Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản

ĐẶT VẤN ĐỀ Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có nhiều ưu điểm nổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn với các chủng vi khuẩn Gram (), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khả năng khuyờ́ch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhập vào được và có thời gian bán hủy lâu hơn. Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ và đạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụng đường tiêm như nhiều kháng sinh khác nờn rất dễ sử dụng. Chính vì thế trong vài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dưới nhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch. Tuy nhiên, cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng cao nhất. Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉ lưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime (cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờn nén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc). Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận về Cefixim, việc kiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở. Trong các dược điển BP 2008 và USP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC. Việc định lượng Cefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khả năng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chi phí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại. Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiên cứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểm như hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại. Cho đến nay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnh vực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu: 1. Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương. 2. Định lượng hoạt chất này trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường cũng như xác định nồng độ hoạt chất này trong mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị.

Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” là kết quả của quá trình

học tập và nghiên cứu của bản thân tôi tại trường Đại học Dược Hà Nội trongsuốt hơn hai năm qua Để có được kết quả cuối cùng này, tôi xin chân thànhcảm ơn các thầy cô tại trường đại học Dược Hà Nội, những người đã truyền đạtnhững kiến thức làm nền tảng cho tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An, người đã

dành rất nhiều tâm huyết, trí tuệ và thời gian giỳp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Phạm Thị Thanh

Hà, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất

cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Phương, người đã nhiệt

tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Phân tích - Độc chất trường Đại họcDược Hà Nội, trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm & Mỹ phẩm Hà Nội, phòngKiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trìnhthực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đó luụn động viên, khích lệ,giúp đỡ tôi tận tình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2009

Đỗ Lan Phương

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN 3

1.1.1 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản 3

1.1.2 Đặc điểm của điện di mao quản 4

1.1.3 Phân loại điện di mao quản 4

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM 5

1.2.1 Cấu trúc hóa học 5

1.2.2 Tính chất vật lý .5

1.2.3 Tác dụng dược lý và phổ tác dụng 6

1.2.4 Dược động học 6

1.2.5 Chỉ định 7

1.2.6 Thực trạng chất lượng của các chế phẩm chứa cefixim trên thị trường Việt Nam hiện nay 7

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM 9

1.3.1 Các phương pháp dược điển 9

1.3.2 Các phương pháp ngoài Dược điển 13

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG 16

1.4.1 Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction) .16

1.4.2 Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng 16

1.4.3 Phương pháp kết tủa protein 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Các chế phẩm có chứa cefixim 18

2.1.2 Mẫu huyết tương chứa cefixim 18

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 18

2.2.1 Chất chuẩn đối chiếu 18

2.2.2 Hóa chất, dung môi 19

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 19

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

Chương 3: KẾT QUẢ 23

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP 23

3.1.1 Khảo sát quy trình chiết cefixim trong huyết tương 23

3.1.2 Lựa chọn chất chuẩn nội 25

3.1.3 Xác định điều kiện điện di 26

3.1.4 Kết luận 32

3.2 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG CHẾ PHẨM 32

3.2.1 Xác định điều kiện phân tích 32

3.2.2 Xử lý mẫu 33

3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 34

3.2.4 Kết quả định lượng cefixim trong chế phẩm 40

3.2.5 So sánh kết quả phương pháp định lượng đã xây dựng với phương pháp HPLC (BP 2008) 43

3.3 XÁC ĐỊNH CEFIXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG 46

3.3.1 Xử lý mẫu huyết tương 46

3.3.2 Thẩm định phương pháp 46

Chương 4: BÀN LUẬN 56

4.1 VỀ ỨNG DỤNG CE TRONG KIỂM SOÁT ĐIỀU TRỊ 56

4.1.1 Độ nhạy 56

4.1.2 Hiệu ứng nền 56

4.1.3 Độ chính xác và độ lặp lại 57

4.2 VỀ QUY TRÌNH CHIẾT LOẠI BỎ PROTEIN TRONG HUYẾT TƯƠNG 57

4.2.1 Chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn 57

4.2.2 Loại protein trong huyết tương bằng dung môi hữu cơ 58

4.3 VỀ SO SÁNH 2 KỸ THUẬT HPLC VÀ CE VỚI PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT TRONG CHẾ PHẨM VÀ TRONG HUYẾT TƯƠNG 59

4.3.1 Trong chế phẩm 59

4.3.2 Trong huyết tương 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC

AUC : Diện tích dưới đường cong (Area Under Curve)

BP : Dược điển Anh (British Pharmacopoeia)

C max : Nồng độ thuốc tối đa (Maximum Concentration)

CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

CE : Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CPDASP : 3-[(3-Chlolamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulphonat

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perfomance Liquid

Chromatography)

IS : Chuẩn nội (Internal Standard)

LOQ : Giới hạn định lượng ( Limit of Quantification)

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

MEKC : Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic

Chromatography)

MeCN : Acetonitril

PA : Tinh khiết phõn tích (Pure for Analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SDS : Sodium dodecyl sulfat

S/N : Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

T max : Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

TLTK : Tài liệu tham khảo

USP : Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia)

Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản 4

Bảng 1.2:Một số thuốc cefixim bị đình chỉ lưu hành do không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng cefixim trong năm 2008, 2009 8

Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC 11

Bảng 1.4: Một số chương trình định lượng cefixim trong huyết tương bằng HPLC 14

Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim bằng điện di mao quản

15

Bảng 3.6: Xác định sự phù hợp của hệ thống điện di 34

Bảng 3.7: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định khoảng nồng độ tuyến tính 37

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 37

Bảng 3.9: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định độ đúng của phương pháp 39

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ đúng 39

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ lặp lại 40

Bảng 3.12: Kết quả định lượng cefixim trong viờn nộn 43 43

Bảng 3.13: Kết quả định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg 42

Bảng 3.14: Các bước tiến hành định lượng 43

Bảng 3.15: So sánh hai phương pháp HPLC và CE 45

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trong huyết tương .50

Bảng 3.18: Nồng độ tìm lại được của mẫu chuẩn cefixim tại các thời điểm trong ngày 51

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết 52

Bảng 3.20: Kết quả định lượng cefixim trên huyết tương thỏ 54

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di 3

Hình 3.2: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim pha trong huyết tương trắng tại các pH khác nhau: a) pH 6,0, b) pH 6,8, c) pH 9,0 28

Hình 3.3: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim tại các nồng độ đệm khác nhau: a) 10 mM, b) 20 mM, c) 30 mM, d) 50 mM 29

Hình 3.4: Phổ UV của cefixim 31

Hình 3.5: Điện di đồ mẫu trắng (Đệm phosphat 50 mM điều chỉnh đến pH 6,8 bằng acid phosphoric 0,1M) 35

Hình 3.6: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim và IS 35

Hình 3.7: Điện di đồ mẫu thử cefixim và IS 35

Hình 3.8: Điện di đồ của cefixim trong sự có mặt của các cephalosporin khác 36

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tỉ số diện tích pic 38

Hình 3.10: Điện di đồ thu được từ viờn nộn Fimabute 200 mg 41

Hình 3.11: Điện di đồ định lượng bột pha hỗn dịch Okexime 100 mg 42

Hình 3.12: Cefixim và IS pha trong hỗn hợp MeOH và đệm Natri phosphat 50mM, pH 6,80 ( tỷ lệ 2:8 theo thể tích) 47

Hình 3.13: Huyết tương trắng 47

Hình 3.14: Huyết tương trắng có pha chuẩn cefixim và nội chuẩn IS 47

Hình 3.15: Điện di đồ của cefixim trong sự có mặt của một số thuốc khác .48

Hình 3.16: Đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ số diện tích pic và nồng độ cefixim pha trong huyết tương trắng 48

Hình 3.17: Điện di đồ mẫu chuẩn cefixim nồng độ 1,0 àg/mL ở 283 nm 49

Hình 3.18: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 1h uống thuốc 55

Hình 3.19: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 2h uống thuốc 55

Hình 3.20: Điện di đồ mẫu huyết thỏ 1 sau 3h uống thuốc 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cefixim là thuốc kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có nhiều ưu điểmnổi bật so với các cephalosporin thế hệ trước đó như tác dụng mạnh hơn vớicác chủng vi khuẩn Gram (-), nồng độ tối thiểu có tác dụng thấp hơn, có khảnăng khuyờ́ch tán tới các cơ quan mà các cepholosporin khác khó thâm nhậpvào được và có thời gian bán hủy lâu hơn Đặc biệt cefixim rất dễ hấp thụ vàđạt được nồng độ điều trị trong máu bằng đường uống thay vì phải sử dụngđường tiêm như nhiều kháng sinh khác nờn rất dễ sử dụng Chính vì thế trongvài năm trở lại đây Cefixim đã được sản xuất, sử dụng nhiều ở Việt Nam dướinhiều dạng bào chế như viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch Tuy nhiên,cefixim lại là một trong những kháng sinh có tỷ lệ thuốc kém chất lượng caonhất Trong năm 2008 và 2009, rất nhiều biệt dược chứa cefixim bị đình chỉlưu hành vì không đạt tiêu chuẩn về hàm lượng như viên bao phim Massime(cefixim 200 mg, Ấn Độ), viờn nang Panazme (cefixim 200mg, Ấn Độ), viờnnén Kwangmyungcefex (cefixim 100mg, Hàn Quốc)

Hiện nay dược điển Việt Nam chưa có chuyờn luận về Cefixim, việckiểm nghiệm chỉ dựa trên tiêu chuẩn cơ sở Trong các dược điển BP 2008 vàUSP 32, cefixim được định lượng bằng kỹ thuật HPLC Việc định lượngCefixim trong huyết tương người bằng kỹ thuật này cũng đã được nghiên cứutrên thế giới cũng như ở Việt Nam Ưu điểm của kỹ thuật HPLC là có khảnăng tách tốt, độ lặp lại và độ chính xác cao, tuy nhiên có nhược điểm là chiphí cao, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất độc hại

Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tích hiện đại, đang được nghiêncứu và được đưa vào sử dụng tại nhiều nước trên thế giới với nhiều ưu điểmnhư hiệu lực tách cao, thể tích mẫu nhỏ, tốn ít dung môi, ít độc hại Cho đếnnay, tại Việt Nam, điện di mao quản vẫn là một kỹ thuật khá mới trong lĩnhvực phân tích và đang được nghiên cứu để ứng dụng vào thực tế

Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương bằng điện di mao quản” với mục tiêu:

1 Xây dựng một chương trình điện di phù hợp để định lượng cefixim trong chế phẩm và trong huyết tương.

2 Định lượng hoạt chất này trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường cũng như xác định nồng độ hoạt chất này trong mẫu huyết tương thỏ nhằm phục vụ công tác nghiên cứu kiểm soát điều trị.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN

Điện di mao quản (capillary electrophoresis: CE) là một kỹ thuật tỏch cỏcchất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các tiểu phân trong mao quảnchứa dung dịch chất điện ly nền dưới tác dụng của điện trường

1.1.1 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản [4], [6], [25], [37]

Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống điện di

Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm,đường kính trong 25 - 100 àm, đường kính ngoài 300 - 400 àm Sử dụng ápsuất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản Điện thế mộtchiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tỏch: cỏc chất phân tích đượcphát hiện nhờ một detector thích hợp khi di chuyển về một đầu mao quản.Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD Vịtrí phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ” Cửa sổ này có đượcbằng cách đốt đi một đoạn lớp bao polyimid để mao quản đó trở thành ốngthủy tinh trong suốt

1.1.2 Đặc điểm của điện di mao quản [4], [6], [25], [37]

- Có hiệu lực tỏch cỏc chất rất cao trong ống mao quản thủy tinh hoặcTeflon có đường kính trong 25 - 100 àm.

- Điện thế rất cao, thường từ 10 - 30 kV (200 - 500 V/cm) được đặt ở haiđầu ống mao quản

- Số đĩa lý thuyết của cột mao quản rất lớn, thường từ 105 - 106 nên cókhả năng tách rất tốt các mẫu chứa hỗn hợp phức tạp

- Thể tích mẫu tiêm rất nhỏ, cỡ 5 - 50 nl nên tiết kiệm mẫu

- Có rất nhiều kiểu CE nên khả năng ứng dụng vào thực tế rất đa dạng

- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặtcủa chất điện ly nền nên rất kinh tế và không độc hại

- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng khi phân tích số lượng mẫu lớn

1.1.3 Phân loại điện di mao quản [4]

Điện di mao quản có nhiều kiểu khác nhau Mỗi kiểu có cơ chế táchriêng Bảng 1.1 tóm tắt 4 kiểu điện di hay được sử dụng trong phân tích

Bảng 1.1: Các kiểu điện di mao quản

1 Điện di mao quản vùng

(capillary zone elctrophoresis)

Linh độ khác nhau của các chất (phụ thuộcđiện tích và kích cỡ ion)

2 Sắc ký điện động mixen MEKC

(micellar electrokinetic

chromatography)

Tương tác phân cực / không phân cực vớihạt mixen trong dung dịch và linh độ củachất

3 Điện di mao quản gel CGE

(capillary gel electrophoresis)

Linh độ của chất và tương tác loại cỡ vớihạt gel

4 Điện sắc ký mao quản CEC

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFIXIM

N N

S

H2N

O

OH O

3H2O

4 5 6 7

8

1 2

1 2

3 4

Hệ số phân bố octanol/nước của cefixim trihydrat là 0,0029

Theo [14] cefixim trihydrat có 3 hằng số ion hóa:

pKa1 = 2,10 do nhóm -COOH của cephem ở vị trí số 2,

pKa2 = 2,69 do nhóm -NH2 ở vị trí số 4 của nhóm amino-thiazol ,

pKa3 = 3,73 do nhóm -COOH của mạch nhánh gắn vào vị trí số 7

Cefixim trihydrat có 2 đồng phân Z và E trong đó đồng phân Z có phổ

hấp thụ cực đại ở 288nm, còn đồng phân E có phổ hấp thụ cực đại ở 233nm.

1.2.3 Tác dụng dược lý và phổ tác dụng [14]

Cefixim là kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được dùng theo đườnguống Nó có tác dụng diệt khuẩn do ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.Cefixim có phổ tác dụng đối vi khuẩn Gram âm rộng hơn so với kháng sinhcephalosporin thế hệ 1 và 2 Do bền vững cao với beta-lactamase nên nhiềuchủng vi khuẩn kháng penicillin và một số kháng sinh cephalosporin do tiết rabeta-lactamase vẫn có thể nhạy cảm với cefixim Cefixim có phổ tác dụng đối vi khuẩn Gram âm rộng hơn so với khángsinh cephalosporin thế hệ 1 và 2 Do bền vững cao với beta-lactamase nênnhiều chủng vi khuẩn kháng penicillin và một số kháng sinh cephalosporin dotiết ra beta-lactamase vẫn có thể nhạy cảm với cefixim

Hiệu lực lâm sàng đã được chứng minh trên nhiều bệnh nhiễm khuẩn gây

ra bởi những chủng gây bệnh phổ biến như: S pyogennes; S agalactiae, S pneumoniae; E coli; P mirabilis; K species; H influenzae; M.catarrhalis (kể cả những chủng tiết ra beta-lactamase); N meningitidis; N gonorrhoeae

(kể cả những chủng tiết ra penicillinase)

1.2.4 Dược động học [14]

Chỉ có khoảng 40-50% liều dùng cefixim được hấp thu qua đường tiêuhóa Thức ăn không ảnh hưởng tới tỷ lệ hấp thu mà chỉ làm chậm hấp thu Sựhấp thu cefixim qua đường tiêu hóa không bị ảnh hưởng bởi việc dùng đồngthời antacid Nồng độ đỉnh của cefixim trong huyết tương thay đổi tùy theodạng viên hay dạng hỗn dịch Nồng độ đỉnh trong huyết tương của dạng hỗndịch uống cao hơn 20-50% của dạng viờn nộn Diện tích dưới đường cong(AUC) của hỗn dịch uống cao hơn 10-25% của dạng viờn nộn Do đó thuốcviên và hỗn dịch uống không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg Ởngười trưởng thành khi uống cefixim dạng viờn nộn, nồng độ đỉnh trong huyết

tương đạt được là 2,0 - 3,0 àg/mL sau 2 giờ khi uống liều 200 mg và 4,0 - 6,5àg/mL khi dùng liều 400 mg.

Có khoảng 65 - 70% cefixim trong hệ tuần hoàn liên kết với proteinhuyết tương Sự phân bố của cefixim vào cỏc mụ và dịch cơ thể là có giới hạn.Cefixim được phân bố vào đờm, amidan, xoang hàm trên, tuyến tiền liệtnhưng đặc biệt có nồng độ cao trong mật Thể tích phân bố biểu kiến ở ngườilớn khỏe mạnh nằm trong khoảng từ 0,095 - 0,11 L/kg Thuốc qua được nhauthai nhưng không thấy bài tiết qua sữa mẹ

Thời gian bán thải của thuốc trong huyết tương (T1/2) từ 3-4 giờ ở ngườitrưởng thành có chức năng thận bình thường nhưng kéo dài hơn ở trẻ sơ sinh

và người bị suy thận

Khoảng 20% liều dùng (tương đương khoảng 50% liều hấp thu) được đàothải dưới dạng không đổi trong nước tiểu trong vòng 24 giờ Khoảng 60% liềukhông được đào thải qua cơ chế hoạt động của thận Probenecid ức chế thảitrừ cefixim qua ống thận làm tăng nồng độ và kéo dài T1/2 của cefixim tronghuyết tương

1.2.5 Chỉ định [14]

Cefixim được chỉ định điều trị với các nhiễm khuẩn sau đây gây ra bởicác vi khuẩn nhạy cảm:

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính,

- Nhiễm khuẩn đường niệu (có biến chứng và không biến chứng),

- Viêm niệu đạo do lậu cầu

1.2.6 Thực trạng chất lượng của các chế phẩm chứa cefixim trên thị trường Việt Nam hiện nay [11]

Theo ông Nguyễn Viết Hựng, Phú Cục trưởng Cục Quản lý dược ViệtNam, công tác quản lý chất lượng thuốc ở Việt Nam vẫn gặp không ít hạn chế

do trình độ, cơ sở vật chất, nhân lực kiểm nghiệm mỏng và sự lỏng lẻo trongkhâu quản lý

Thực trạng này khiến số lượng thuốc không đạt chất lượng được tung

ra thị trường vẫn chiếm một tỷ lệ khá cao và tỷ lệ thuốc không đạt tiêu chuẩnchất lượng bị thu hồi ngày càng gia tăng Nếu như năm 2001 chỉ có 55 loạithuốc không đạt chất lượng thì năm 2008, con số này tăng lên 99 loại Chủyếu là các dạng thuốc kháng sinh, các chế phẩm enzym Trong đó thuốckháng sinh cefixim chiếm số lượng đáng kể, đặc biệt là các thuốc có nguồngốc từ Ấn Độ, Hàn Quốc

Bảng 1.2: Một số thuốc cefixim bị đình chỉ lưu hành do không đạt tiêu

chuẩn về hàm lượng cefixim trong năm 2008, 2009

VN-8823-04 6003

2 Odazipin

(cefixime 200 mg)

FlamingoPharmaceuticals

VN-2008-06 PE01

6 Swetacefix

(cefixim 100mg)

Sweta PharmaceuticalPvt., Ltd Ấn độ

VN-3838-07 B180

1Ngày 01-10-2008, Sở Y tế Khỏnh Hòa đó ra công văn số 1872/SYT-QLD về việc tăng cường kiểm tra chất lượng thuốc chứa cefixim, yêu cầu các

cơ quan đơn vị trực thuộc chú ý đến chất lượng của các loại thuốc kháng sinh

cefixim đang lưu hành trên thị trường Điều đó cho thấy chất lượng của cácchế phẩm chứa cefixim đang là một vấn đề đáng được quan tâm

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM

1.3.1 Các phương pháp dược điển

a/ Phương pháp hóa học [22]

*Phản ứng tạo phức: Phản ứng của hydroxylamin với các dẫn chất hữu

cơ có chứa nhóm chức amin, amid, ester, hydrazid tạo ra acid hydroxamic,acid này phản ứng với ion Fe3+ trong môi trường acid tạo phức màu đỏ

Nhận xét: Phương pháp này nhanh, đơn giản nhưng chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố nên chỉ thích hợp cho kiểm nghiệm nguyên liệu

*Phổ cộng hưởng từ hạt nhân [20]

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc hạt nhân của một số nguyên tốtrong từ trường có thể bị phân thành các mức năng lượng khác nhau Sự hấpthụ một số bức xạ điện từ thích hợp làm thay đổi sự phân bố của chúng trongcác mức Bằng các biện pháp thích hợp người ta làm xuất hiện các tín hiệutương ứng với các nguyên tố đặc biệt trong nhóm chức, cũng như tương tácgiữa các nhóm chức

Hòa tan 0,05g Cefixim trong 0,5 mL hỗn hợp deuterated dimethylsulfoxid và H2O (4:1) Xác định phổ, dùng tetramethyl sulfoxid làm chấtchuẩn đối chiếu cho tín hiệu đơn bội A tại δ=4,7 ppm và cường độ tín hiệuđơn bội B tại δ= 6,5 ppm và 7,4 ppm ( tỉ lệ cường độ 2 tín hiệu 1:1)

Nhận xét: Phương pháp này có thể được ứng dụng trong cả định tính và

định lượng, có ưu điểm là không phân hủy mẫu và tốn ít thời gian.Tớn hiệucộng hưởng tỉ lệ với số hạt nhân cộng hưởng tại tần số đó cho phép xác định

tỷ lệ tương đối giữa các thành phần trong hỗn hợp Nếu có chất đối chiếu cóthể xác định được nồng độ các chất

* Đo năng suất quay cực [20]

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc một số chất có khả năng quaymặt phẳng của cỏc chựm tia phân cực đi qua nó Những chất như vậy đượcgọi là chất hoạt quang Các chất hoạt quang phải có ít nhất 1 cacbon bất đối.Góc quay cực của các chất lỏng hay dung dịch được đo bằng phân cực kế.Căn cứ vào góc quay cực đo được, so sánh với các chỉ tiêu nêu trong tài liệu ta

có thể định tính, thử tinh khiết và định lượng

Với Cefixim khi hòa tan 0,45 g cefixim trong NaHCO3 khan (tỉ lệ 1:50)

đo năng suất quay cực thu được [α]]D 20 : - 75 đến -88o, bề dày dung dịch 10 mm

Nhận xét: Phương pháp này tiến hành đơn giản, có thể ứng dụng để định

tính, thử tinh khiết và định lượng cefixim

*Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong hầu hết dược điển các nước đều đưa ra quy trình định lượng cefiximtrong chế phẩm Các dược điển đều dùng sắc ký lỏng pha liên kết C18 có chiềudài khác nhau trong pha động TBAOH có pH 6,5 được điều chỉnh bằng H3PO4

và MeCN Bảng sau trình bày 1 số phương pháp trong các dược điển:

Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC

(mL/phút) V mẫu λ Chuẩn nội TLTK

290 mL dung dịch A + 110 mL MeCNbằng pha động

Điều chỉnhsao cho thờigian lưu là 9phút

10 μll 254 nm

Acid naphtalensulfonic

300 mL dung dịch A + 100mL MeCNbằng pha động

Điều chỉnhsao cho thờigian lưu là 10phút

mL MeCN bằng pha động

1.3.2 Các phương pháp ngoài Dược điển

Bên cạnh các phương pháp chính thức quy định trong các dược điển chođịnh lượng Cefixim đã có nhiều phương pháp khác được sử dụng trong cáctiêu chuẩn cơ sở hoặc được công bố trờn cỏc sỏch chuyên khảo và tạp chí.Các phương pháp này được gọi chung dưới tờn cỏc phương pháp ngoài dượcđiển

*Vôn –Ampe [18]

Đây là một nhúm cỏc kỹ thuật phân tích điện hóa mà thông tin về chấtphân tích được lấy ra từ sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thếtrong quá trình điện phân dung dịch phân tích Sự phụ thuộc trên được biểudiễn dưới dạng đường cong von-ampe Đường cong này được xây dựng trên

hệ tọa độ E-I, I là cường độ dòng điện qua mạch điện phân, E là điện thế đặtlên hai điện cực

Phõn tích cefixim theo kỹ thuật Vụn-ampe trên nguyên tắc oxi hóacefixim và quá trình khuyếch tỏn cú kiểm soát phụ thuộc vào pH Dùng đệmphosphat pH 4,5 cho phép phát hiện cefixim nồng độ 6.10-6 đến 2.10-4 tronghuyết tương, 8.10-6 đến 2.10-4 trong nước tiểu và 6.10-6 đến 10-4 trong sữa

Nhận xét: Kết quả phân tích bằng phương pháp vụn-ampe thu được

tương tự như kết quả thu được bằng phân tích quang phổ UV Tuy cả haiphương pháp đều đơn giản, phương pháp vụn-ampe ưu điểm hơn do không bịảnh hưởng bởi hiệu ứng nền, có độ chọn lọc và độ nhạy cao hơn do có khảnăng pha loãng mẫu cao hơn Phương pháp này có thể ứng dụng trực tiếptrong phân tích các chế phẩm thuốc và dịch sinh học mà không cần phải phântách và xử lý mẫu phức tạp vì không bị ảnh hưởng bởi tá dược và các tạp chất.Phương pháp này cũn cú ưu điểm là rất nhanh chóng, chỉ mất dưới 5 phút chomột mẫu do đó đây là phương pháp phân tích tốt để phân tích cefixim trongchế phẩm và trong dịch sinh học và có thể dùng thay phương pháp HPLC

trong kiểm soát điều trị.

*Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Đây là phương pháp thông dụng nhất trong các nghiên cứu định lượngCefixim trong dịch sinh học do tính chất phổ biến của phương pháp và củathiết bị Do hàm lượng hoạt chất trong dịch sinh học rất thấp, mặt khác phảiloại protein ra khỏi mẫu trước khi phân tích nên so với phương pháp địnhlượng cefixim trong dược điển bằng kỹ thuật HPLC thì định lượng tronghuyết tương có một số khác biệt: nếu định lượng trong chế phẩm, pha động làhỗn hợp của MeCN và TBAOH, pH của pha động thường trung tính thì địnhlượng trong huyết tương, pha động thường là hỗn hợp của đệm phosphat vàdung môi hữu cơ (MeOH hoặc MeCN), pH của pha động thường acid

Bảng 1.4 trình bày 1 số quy trình định lượng cefixim trong dịch sinh học

bằng HPLC

STT Cột Pha động Lưu lượng

(mL/phút)

LOQ (àg/mL) Detector Chuẩn nội TLTK

7- hydroxycoumarin [30]

7- hydroxycoumarin [27]

Bảng 1.4: Một số chương trình định lượng cefixim trong huyết tương bằng HPLC

Đánh giá: Phương pháp này có ưu điểm là có độ chọn lọc cao, độ nhạy

cao nên có thể ứng dụng để định lượng cefixim trong dịch sinh học qua đónghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của các chế phẩm có chứaCefixim Tuy nhiên phương pháp này phải dùng dung môi, hóa chất đắt tiền,

và đôi khi phải xử lý mẫu tương đối phức tạp và mất nhiều thời gian

* Phương pháp điện di mao quản [19]

Định lượng cefixim trong dịch sinh học bằng phương pháp điện di maoquản chưa được nghiên cứu nhiều so với các phương pháp khác, mới chỉ có 1tài liệu nghiên cứu định lượng cefixim và các chất chuyển hóa của nó trongnước tiểu với một số chương trình sau:

Bảng 1.5: Một số chương trình định lượng cefixim bằng điện di mao quản

Điện thế (kV)

Lt = 75 cm

i.d = 50àm

Đệm phosphat 20 mM, pH 6,8chứa CDPAPS 0,15% (w/v) và

Đánh giá: Cefixim cũng như 5 chất chuyển hóa của nó đều có chứa

cỏc nhúm carboxyl do đó rất thân nước, nên rất khó chiết toàn lượng bằngdung môi hữu cơ Cũng vì thế mà sắc ký pha đảo không thể định lượng được

Nhưng với kỹ thuật CZE có thể tách và định lượng được các chất này, chothấy sự ưu việt của điện di trong định lượng cefixim trong dịch sinh học.

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG

Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinhhọc: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng-lỏng và chiết pharắn Tùy thuộc vào điều kiện của phòng thí nghiệm và đặc điểm của từng chấtphân tích để lựa chọn phương pháp phù hợp

1.4.1 Phương pháp chiết pha rắn (solid phase extraction SPE)[32], [36]

Đây là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau đó rửa giảibằng một dung môi thích hợp Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE là dẫn chấtpolysiloxan, polymer, tạo ra pha liên kết Ngoài ra còn sử dụng cả pha không liên kết.Một số cephalosporin được tách khỏi huyết tương trước hết nhờ hấp thụtrong chất rắn không phân cực như C18, C8 sau đó được rửa giải Trongphương pháp này, nếu tương tác giữa các cephalosporin và chất mang lớntương tác giữa cephalosporin và protein thì độ lặp lại có thể gần 100%

1.4.2 Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng [32], [36]

Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất

Trong thực hành chiết xuất, chất được chuyển từ pha nước vào pha dung môi có thể thuộc nhiều loại hình hóa học khác nhau như: Các acid, base hoặc các chất lưỡng tính; hợp chất nội phức; cặp ion

Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật được phổ biến để tỏch cỏc chất hữu cơ, loại cản trở phân tích Tuy nhiên cefixim là chất rất phân cực do có chứa cỏc nhúmcarboxyl nên rất khó chiết toàn lượng bằng dung môi hữu cơ

1.4.3 Phương pháp kết tủa protein [32], [36]

Đây là phương pháp đơn giản: không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại vàthời gian tách nhanh nên được chọn để xử lý mẫu trong giai đoạn thăm dòphương pháp phân tích Phương pháp này phải được khảo sát tỷ lệ cần dùngcủa tác nhân gây kết tủa protein Các tác nhân gây tủa protein thường sử dụngtrong quá trình xử lý mẫu bao gồm: acid, dung môi hữu cơ hoặc muối.

- Tủa bằng acid: Đơn giản nhưng chỉ phù hợp với các dược chất bềntrong môi trường acid và dễ tan trong nước Tác nhân gây tủa thường được sửdụng là acid percloric, acid tricloracetic, acid trifloracetic với nồng độ thôngthường khoảng 5 - 10%

- Tủa bằng dung môi hữu cơ: Hay dùng methanol và acetonitril

- Tủa bằng muối: Sử dụng amoni sulfat khan

Nhận xét: Vì cefixim tan tốt trong MeOH nên phương pháp này rất thíchhợp để loại protein khỏi huyết tương trong phân tích cefixim

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

trong 1 gói bột gồm cefixim : 100mg

2.1.2 Mẫu huyết tương chứa cefixim

 Huyết tương trắng của viện huyết học truyền máu trung ương đượcthêm cefixim các nồng độ khác nhau

 Huyết tương thỏ có dùng cefixim được lấy sau 1 thời gian nhất định saukhi dùng thuốc

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1 Chất chuẩn đối chiếu

 Cefixim: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế hàm lượng 98,88%tính theo chế phẩm khan Độ ẩm 10,57% Hàm lượng Ethanol 0,04% SKS:0105192

 Natri cefoperazon: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế hàmlượng 99,87% tính theo chế phẩm khan Độ ẩm 4,57%, SKS: 010687

 Natri diclofenac: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế

 Codein phosphat: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế

 Paracetamol: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế.

 Cefadroxil, cefotaxim: Chất chuẩn Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế

2.2.2 Hóa chất, dung môi

2.2.2.1.Hóa chất

 Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4.2H2O): PA (MERCK, Đức)

 Natri dihydrophosphat (NaH2PO4.2H2O): PA (MERCK, Đức)

 Natri tetraborat (Na2B4O7.2H2O): PA (MERCK, Đức)

 Trinatri citrat (C6H5Na3O7.10H2O) : PA (MERCK, Đức)

 Natri dodecyl sulfat (SDS): PA (ICN Biomedicals Inc)

Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H và Ultrasonic LC 30 (Elma, Đức)

Máy đo pH Metrohm và Eutech Instruments cho kết quả đến ± 0,01đơn vị pH (sai số ± 0,05)

Cân phân tích Sartorius GP1503P

 Máy ly tâm JOUAN B3.11 cho tốc độ quay tối đa 4000 vũng/phỳt

Máy lắc xoáy LABINCO L46

Tủ đá lạnh sâu -40°C ( bảo quản mẫu huyết tương), Sanyo MDF-236

Micropipet 10, 100, 1000 àL

Các loại dụng cụ thủy tinh có độ chính xác thích hợp

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng CZE phù hợp để có thể vừađịnh lượng hoạt chất trong chế phẩm vừa định lượng hoạt chất trong huyếttương Lựa chọn điều kiện điện di và thẩm định phương pháp Ứng dụng địnhlượng hoạt chất trong chế phẩm và trong huyờ́t tương của thỏ dùng thuốc

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng phương pháp để định lượng cefixim trong chế phẩm và tronghuyết tương, cụ thể là:

2.3.2.1 Lựa chọn điều kiện điện di

Phương pháp điện di được chọn ở đây là điện di mao quản vùng (CZE),

hệ thống máy điện di mao quản Hewlett Packard 3D CE, mao quản nungchảy do Agilent cung cấp có chiều dài l = 40 cm, đường kính trong id = 50μlm Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình điện di thíchhợp, cụ thể là:

 Xây dựng quy trình xử lý mẫu trong huyết tương

 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di

việc tiến hành sắc ký 6 lần khác nhau trên cùng một mẫu Sự tương thích của

hệ thống với phương pháp được thể hiện qua trị số RSD(%)

Tính đặc hiệu của phương pháp

Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích là khả năng của phương pháp

đó có thể xác định một cách chính xác, đặc hiệu chất cần phân tích và không

bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác trong mẫu thử Để đánh giá tínhđặc hiệu của phương pháp, tiến hành sắc ký với mẫu trắng, mẫu thử và mẫuchuẩn trong cùng điều kiện

Khoảng tuyến tính

Để đảm bảo sự chính xác của phép định lượng, xác lập mối tương quantuyến tính giữa nồng độ cefixim và tỉ số diện tích pic cefixim và chuẩn nội Mốitương quan đó được biểu thị bằng phương trình với các hệ số tương ứng và đồthị Việc xây dựng được tiến hành trên 5-7 nồng độ khác nhau của chất phân tích.Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tươngquan r phải không dưới 0,99

Độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành phân tích ở 3 mức nồng độ: thấp, trung bình và cao Ở mỗimức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của tỉ số diệntích pic cefixim và chuẩn nội Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị

độ lệch chuẩn tương đối RSD%

 Mẫu chuẩn: là dung dịch cefixim chuẩn có nồng độ xác định pha trong

Rc: tỉ số diện tích pic của cefixim và IS thu được của mẫu thờm chuẩn

Rx: tỉ số diện tích pic của cefixim và IS thu được của mẫu thử

Rr: tỉ số diện tích pic của cefixim và IS thu được của mẫu chuẩn

Khi thẩm định phương pháp trong huyết tương ngoài các tiêu chí trên tacòn thẩm định thêm các tiêu chí:

 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện (LOD, LOQ)

 Giới hạn phát hiện (LOD): Là giới hạn nồng độ thấp nhất để quá trìnhphân tích thu được tỉ số giữa tín hiệu pic và tín hiệu nhiễu đường nền S/N≈3

 Giới hạn định lượng(LOQ): Là giới hạn nồng độ thấp nhất để quá trìnhphân tích thu được tỷ số giữa tín hiệu pic và tín hiệu nhiễu đường nền S/N≈10

 Độ ổn định

Thực hiện phân tích mẫu huyết tương tại 3 nồng độ (thấp, trung bình,cao) trong huyết tương tại thời điểm ban đầu, sau 30 phút, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h

để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương tại mỗi thời điểm, từ đó đánh giá

độ ổn định của mẫu phân tích

 Hiệu suất chiết

Tiến hành phân tích song song mẫu cefixim trong huyết tương và trongđệm được xử lý trong cùng một điều kiện để xác định hiệu suất

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp được xây dựng sao cho có thể định lượng được đồng thời

cả cefixim ở trong chế phẩm và trong huyết tương Vì định lượng hoạt chấttrong huyết tương gặp khó khăn hơn trong chế phẩm do phải loại protein vànồng độ hoạt chất trong huyết tương rất nhỏ do đó chúng tôi ưu tiên khảo sátcác điều kiện điện di trong huyết tương sau đó thẩm định lại trong chế phẩm

3.1.1 Khảo sát quy trình chiết cefixim trong huyết tương [8], [9], [14], [24], [27], [30], [36]

Khảo sát qui trình chiết

Làm sạch huyết tương là bước cơ bản trong quá trình phân tích mẫu Mộtđiều quan trọng trong việc chuẩn bị mẫu huyết tương là loại bỏ các protein tantrong nước Các phương pháp thông dụng là chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn vàkết tủa protein Do cefixim là một chất rất phân cực, tan trong nước và lưỡngtính nờn rất khó chiết khỏi huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng-lỏngnhư với cefazolin, cephalothin, cefamandon, cefoxitin, cefuroxim, cefotaxim

và cefoperazon hoặc chiết bằng cách tạo cặp ion với muối amoni bậc bốn nhưvới cephalothin

Phương pháp kết tủa protein thường cho lượng thuốc tìm lại cao hơn sovới chiết lỏng-lỏng đối với các chất có độ phân cực cao Do đó mẫu được loạiprotein bằng cách kết tủa protein Tiến hành khảo sát kết tủa protein bằng một

số kỹ thuật thông dụng:

 Kết tủa bằng acid

Kết tủa protein bằng acid có ưu điểm hơn so với các phương pháp khác

đó là mẫu thu được sạch hơn do loại protein tốt hơn

Tiến hành kết tủa protein bằng một số loại acid : acid tricloracetic và acidpercloric cho thấy với acid percloric, hoạt chất bị phân hủy do đó không tìmlại được cefixim trong mẫu sau khi loại bỏ protein Khi chiết bằng acidtricloracetic 6% rất khó bốc hơi dung môi và làm khô, mặt khác nếu tiờm trựctiếp dịch chiết thì hình dáng pic không đẹp và giới hạn phát hiện rất cao.

 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Khảo sát chiết cefixim trong huyết tương bằng methanol, acetonitril vàhỗn hợp methanol và acetonitril

Khảo sát chiết cefixim bằng acetonitril ( tỉ lệ huyết tương: MeCN=1:2),đem mẫu sau khi xử lý đi phân tích thì nhận thấy đường nền thu được rấtnhiễu, có rất nhiều pic tạp xuất hiện chứng tỏ mẫu chưa được làm sạch, một

số pic tạp và cefixim không tách ra được khỏi nhau do đó phương pháp nàykhông phù hợp để loại protein khỏi huyết tương

Khảo sát chiết cefixim trong huyết tương với hỗn hợp MeCN: MeOHkhác nhau đều nhận thấy đường nền thu được nhiễu, có nhiều pic tạp, và khi

tỷ lệ MeCN quỏ lớn (gấp khoảng 10 lần MeCN) thì không còn phát hiệncefixim trong mẫu phân tích

Khảo sát chiết cefixim bằng methanol thì kết quả thu được khả quan nhất

do cefixim tan tốt trong methanol, mặt khác đường nền thu được đẹp, không

bị nhiễu và không xuất hiện nhiều pic tạp Mặt khác tiến hành khảo sát các tỉ

lệ thể tích huyết tương và methanol khác nhau nhận thấy tỉ lệ huyết tương:MeOH = 1:2 cho kết quả tốt nhất vì nếu tỉ lệ này là 1:1 thì vẫn còn nhiều pictạp còn nếu tỉ lệ này là 1:4 thì mẫu bị pha loãng quá nhiều dẫn đến LOQ vàLOD cao

Từ khảo sát trên ta có qui trình chuẩn bị mẫu như sau:

 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và các mẫu

Dung dịch chuẩn:

- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 1000 àg/mL: Cõn chớnh xác khoảng28,2 mg chất chuẩn cefixim vào bình định mức 25 mL, thêm MeOH lắc chotan, thêm MeOH cho đến vạch, đem lắc và siêu âm cho đồng nhất

- Pha các dung dịch chuẩn cefixim có nồng độ thấp hơn từ dung dịchchuẩn cefixim 1000 àg/mL : bổ sung cho đủ thể tích bằng hỗn hợp MeOH vàđệm phosphat pH 6,8 (tỷ lệ thể tích 2:8)

Mẫu chuẩn:

- Lấy 0,8 mL huyết tương trắng vào các ống nghiệm, thêm 100 àL dungdịch chuẩn, 0,1 mL IS được mẫu huyết tương có nồng độ mong muốn Đemlắc xoáy 0,5 phút cho phân tán đều

Mẫu trắng:

- Lấy chính xác 0,8 mL huyết tương, thêm 0,1 mL cefixim ở các nồng độkhác nhau và 0,1 mL chất nội chuẩn nồng độ 1 mg/mL, sau đó thêm chính xác2,0 mL MeOH Lắc xoáy 5 phút rồi đem ly tâm 10 phút (tốc độ 4000vũng/phỳt) Lấy dịch, lọc qua màng lọc 0,2 àm được dịch lọc đem điện di

3.1.2 Lựa chọn chất chuẩn nội

Dựa vào những điều kiện của chất chuẩn nội, chúng tôi lựa chọn chấtchuẩn nội trong nhúm cỏc kháng sinh cephalosporin bao gồm cephalexin,cefaclor, cefadroxil, natri cefoperazon, ceftriaxon, cefuroxim

Pha riêng biệt các dung dịch cephalexin, cefaclor, cefadroxil, cefixim,natri cefoperazon , ceftriaxon, cefuroxim chuẩn nồng độ 0,1 mg/mL bằngcách cân chính xác khoảng 50 mg chất chuẩn, thêm 3 mL methanol, thêmđệm vừa đủ 50 mL (dung dịch 1), sau đó hút chính xác 5 mL pha loãng bằngđệm tới 50 mL Lắc siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,2 àm

Pha dung dịch hỗn hợp bằng cách hút chính xác 5 mL ở mỗi dung dịch 1của mỗi chất vào bình định mức 50 mL, bù đủ thể tích bằng đệm Lắc siêu âm

10 phút, lọc qua màng lọc 0,2 àm

Tiến hành điện di các dung dịch riêng biệt và dung dịch hỗn hợp bằngchương trình điện di đã xây dựng

Nhận xét: Natri cefoperazon được tách hoàn toàn và có thời gian di

chuyển khá gần với thời gian di chuyển của cefixim Trong khi đó những chấtcòn lại hoặc khụng tỏch được ra khỏi cefixim hoặc không được phát hiện Do

đó chúng tôi chọn chất chuẩn nội dung để định lượng là natri cefoperazon

3.1.3 Xác định điều kiện điện di

Trong quá trình điện di có một số điều kiện được cố định:

Dung dịch đệm natri phosphat 50 mM pH= 6,8:

- Cân chính xác khoảng 780,1 mg muối natri dihydrophosphatNaH2PO4.2H2O vào cốc có mỏ khụ, dựng nước siêu tinh khiết hòa tan vàchuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước đến vạch rồi đem lắc và siêu

âm cho hòa tan đồng nhất

- Cân chính xác khoảng 890,0 mg muối dinatri hydrophosphat

Na2HPO4.2H2O vào cốc có mỏ khụ, dựng nước siêu tinh khiết hòa tan vàchuyển vào bình định mức 100 mL, thêm nước đến vạch rồi đem lắc và siêu

âm cho hòa tan đồng nhất Đem đo pH của 70 mL dung dịch muối NaH2PO4

bằng máy đo pH có khuấy từ, thêm dần dung dịch muối Na2HPO4 đến pH 6,80(hết khoảng 50 mL)

Pha các dung dịch đệm natri phosphat 10 mM, 20 mM, 30 mM pH 6,80cũng làm tương tự như pha đệm natri phosphat 50 mM pH= 6,80

Dung dịch đệm natri tetraborat 10 mM pH 9,0:

- Cân chính xác khoảng 381,4 mg natri tetraborat vào cốc có mỏ khụ,thờm nước cất siêu tinh khiết đến khoảng 80 mL, điều chỉnh pH về 9,00 bằngdung dịch HCl 0,1 M trên máy đo pH Chuyển vào bình định mức 100 mL,thêm nước đến vạch, đem lắc và siêu âm cho đồng nhất

Pha dung dịch đệm natri citrat 20 mM pH=6,0:

Cân chính xác khoảng 588,2 mg natri citrat vào cốc có mỏ khụ, thờmnước cất siêu tinh khiết đến khoảng 80 mL, điều chỉnh pH về 6,00 bằng dungdịch HCl 1 M trên máy đo pH Chuyển vào bình định mức 100 mL, thêmnước đến vạch, đem lắc và siêu âm cho đồng nhất

Xác định hệ đệm

Các điều kiện điện di được giữ cố định như trên và nhiệt độ chúng tôi đặttrong phương pháp là 25°C, chỉ hệ đệm là được thay đổi

Hệ đệm được khảo sát là hệ đệm phosphat có nồng độ phosphat 20 mM

và pH 6,8; hệ đệm borat 10 mM, pH 9,0; hệ đệm citrat 20 mM, pH 6,0 Dướiđây là điện di đồ ở các pH đệm

min 2.5 7.5 mAU 0 10 20 DAD1 A, Sig=200,4 Ref=off (KHOIDUOC5\24HTGCEFIXIM471.D)

pH=6,8 b)

min 2.5 7.5 mAU 0 15 25 DAD1 A, Sig=200,4 Ref=off (KHOIDUOC5\26HTGCEFIXIM491.D)

385 3.67

cefixim

pH=9,0 c)

3.1.3.2 Xác định nồng độ đệm

Đệm natri phosphat có pH 6,8 được khảo sát ở các nồng độ 10; 20; 30; 50

mM Hình 3.3 là điện di đồ của mẫu chuẩn cefixim ở các nồng độ đệm khác nhau

min 2.5 5 7.5 mAU

0 5 10 15 20 DAD1 A, Sig=200,4 Ref=off (KHOIDUOC5\24HTGCEFIXIM471.D)

20 mMb)