong đó có 3 enzym có cấu trúc monome và một enzym có cấu trúc dime
Kết quả quan sát thấy trong nghiên cứu này là tương tự với kết quả các nghiên cứu trước [2], [3], [4], [5] Các băng isozym xuất hiện ở vùng di chuyển nhanh
là phù hợp với kiểu hình điện di do một locus gen gồm hai alen quy định Các băng isozym xuất hiện ở vùng giữa là phù hợp với kiểu hình điện di do một locus gen gồm
3 alen quy định Tuy nhiên, số kiểu hình tại vùng này không biểu hiện đầy đủ như
so với các báo cáo trước (Nguyen và CS (1998), Huỳnh Thị Mỹ Linh (2003), Trong nghiên cứu này, chỉ có 5 kiểu hình (mà không phải 6 hay 8 kiểu hình tại vùng này)
đã được phát hiện Trong khi đó, kiểu hình 3 băng (0,72, 0,65, 0,58) chiếm đa số các mẫu cây phân tích
Với 17 kiểu hình điện di được quan sát trong tổng số 49 mẫu giống khoai môn sọ (c esculenta) cho thấy mức độ đa hình isozym EST là khá cao Tất cả các cây dọc mùng (C gigantea) thuộc cùng một kiểu hình điện di, các cây khoai mùng (xanthosoma) thuộc vào 3 kiểu hình điện di
3.2 Đa hình điện di isozym esterase và vấn đề phân loại các mẫu giống khoai môn sọ ở Nghệ An và Thanh Hoá
Dựa vào số liệu điện di đã phân tích với sự xuất hiện băng (1) và không xuất hiện băng (0), ma trận tương đồng di truyền (60x12) đã được thiết lập và khoảng cách di truyền giữa các cặp mẫu phân tích đã được tính toán để phân nhóm mẫu cây
Phân tích UPGMA dựa trên ma trận tương đồng đã được tiến hành Kết quả thu được biểu hiện trên biểu đồ hình cây ở hình 3
Trang 5∆ ◊ QH10
∆ ◊ QX3
∆ ◊ NC8
○ ◊ NC1
○ ● NC7
○ ◊ QL11
○ ● NL12
■ NĐ6
■ YT1
■ AS3
■ AS12
■ NL4
■ NL2
■ AS5
■ NĐ2
Hình 3 Biểu đồ hình cây thu đ−ợc bằng phân tích UPGMA dựa trên số liệu
isozym esterase các loài colocasia và xanthosoma
Trang 6Nguyễn Bá Hoành Đa hình điện di isozym esterase , TR 35-41
Kết quả phân nhóm trên biểu đồ hình cây cho thấy: Tất cả các cây khoai mùng (xanthosoma) được xếp trong một nhóm lớn, tất cả các cây dọc mùng (c.gigantea) đã hình thành một nhóm riêng Tất cả các cây colocasia esculenta nằm trong nhóm lớn nhất Kết quả này là phù hợp với các phân loại ở mức loài hiện nay dựa trên đặc điểm hình thái và kết quả phân nhóm dựa trên số liệu đa hình protein
dự trữ trong củ
Các cây phân tích điện di trong loài khoai môn sọ (C esculenta) đã được xếp trong 5 nhóm hình thành nên nhóm lớn của loài C esculenta
Trong các nhóm thuộc colocasia esculenta, các mẫu giống cây khoai mán (vàng từng) phân bố ở 4 trong 5 nhóm nhỏ cho thấy mức độ đa hình biểu hiện ở sai khác kiểu hình điện di là khá lớn Trong các nhóm này, hầu hết các mẫu cây có vùng thu thập gần nhau được xếp trong cùng nhóm Hai mẫu cây mang kí hiệu CC1 (khoai ấp) và CC3 (sáp vàng) thu ở Con Cuông (Nghệ An) đã hình thành một nhóm nhỏ có sai khác di truyền lớn hơn so với các nhóm còn lại, mặc dầu 2 mẫu cây này có mức bội nhiễm sắc thể khác nhau Tương tự như vậy, mẫu cây NL3 và NL8 (khoai mán) ở Ngọc Lặc - Thanh Hóa hình thành nhóm nhỏ độc lập, trong khi đó các mẫu cây khác thu từ Ngọc Lặc được ghép nhóm chung với các mẫu cây Khoai sọ của các vùng gần nhau Rất có thể, đây là những mẫu cây đặc trưng vùng đối với Nghệ An
và Thanh Hóa, cần có kế hoạch bảo tồn tại chổ để nghiên cứu tiếp
Biểu đồ hình cây cho thấy trong 5 nhóm của các giống thuộc C esculenta thì dạng khoai môn sọ tam bội phát hiện thấy ở 3 trong 5 nhóm Trong nhóm còn lại (NL3 và NL8), (NL11 và QL4) đều là những cây lưỡng bội Kết quả này phán đoán một sự tương tự về kiểu hình điện di của các khoai sọ tam bội với các cây khoai sọ lưỡng bội thuộc cùng nhóm
Theo báo cáo của Gottlied (1992) thì cây khoai môn sọ tam bội có kiểu hình
điện di phức tạp hơn các cây lưỡng bội, phán đoán nguồn gốc sai khác giữa các dạng lưỡng bội đã tạo ra dạng đa bội khác nguồn Cây tam bội có cùng kiểu hình điện di với cây lưỡng bội phán đoán nguồn gốc tự đa bội của các cây thuộc nhóm này Kết quả thu được trong nghiên cứu này cũng tương tự với báo cáo trước về sự đa dạng di truyền và nguồn gốc các Khoai môn sọ tam bội ở nước ta (Huỳnh Thị Mỹ Linh (2002), Trương Thị Thanh Mai (2003),…)
IV Kết luận
Đa hình điện di isozym esterase trong loài colocasia esculenta là tương đối cao với 17 kiểu hình điện di trong tổng số 49 mẫu giống Tất cả các cây dọc mùng (C gigantea) thuộc cùng một kiểu hình điện di, các cây khoai mùng (xanthosoma) thuộc vào 3 kiểu hình điện di
Mối tương quan nhất định đã được tìm thấy giữa đa hình điện di isozym EST với mức bội nhiễm sắc thể Sự giống nhau về kiểu hình điện di isozym EST của khoai môn lưỡng bội (2n=2x=28) với khoai môn tam bội (2n=3x=42) phán đoán nguồn gốc tự
đa bội của một số giống khoai môn tam bội từ dạng lưỡng bội trong loài
Trang 7Tµi liÖu tham kh¶o
[1] Lebot, V., K M Aradhya, Isozyme variation in taro (colocasia esculenta (L.) Schott) from Asia and Oceania, Euphytica 56 (1), 1991, pp 55-66
[2] Nguyen, V X., Isozyme variation and phylogenetic relationships in taro, colocasia esculenta (L.) Schott, and related taxa, Ph D Thesis, the Okayama University, Japan, 1998
[3] Nguyen, V X., H Yoshino, M Tahara, Genetic control of four enzymes in diploid taro, colocasia esculenta (L.) Schott, Breeding Science 48 (3), 1998, pp 273-280
[4] Nguyen, V X., H Yoshino, M Tahara, Phylogenetic analyses of taro (colocasia esculenta (L.) Schott) and related species based on Esterase isozymes, The Scientific Reports of the Faculty of Agriculture, Okayama University, Vol 87,
1998, pp 133-139
[5] Nguyen, V X., H Yoshino, M Tahara, Genetic analysis of 12 polymorphic isozyme loci in taro, colocasia esculenta (L.) Schott, Breeding Science, Sept 49(3),
1999, pp 179-185
[6] NguyÔn Xu©n ViÕt, BiÕn di isozym vµ mèi quan hÖ gi÷a c¸c d¹ng béi NST ë loµi khoai m«n, colocasia esculenta (L.) Schott, T¹p chÝ Khoa häc, Tr−êng §HSP Hµ Néi, Sè 1, 2002, tr.114-121
[7] Ochiai, T., V X Nguyen, M Tahara, H Yoshino, Geographical differentiation of Asian taro, colocasia esculenta (L.) Schott, detected by RAPD and isozyme analyses, Euphytica 122 (2), 2001, pp 219-234
Summary
Electrophoretic polymorphism of esterase isozymes of some species of the genus Colocasia and the genus xanthosoma
In this paper we mentioned the electrophoretic poly morphism of esterase isozymes of species of the genus colocasia and xanthosoma And then we showed the relationships between EST and surchrosome of colocasia basing on EST
(a) Khoa Sinh häc, Tr−êng §¹i häc Vinh
