Kết quả nghiên cứu đã xác định được một số giai đoạn phát triển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH lần lượt diễn ra như sau: trứng chưa th ụ tinh, trứng một tế bào, trứng hai tế bào,
Trang 1T ẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009
Tr ần Quốc Dung
Tr ường Đại học Sư phạm, Đại học Huế
Tr ứng và tinh trùng của cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) được thành thục hoá
b ằng cách tiêm não thuỳ thể cá chép Phôi cá chạch giai đoạn một tế bào thu nhận từ sự thụ tinh nhân t ạo được sử dụng để vi tiêm Màng chorion của trứng thụ tinh được loại bỏ bằng enzyme tripsin tr ước khi tiêm gen hormone sinh trưởng người (hGH) Trứng sau khi tiêm được chuy ển vào trong dung dịch Holtfreter bão hoà 100% không khí ở 27 - 28ºC Sự mô tả quá trình phát tri ển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH chủ yếu dựa vào sự quan sát các đặc điểm hình thái và sinh lý c ủa phôi dưới kính hiển vi Kết quả nghiên cứu đã xác định được một số giai đoạn phát triển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH lần lượt diễn ra như sau: trứng chưa
th ụ tinh, trứng một tế bào, trứng hai tế bào, trứng bốn tế bào, trứng tám tế bào, trứng 32 tế bào,
tr ứng nhiều tế bào, thời kỳ đầu phôi vị, thời kỳ giữa phôi vị, thời kỳ cuối phôi vị, thời kỳ phôi
th ần kinh, thời kỳ bọc mắt, thời kỳ mầm đuôi, thời kỳ vây đuôi, thời kỳ cơ hiệu ứng, thời kỳ tim đập và thời kỳ nở
T ừ khoá: gen hormone sinh trưởng người, Misgurnus anguillicaudatus, sự phát triển
phôi, th ụ tinh nhân tạo, vi tiêm
1 M ở đầu
Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền
của cây trồng, vật nuôi nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp Trong công tác cải tạo giống cổ truyền, chủ yếu sử dụng phương pháp lai và chọn lọc để
cải tạo nguồn gen của sinh vật Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được qua lai tạo và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ hợp hai
bộ nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái Một hạn chế nữa là việc lai tạo
tự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong loài Lai xa, lai khác loài gặp nhiều khó khăn, con lai thường bất thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về số lượng
lẫn hình thái giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học giữa các loài không phù hợp với nhau Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ
hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên Nó
Trang 2cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào động vật, thực vật để tạo ra những giống
vật nuôi, cây trồng mới kể cả việc đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa gen của loài này vào loài khác [1]
Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu trên của công nghệ sinh học hiện đại, vào năm 1982 Palmiter và cộng sự đã chuyển được gen hormone sinh trưởng của chuột cống vào chuột
nhắt, tạo ra được chuột nhắt “khổng lồ” Từ đó đến nay, hàng loạt động vật chuyển gen
đã được tạo ra như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá mang những tính trạng ưu việt như
tăng trưởng nhanh, có khả năng chống chịu bệnh Bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection) người ta đã chuyển các gen định hướng vào phôi cá giai đoạn một tế bào và đã tạo ra hàng loạt cá chuyển gen (cá giếc, cá chép, cá vàng, cá medaka, cá
hồi…) [9, 10] Để làm chủ kỹ thuật tạo cá chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đưa gen hormone sinh trưởng người (hGH) vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) [1, 2, 3, 4, 5, 6] bằng phương pháp vi tiêm Phôi cá chạch chuyển gen hGH sau đó được quan sát sự phát triển cho đến khi nở
2 V ật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 V ật liệu nghiên cứu
Phôi cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh
trưởng người giai đoạn một tế bào
2.2 Ph ương pháp nghiên cứu
Trứng và tinh dịch cá chạch được chủ động thu nhận sau khi cá bố mẹ được thúc chín bằng tiêm não thuỷ thể cá chép và tiến hành thụ tinh nhân tạo [7] Phôi giai đoạn
một tế bào được đồng loạt tạo ra và được khử màng chorion bằng enzyme tripsin (Hình 1)
Vi tiêm được tiến hành trên máy vi thao tác Olympus (Narishige, Nhật Bản) qua các bước: chuyển phôi một tế bào vào buồng tiêm, gen hGH được nạp vào kim tiêm, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, giữ phôi vào đầu kim giữ bằng bằng lực hút
của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và bộ phận vi thao tác để đưa đầu kim tiêm vào vị trí đĩa phôi, vặn nhẹ syringe để chuyển gen vào phôi Vi tiêm gen hormone sinh trưởng người vào các phôi trần giai đoạn một tế bào Sau khi vi tiêm gen hormone sinh trưởng người, phôi được cho vào trong dung dịch Holtfreter (NaCl 3,5%; KCl 0,05%; CaCl2 0,1%; NaHCO3 0,2%) là dung dịch đẳng trương với phôi trần, bão hoà 100% không khí, tạo điều kiện cho phôi phát triển thuận lợi, vì phôi trần rất dễ bị
vỡ khi ấp ở môi trường nước do tác dụng nhược trương Phôi trần rất dễ bị tấn công bởi các tác nhân gây bệnh từ môi trường bên ngoài nên môi trường đưa phôi vào phải được
vô trùng
Sự phát triển của phôi được mô tả chủ yếu dựa vào sự quan sát các đặc điểm hình thái và sinh lý dưới kính hiển soi ngược Olympus, ở 27 - 280
C
Trang 33 K ết quả và thảo luận
a) Tr ứng chưa khử màng chorion b) Tr ứng đã khử màng chorion
Hình 1 Tr ứng cá chạch giai đoạn một tế bào được chụp dưới kính hiển vi (độ phóng đại 40x)
Sự phát triển của phôi cá chạch vi tiêm gen hormone sinh trưởng người được quan sát, mô tả thành một số giai đoạn Trước hết là giai đoạn trứng chưa thụ tinh (Hình 2.1) Đặc điểm của giai đoạn này là trứng trương nước, to ra, noãn chất phân bố đồng đều Trứng tiếp tục trương nước 15 phút sau thụ tinh, phôi chuyển sang giai đoạn trứng
một tế bào (Hình 2.2) Vào lúc này quan sát thấy đĩa phôi phồng lên dạng thấu kính lồi, noãn chất tập trung về một đầu, đĩa phôi bắt đầu lồi lên, độ thấu quang của trứng tăng lên Sự phân cắt lần thứ nhất xảy ra vào lúc 30 phút sau thụ tinh, chia đĩa phôi thành hai
tế bào có kích thước như nhau Đây là giai đoạn trứng hai tế bào (Hình 2.3) Sau giai đoạn trứng hai tế bào là giai đoạn trứng bốn tế bào: vào thời điểm sau thụ tinh khoảng
50 phút, xảy ra sự phân cắt lần thứ hai của phôi tạo thành trứng bốn tế bào (Hình 2.4)
Sự phân cắt lần thứ ba của phôi diễn ra vào lúc 60 phút sau thụ tinh hình thành trứng tám tế bào (Hình 2.5) Đến 1 giờ 10 phút kể từ lúc thụ tinh, phôi phân cắt lần thứ năm
tạo thành trứng 32 tế bào (Hình 2.6) Sự phân cắt tiếp tục xảy ra nhiều lần tạo thành phôi nhiều tế bào (1 giờ 15 phút sau thụ tinh) Đặc điểm nổi bật của giai đoạn này là kích thước tế bào ngày càng nhỏ so với các giai đoạn trước đó Phôi nang hình thành được quan sát thấy vào lúc 3 giờ 40 phút sau thụ tinh, với số tế bào phân chia nhiều không thể đếm được (Hình 2.7) Tiếp đến là thời kỳ phôi vị với ba giai đoạn: thời kỳ đầu phôi vị, giữa phôi vị và cuối phôi vị Thời kỳ đầu phôi vị (4 giờ sau thụ tinh) với đĩa phôi trùm xuống 1/2 khối noãn hoàng, xuất hiện vòng phôi (Hình 2.8) 4 giờ 40 phút sau thụ tinh, phôi phát triển chuyển sang thời kỳ giữa phôi vị, đĩa phôi trùm xuống 2/3
khối noãn hoàng, xuất hiện phôi thuẫn (Hình 2.9) Thời kỳ cuối phôi vị, 5 giờ 35 phút sau thụ tinh Lúc này đĩa phôi trùm xuống 4/5 khối noãn hoàng (Hình 2.10) Đến 7 giờ
30 phút sau thụ tinh, quan sát thấy ở phía lưng phôi thai có tấm thần kinh nổi lên Giai đoạn này được gọi là thời kỳ phôi thần kinh (Hình 2.11) Sau thời kỳ phôi thần kinh là
thời kỳ bọc mắt, quan sát được vào lúc 11 giờ 15 phút sau thụ tinh Dễ dàng phát hiện
thấy sự xuất hiện của một tổ chức mới là bọc mắt Sau đó, mầm đuôi của phôi hình
Màng chorion
Trang 4thành, có thể thấy rõ các đốt thân, 12 giờ 10 phút sau thụ tinh (Hình 2.13) Tiếp theo
thời kỳ mầm đuôi là thời kỳ vây đuôi (13 giờ 55 phút sau thụ tinh) Đặc điểm của giai đoạn này là vây đuôi xuất hiện, thân kéo dài (Hình 2.14) Đến 15 giờ 5 phút sau thụ tinh, quan sát phôi ở giai đoạn này thấy cơ bắt đầu co duỗi, đuôi dài thêm (thời kỳ cơ hiệu ứng) Thời kỳ tim đập, 18 giờ 25 phút sau thụ tinh, tim bắt đầu co bóp, rung động một cách tương ứng, phôi thể kéo dài (Hình 2.15, 2.16) 24 giờ sau thụ tinh, cá con vừa mới
nở
Sự phát triển của phôi cá chạch được chuyển gen hGH nhìn chung là giống với phôi cá chạch đối chứng không được chuyển gen Thời gian ấp nở của cả hai loại phôi đều là 24 tiếng [3] So sánh với kết quả nghiên cứu của Melvin Weisbart (1993) [8] trên
cá pupfish (Cyprinodon macularius), một loài cá sống chủ yếu ở nước lợ, phân bố ở phía Nam Sanora, Mexico và dọc theo bờ biển Salton ở California, Mỹ thì quá trình phát triển phôi trải qua các giai đoạn: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào (15 phút sau
thụ tinh), trứng hai tế bào (55 phút sau thụ tinh), trứng bốn tế bào (1 giờ 25 phút sau thụ tinh), trứng tám tế bào (1 giờ 50 phút sau thụ tinh)… và thời gian ấp nở là 108 giờ sau
thụ tinh Như vậy, thời gian để đạt các giai đoạn phát triển khác nhau cũng như thời gian
ấp nở của phôi cá cá chạch là ngắn hơn nhiều so với cá pupfish
4 K ết luận
Kết quả nghiên cứu đã xác định được một số giai đoạn phát triển của phôi cá
chạch (Misgurnus anguillicaudatus) được chuyển gen hormone sinh trưởng người lần
lượt diễn ra như sau: trứng chưa thụ tinh, trứng một tế bào, trứng hai tế bào, trứng bốn
tế bào, trứng tám tế bào, trứng 32 tế bào, trứng nhiều tế bào, thời kỳ phôi nang, thời kỳ đầu phôi vị, thời kỳ giữa phôi vị, thời kỳ cuối phôi vị, thời kỳ phôi thần kinh, thời kỳ
bọc mắt, thời kỳ mầm đuôi, thời kỳ vây đuôi, thời kỳ cơ hiệu ứng, thời kỳ tim đập và
thời kỳ nở
Trang 5Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3
Hình 2.6
Đĩ a phôi
T ấ m th ầ n kinh
B ọ c m ắ t Vòng phôi
Trang 6
Hình 2 M ột số giai đoạn phát triển của phôi cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) được
chuy ển gen hormone sinh trưởng người
1 Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) b ằng vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học
S ư phạm Hà Nội, 2001
2 Tr ần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường, Đặng
Hữu Lanh, Tinh sạch và đánh giá sơ bộ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào
cá vàng và cá ch ạch, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng Số 2, (1999), 39-44
3 Tr ần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh
tr ưởng người, Tạp chí Sinh học 21(3), (1999), 24-28
4 Nguy ễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Quyễn
Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người Báo cáo khoa h ọc Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9-10/12/1999, NXB Khoa
h ọc và Kỹ thuật, Hà Nội, (1999), 1429-1437
Vây đ uôi
M ầ m
đ uôi
Trang 75 Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Trần Quốc Dung, Kết
qu ả nghiên cứu khử màng chorion của phôi giai đoạn một tế bào chuẩn bị cho kỹ thuật
vi tiêm vào cá ch ạch Misgurnus anguillicaudatus Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học,
Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa h ọc và Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272
6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth hormone (MThGH) gene microinjection Proceedings, Third Asian Symposium of
Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12, (1997), 108-114
7 Chung Lân, Lý H ữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương (Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh
v ật học và sinh sản nhân tạo các loài cá nuôi, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội,
1969
8. Melvin Weisbart, Egg development: from gametes to embryonic development and hatching, Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 1-26
9. Patrick J Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications, Published by Singer, The Neitherlands, 2007
10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: method and mechanism,
Transgenic Fish, World Scientific, (1993), 93-119
INVESTIGATION OF THE DEVELOPMENT OF LOACH EMBRYO
(MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS) TRANSFERRED HUMAN GROWTH
HORMONE GENE
Tran Quoc Dung
College of Pedagogy, Hue University
SUMMARY
Eggs and spermatozoa of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were stimulated to mature by injection of carp pituitary The embryos at one-cell stage obtained by artificial fertilization were used for microinjection Before microinjection, the chorion membranes of the fertilized eggs were eliminated by tripsin After microinjected with human growth hormone gene (hGH), the eggs were incubated in Holtfreter solution with 100% air saturation at 27 - 28ºC The description of embryonic development of the loach transferred hGH gene was based on morphological and physiological features that can be readily observed under the inverted microscope in the living embryo The results show that the embryonic development of the loach includes the following stages: unfertilized ovum, one-celled egg, two-celled egg, four-celled egg, thirty two-celled egg, multiple-celled egg, balstula, early gastrula, intermediate gastrula, late
Trang 8gastrula, formation auditory placodes, formation of optic vesicles, development of dermal fin rays in the caudal fin, effected muscle, heart beat and hatching
Key words: embryonic development, human growth hormone gene, microinjection,
Misgurnus anguillicaudatus
