Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA ppt

PCR polymerase chain reaction phản ứng chuổi polymerase bao gồm: 1- Biến dây đôi thành dây đơn 2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên dây template gọi là tiến trình annealing

CHƯƠNG VI CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA

Các khái niệm cơ bản

Việc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler)

và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu

đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như Taq

đã giúp cho Kary Mullis đoạt giải Nobel 1993.

PCR (polymerase chain reaction) phản ứng chuổi

polymerase bao gồm:

1- Biến dây đôi thành dây đơn

2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên

dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới.

3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)

Các khái niệm cơ bản

Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có

tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một

vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần

Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ

Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch

đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA

Taq (Thermus aquaticus)

• Taq là vi khuẩn có tính chịu nhiệt

• Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản

phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả

• Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo

ra sản phẩm PCR theo ý muốn

Deoxynucleotide triphosphate

• Hàm lượng deoxynucleotide trong khoảng

20 đến 200mM cho kết quả ổn định, trung thực, và chuyên tính

• Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai

mã di truyền nào đó

Magnesium chloride

Nồng độ Mg2+ có thể ảnh hưởng đến :

• Quá trình anneling của primer

• Nhiệt độ để tháo dây thành dây đơn

• Sự chuyên tính của sản phẩm PCR

• Hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả

PCR sẽ cần một hàm lượng Mg từ 0,5 đến 2,5mM ứng với hàm lượng tổng số dNTP

đã cho

Cặp mồi primer

RAPD: Chiều dài ngắn 10-16 mer

Ti thể, microsatellite dài 20-24 mer

Nồng độ cao không những không cần thiết

mà tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer

dimers, và hiện tượng priming nhằm

Nhiệt độ annealing

Td = 4 (G + C) + 2 (A + T) đối với primer có khoảng 20 oligonucleotide

Số base càng ít, nhiệt độ càng thấp, và ngược lại

Phản ứng dung dịch đệm

Tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả

về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR

Nồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi

nồng độ Mg2+ quá thấp (<0,5 µM), nó sẽ làm xấu

đi quá trình extension (kéo dài chuỗi mã đối lập với dây gốc), trong đó Mg2+ đóng vai co-factor của Taq polimerase

DNA template

Khi khuyếch đại vùng mục tiêu từ dây đơn DNA, số lượng của template được tính toán trên cơ sở mol Phép tính này giúp chúng ta xác định số lượng DNA cần phải

có, số chu kỳ để tổng hợp ra DNA với số lượng mong muốn

Tỉ lệ giữa primer : template

• Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimers sẽ xuất hiện, giống như trường

primer-hợp mẫu DNA quá loãng nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR không nhiều

• Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR,

đều dùng một nồng độ primer để tránh

hiện tượng primer-dimers

Ứng dụng cỏc CNSH trong Thủy sản.

Phương pháp Random Amplified Polymorphism DNA

RAPD: DNA đa hình khuyếch đại ngẫu nhiên

Phương pháp Restriction Fragment Length

Polymorphism RFLP: Đa hình chiều dài phân đoạn cắt hạn chế

Phương pháp microsatellite: Đa hình về số phân đoạn nucleotide ngắn (2-6) lặp lại ở một locus microsatellite

Phương pháp Amplified Fragment Length Polymorphism AFLP: Đa hình chiều dài phân đoạn khuyếch đại

Phương pháp Single Nucleotide Polymorphism SNP: Đa hình nucleotide đơn

- Nối kết và chuyển đổi

- Nuôi cấy khuẩn lạc

- Hybridise

- Phân lập plasmid

- Chạy trình tự

- Thiết kế primer

DOT-BLOT: microsatellite presence/density

ISOLATION, CHARACTERISATION, AND AMPLIFICATION OF MICROSATELLITE MARKERS:

PROTOCOL BREAKDOWN STRUCTURE

Test-Spread:

Transformed cell density Average insert size (PCR)

•Spread ligation mix on Petri dishes

•Replate two series of colonies on grid Petri dishes

low insert

ligation efficiency non-optimal colony density

Serie 2 Lift colonies onto Nylon membrane

Test-membrane:

Hybridise and estimate positive clone density

too few positive clones

Label oligonucleotide probes with digoxigenine

Serie 1 Store at 4°C

Entire membrane set:

•Hybridisation

•Locate and ID positive clones

•Mark colour intensity

•Estimate insert sizes of positive clones (PCR)

•Store clone collection at -80°C

Select positive clones with appropriate colour intensity and insert size

•Isolate plasmid (Miniprep)

Các phương pháp khác

Randomly amplified microsatellites (RAM)

• Sử dụng 5’anchor primer với trình tự CT, GA,

ATG, TG, GATA

• PCR

• Cloning với TA cloning kit (Invitrogen, USA)

• Cấy khuẩn lac

• Ly trích plasmid

• Chay trình tự

• Thiết kế primer

Thiết kế primer

• Nhiệt độ Tm (melting temperature) khác

nhau giữa primer forward và reverse

không quá 3 0 C.

• GC của primers là 50%.

• Chiều dài của primers từ 18 bp and 24 bp.

• Tận cùng của primer không nên là GGG,

CCC, TTT, AAA hoặc T

Tổng thể của ty thể

RAPD DNA đa hình khuyếch đại ngẫu

øng dông trong NTTS thÕ giíi:

• Ph©n lo¹i gièng loµi, b¶o tån quü gen (Capili ctv.; Sodsuk & ctv.)

• §¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn (Austin ctv., Sodsuk

& ctv.)

• BiÕn dÞ quÇn thÓ, vËt liÖu ban ®Çu chän gièng

(Moore, Kate ctv., Piamsak & ctv.)

• Ph¸t hiÖn t¸c nh©n g©y bÖnh (Lo & ctv.;Lightner

& ctv.; Fegan, Flegel & ctv.)

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta:

• Phân biệt giống loài, bảo tồn quỹ gen:

- Khác biệt lươn miền bắc-miền nam:

EST3 ở lươn miền nam

- Chép Trắng Việt nam khác chép Hung, Vàng Indonesia về kiểu Transferring:

AB, BB, BD, CC và DD

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta

(Tu n, 2004) ấ

• Vật liệu chọn giống cá Tra:

- Phân tích biến dị RAPD (31 primer), RFLP (20 enzyme giới hạn), microsattlite (10 primer đặc trưng cá tra)

mtDNA Phân tích trên 4 quần đàn cá tra: 3 quần đàn trại giống,1 quần đàn tự nhiên

- Kết quả:

+ Các quần đàn có đa dạng di truyền cao + Quần đàn tự nhiên đa dạng hơn cả.

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta:

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta:

• Phát hiện tác nhân gây bệnh tôm:

- Phát hiện sớm virus gây bệnh đốm trắng, đầu vàng tôm sú

- Phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh

- Đa hình virus gây bệnh: tương đồng cao về trình tự

nucleotide ở virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi tại các vùng khác nhau

• Tạo kháng thể phòng bệnh:

- Tạo kháng thể lòng đỏ trứng phòng bệnh ở tôm sú

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta

• Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra:

- Phân tích đa hình AFLP, sử dung 69 cặp mồi

- Phân tích trên 2 nhóm cá kích thước lớn và kích thước nhỏ

- Số băng có độ chênh lệch >50%: 4

- Số băng chênh lệch >50% tái lặp được: 3

- Giải trình tự 3 băng tái lặp: AFLP1, AFLP2 & AFLP3

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta

• Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra:

AFLP1, đại diện nhóm cá nhỏ, có độ dài 113bp.

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta:

• Trợ giúp chọn giống sinh trưởng cá tra:

- Giải trình tự Intron 1 ở gen điều khiển

GH

- So sánh đột biến nucleotide ở 2 nhóm cá lớn, cá nhỏ

- Đa hình RFLP với AlwNI, BsmAI và

MboII

- Cá lớn cắt BsmAI: 95%(118/124)

- Cá nhỏ không cắt BsmAI: 78% (92/118)

Nghiên cưú ứng dụng ở nước ta:

• Trợ giúp chọn giống màu thịt cá tra:

- Phân tích RAPD: 10 primer

- mtDNA-RFLP: 16 enzyme giới hạn

- Microsattlite: 10 primer đặc trưng cá tra

- Khác biệt về tần số, không thấy chỉ thị đặc trưng theo màu thịt

MiÒn B¾c MiÒn Nam

(Hình thái học: NIMPE; QIMPE; Xác định phân tử: IBT)

INFECTION RATE OF CLONORCHIS

SINENSIS AND OPISTHORCHIS VIVERRINI

C¸ ao nhµ s½n cã cho mãn gái

ChÕ biÕn gái b»ng c¸ch th¸i nhá

Nhậu và thói quen ăn gỏi cá phổ biến ở nhiều địa phương

Gen ở nhân và ở ty thể trong tế bào

Nuclear genome

Only one copy in an animal cell Linear chromosomes

double-stranded DNA hundreds of megabase pairs (Mb) located in nucleus

Mitochondrial genome

Many copies (hundreds) dispersed

in a cell; located in cytoplasm Circular double-stranded DNA 13-20 Kb (animals); up to 40 Kb (plants) 12-13 protein encoding genes

Products involve in ATP production

22 tRNAs and 2 ribosomal RNAs

Vùng địa lý dự đoán có sự

tồn tại của cả 2 loài C sinensis

và O viverrini ở Việt Nam

C sinensis

O viverrini

Quảng Bình Quảng Trị Thừa Thiên Huế

• To construct protocol to analyze genetic

divergences of snakeheads using RAPD

technique

• To detect genetic variation among snakehead

species in Malaysia including C marulioides, C melasoma, C lucius, C gachua, C micropeltes,

C striatus

• To detect genetic populations of snakehead (C

striatus) in Eastern (Terengganu), Western

North (Perlis), Center (Perak) and South (Johor)

of Peninsular Malaysia.

Material and Method

Material and Method

Results and Discussions

Flesh was preserved

3 Pipette into the DNeasy mini column

Centrifuge at ≥ 6000 x g for 1 min

4 Add 500 µ l buffer AW1 and centrifuge for 1 min at ≥ 6000 x g for 1 min.

min.

6 Pipet 200 µ l buffer AE Incubate at RT for 1

≥

Results and Discussions

Reactions: 25 µ l reaction mixture containing 1X PCR buffer (Biotools), 5 mM MgCl2, 5 pmoles primer, 0.2 mM dNTP (Biotools), 1 unit of Taq polymerase (Biotools), and 25 ng of genomic DNA

Amplify: 5 min initial denaturation at 94 0 C

35 cycles of 1 min denaturation at 94 0 C, 1 min low stringency annealing at 36 0 C, 1.5 min

primer extension at 72 0 C

Final extension for 5 min at 72 0 C

7 µ l of PCR + 3 µ l dye loaded in 1.7% agarose gel and electrophoressed at 55V in 1X TBE buffer for 2hrs Stained in ethidium bromide for 30 min and washed in distilled water for 15 min

Results and Discussions

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M

M 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 1000bp

1000bp

DNA patterns of 6 snakehead species amplified by

OPA3 Lane M: DNA ladder 100bp, 1-5: Channa striata, 6-10: C.marulioides, 11-15: C.lucius, 16-20: C.gachua,

21-25: C.micropeltes, 26-30: C.melasoma

Results and Discussions

Results and Discussions

Population

Terengganu

Perlis Perak

Johore

populations

Results and Discussions

Results and Discussions

Species

populations

C.striata C.melasoma C.gachua C.micropeltes C.marulioides C.lucius

Materials and Methods

DNA patterns of 6 snakehead species amplified by 16rRNA Lane M: GeneRuler 100bp DNA ladder, 1-4:

Channa striata, 5-8: C.marulioides, 9-12: C.lucius,

13-26: C.gachua, 17-20: C.micropeltes, 21-24: C.melasoma

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M

500bp

16S rRNA sequence of Channa striata

Results

Transition/transversion ratio versus corrected (Kimura 2-parameter)

genetic distance.

Results

81/79/84

Phylogenetic relationships of 16S rRNA gene for snakehead species in Malaysia Bootstrap is given at each node for neighbor joining/maximum likelihood/

maximum parsimony algorithm

C.lucius C.gachua C.striatus C.melasoma

C.marulioides C.micropeltes

91/89/92 85/82/87

95/95/95