coli BL21, chúng tôi đã tiến hành chèn gene đích đã tinh sạch vào vector biểu hiện pET, sau đó chúng tôi đã tinh sạch vector tái tổ hợp, tiến hành biến nạp vào tế bào E.. coli BL21 và đã
Trang 1T ẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E COLI BL21
Tr ần Văn Giang
Tr ường Đại học Sư phạm, Đại học Huế
TÓM T ẮT
β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết β – 1,4-D galactoside trong phân t ử đường lactose thành glucose và galactose Để biểu hiện được enzyme này trong E coli BL21, chúng tôi đã tiến hành chèn gene đích đã tinh sạch vào vector biểu hiện pET, sau đó chúng tôi đã tinh sạch vector tái tổ hợp, tiến hành biến nạp vào tế bào E coli BL21 và đã biểu
hi ện được protein này ở nhiệt độ và pH thích hợp sau khi cảm ứng với IPTG
1 M ở đầu
β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-D galactoside trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá Trên thế giới, đã có một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase
từ Lactobacillus reuteri 103 [1] và Bacillus megaterium [2] Ở Việt Nam, Nguyễn Văn
Cách (2008) đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính
chất lý-hóa của nó [3] Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008)
đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis
G1 [4]
Nhiều người khi uống sữa có hiện tượng đau bụng và tiêu chảy do bị dị ứng với đường lactose trong sữa, đây là một dạng đường chủ yếu trong thành phần sữa Sau khi
uống sữa nếu bị khó tiêu, đầy hơi, sôi bụng hay tiêu chảy, đau bụng thì chắc chắn họ bị
dị ứng với lactose trong sữa Lactose khi vào đến ruột sẽ được thủy phân thành galactose và glucose nhờ vào enzyme lactase (β-galactosidase ở vi khuẩn) có ở thành
ruột non Trong trường hợp thiếu lactase, lactose không được thủy phân sẽ bị tống ra ngoài dưới dạng tiêu chảy Những người không tiêu hóa được lactose do họ thiếu lactase
bẩm sinh hoặc lactase bị thoái hóa từ thuở thơ ấu
Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về β-galactosidase có nguồn
gốc từ các sinh vật Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mới
dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này [3] Vì vậy, cần nghiên cứu biểu hiện β-galactosidase để làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme này và góp
phần giúp các nhà sản xuất sữa Việt Nam có thêm sản phẩm sữa dễ tiêu hóa
Trang 22 Nguyên li ệu và phương pháp
2.1 Nguyên li ệu và hóa chất
Chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp β-galactosidase đã được tuyển chọn Baccillus subtilis G1 [4] Vector pET22b(+) (Invitrogen) dùng để biểu hiện β-galactosidase trong E coli BL21 Các thiết bị và hóa chất để biểu hiện được Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công Nghệ
Việt Nam cung cấp
2.2 Khu ếch đại gen bằng PCR
Để khuếch đại gen mã hóa β-galactosidase của chủng Bacillus subtilis G1, sử
dụng mồi xuôi GalF: 5'-GCG GAT CCG GTG ATG TCA AAG CTT GAA AAA ACG C-3' và mồi ngược GalR: 5'-GCG CGG CCG CAT GTG TGT TTA CGA CAA T-3', được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa β-galactosidase B subtilis trên GenBank (mã số NC_000964), có bổ sung điểm cắt hạn chế BamHI và NotI để chèn vào vector biểu hiện pET-22b(+) Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm 10x PCR; 2 µl 2,5 mM dNTP; 2 µl 25 mM MgCl2; 1 µl (0,1µg/ml)DNA khuôn mẫu; 0,5 µl (5u/µl )Taq polymerase và 1 µl (10u/µl) mồi mỗi loại bổ sung nước cất đến thể tích 25
µl Phản ứng được thực hiện trong điều kiện: 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút,
54°C/1 phút, 72°C/1 phút; cuối cùng 72°C/10 phút
2.3 G ắn sản phẩm PCR
Phản ứng gắn sản phẩm PCR từ vector tạo dòng với vector biểu hiện gồm: 2 µl đệm gắn dính DNA T4 10x; 3µl DNA tinh sạch; 3 µl (0,5µg/ml) plasmid pET-22b(+)
cắt mở vòng; 1,5 µl (5u/µl) DNA T4 ligase; bổ sung nước cất đến thể tích 20 µl Hỗn
hợp phản ứng được ủ ở 22°C từ 30 phút đến 3 giờ hoặc qua đêm
2.4 Bi ến nạp vector biểu hiện vào E coli BL21
Phân đoạn DNA sau khi gắn vào vector pET-22b(+) được biến nạp vào tế bào
khả biến E coli BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học Một khuẩn lạc E coli BL21được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm 15
ml môi trường LB lỏng được tiếp giống với 150 µl dịch tế bào đã nuôi qua đêm Sau khi
tiếp giống, dịch này được nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút trong khoảng 2-3 giờ, đến khi OD600nmđạt 0,4 - 0,6 Sau đó dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 5 phút ở 4°C với 4000 vòng/phút Tủa tế bào được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô trùng đã để lạnh, ủ đá lạnh 30 phút và ly tâm như trên Tủa tế bào lại được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl2 vô trùng đã để lạnh, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 5 phút với
4000 vòng/phút Tủa tế bào được hòa vào 750 µl 0,1 M CaCl2 vô trùng, lạnh Dịch tế được chia nhỏ 50 µ ống Eppendorf 1,5 ml khử trùng, dùng biến nạp ngay hoặc bổ
Trang 3xong (hoặc tế bào khả biến ở -80°C đã giải đông), ủ 20-30 phút trong đá Hỗn hợp được gây sốc nhiệt 45 giây ở 42°C Sau đó được đặt ngay vào đá lạnh khoảng 2 phút rồi bổ sung 250 µl môi trường SOC lỏng đã khử trùng Sau khi ủ lắc hỗn hợp khoảng 60 phút
ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-250 µl dịch tế bào đã biến nạp plasmid được cấy trải trên đĩa thạch chứa ampicillin với nồng độ 0,1% (w/v), ủ qua đêm ở 37°C để cho khuẩn lạc
mọc và sàng lọc tiếp
2.5 Nuôi c ấy E coli và biểu hiện
Khuẩn lạc E coli BL21 tái tổ hợp được nuôi lắc qua đêm (200 vòng/ phút) trong môi trường LB lỏng có bổ sung 0,1% (w/v) ampicillin trong bình tam giác 25 ml Tiếp 1% giống vào bình tam giác 250 ml, lắc 200 vòng/phút Sau 2 giờ, dịch nuôi được cảm ứng bằng 1% (w/v) IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), tiếp tục nuôi và tiến hành lấy mẫu sau thời gian 1,5; 3 và 4,5 giờ ở 37°C Mỗi lần lấy 1 ml mẫu dịch nuôi
biểu hiện đã được cảm ứng Đối chứng là khuẩn lạc E coli BL21 không biến nạp Sau
đó, các mẫu được ly tâm thu cặn và hòa trong nước khử ion để tiến hành điện di kiểm tra Protein tổng số đo được sau khi biểu hiện theo phương pháp Bradford Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu
tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Nồng độ β-galactosidase được xác định
dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml
2.6 Điện di SDS trên polyacrylamide gel
Điện di biến tính protein trên polyacrylamide gel 12,5% theo Laemmli (1970) [5] Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ Sau đó, gel được rửa bằng dung dịch rửa (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) cho đến khi nền gel trở nên trong còn các băng protein xuất hiện màu xanh
3 K ết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1 Chèn gene β-galactosidase tinh sạch vào vector biểu hiện
Phân đoạn gen gal (β-galactosidase) và vector plasmid pET-22b(+) mở vòng
được tinh sạch bằng kit của hãng Invitrogen để sử dụng cho phản ứng gắn (Hình 1)
Dung dịch của phản ứng gắn được biến nạp vào E coli BL21 bằng phương pháp
sốc nhiệt, sau khi biến nạp, dịch tế bào được nuôi lắc phục hồi và trải lên đĩa thạch để nuôi cấy chọn lọc Plasmid tái tổ hợp được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di agarose Plasmid tái tổ hợp (pEGal) có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng pET-22b(+) (Hình 2) Hình ảnh điện cho thấy plasmid đối chứng (ĐC) chạy nhanh hơn các plasmid tái tổ hợp (1 - 4)
Trang 4Hình 1.Điện di phân đoạn gen gal (1) tinh sạch sau khi cắt ra khỏi vector nhân dòng và
pET-22b(+) (2) đã được tinh sạch M: DNA marker (1kb)
Hình 2 Vector bi ểu hiện
Hình 3 Điện di đồ plasmid đối chứng pET-22b(+) (ĐC)
và các plasmid tái t ổ hợp pEGal (1-4).
3.2 H ệ thống biểu hiện E coli BL21/pEGal
Để biểu hiện thành công gen ngoại lai cần phải có vector thích hợp Vector tái tổ
hợp pEGal (vector biểu hiện pET-22b(+) mang gen gal) được biến nạp vào chủng E coli BL21 b ằng phương pháp sốc nhiệt và hóa học, tạo ra hệ thống biểu hiện E coli
ịch tế bào E coli BL21/pEGal được thu sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng
2000
5000
500
10000 M
2
1 M
1 2 ĐC 3 4
Trang 5thụ của protein tổng số (trong đó cóβ-galactosidase) đo được trên máy quang phổ, đối chiếu với đồ thị chuẩn đã được xây dựng dựa trên BSA (Bovine serum albumin) để tính
ra nồng độ protein tổng số Nồng độ protein tổng số của các mẫu biểu hiện được thể
hiện qua bảng (1) Dựa vào nồng độ protein tổng số để tính toán hiệu suất thu hồi sau khi tinh sạch β-galactosidase
Bảng 1 cho thấy khi không cảm ứng IPTG thì hàm lượng protein tổng số ở các
chủng tái tổ hợp và đối chứng sai khác không đáng kể Nhưng sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng IPTG, hàm lượng protein tổng số ở chủng tái tổ hợp đã tăng lên rất nhiều Điều đó
chứng tỏ promoter của vector biểu hiện đã được cảm ứng và β-galactosidase đã được
tổng hợp Để khẳng định chắc chắn hơn, dịch nuôi cấy biểu hiện đã được điện di trên polyacrylamide gel
Bảng 1 Nồng độ protein của dịch nuôi biểu hiện
D ịch nuôi biểu hiện OD (TB) N ồng độ protein tổng số (µµµµl)
E coli
BL21/pEGal (0h)
E coli
BL21/pEGal (1.5h)
E coli
E coli
3.3 M ức độ biểu hiện β-galactosidase
Dịch tế bào thu ở các thời gian khác nhau sau cảm ứng được chạy điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide β-galactosidase tái tổ hợp đã được biểu hiện sau 1,5 giờ
cảm ứng bởi IPTG Sau thời gian 3 và 4,5 giờ, hàm lượng protein tăng lên không đáng
kể
Trang 6Hình 4 Điện di protein hòa tan tổng số của dịch nuôi cấy Các đường 4-6: chủng
BL21/pEGal sau 1,5; 3; và 4,5 gi ờ cảm ứng IPTG Các đường 1-3: chủng BL21/pE-22b(+)
sau 1,5; 3; và 4,5 gi ờ cảm ứng IPTG M: protein chuẩn.
Theo lý thuyết thì β-galactosidase có khối lượng phân tử khoảng 66 kDa Nếu được biểu hiện thì trên điện di đồ protein tổng số của chủng BL21/pEGal sẽ xuất hiện
băng có cùng khối lượng phân tử Kết quả của chúng tôi cho thấy ở các đường 4-6 có
băng to và đậm hơn các giếng khác đồng thời so với protein chuẩn thì thấy có khối
lượng phân tử của chúng cũng khoảng 66 kD điều đó chứng tỏ β-galactosidase tái tổ
hợp đã được biểu hiện trong chủng E coli tái tổ hợp BL21/pEGal
4 K ết luận
β-galactosidase (khoảng 66 kD) của vi khuẩn Baccillus subtilis đã được biểu
hiện trong chủng E coli tái tổ hợp BL21/pEGal Thời gian cảm ứng IPTG thích hợp là
1,5 giờ
TÀI LI ỆU THAM KHẢO
1. Nguyen TH, Splechtna B, Yamabhai M, Haltrich D, Peterbauer C., Cloning and expression of the β-galactosidase genes from Lactobacillus reuteri 103 in Escherichia coli J Biotechnol 129, (2007), 581-591
2. Li JM, Chiou CY, Lee TR, Chen YS, Shaw GC., Identification of a lactose-responsive element upstream of the promoter of Bacillus megaterium β-galactosidase-encoding gene mbgA Cur Microbiol 51, (2005), 31-34
3 Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Tách, tinh chế và xác định đặc tính c ủa β -galactosidase t ừ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3, Hội nghị Khoa học
35
66
45
18
25
Trang 7t ự gene mã hóa β -galactosidase t ừ chủng Bacillus subtilis G1, Hội nghị Khoa học toàn
qu ốc lần thứ IV: Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và Công nghi ệp thực phẩm Hà Nội Nxb Khoa học và Kỹ thuật, (2008), 691-694
5. Laemmli UK, Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, (1970), 680-685
RESEARCH ON THE EXPRESSION OF ββββ-GALACTOSIDASE IN STRAIN
E COLI BL21
Tran Van Giang College of Pedagogy, Hue University
SUMMARY
The β-galactosidase coding gene was isolated from Bacillus subtilis G1 and expressed
in E coli BL21 through pEGal vector (Invitrogen) after 1,5 h of 1% (w/v) IPTG induction Our results showed a β-galactosidase band of approximately 66 kDa occurred in 12,5% polyacrylamide gel
