Phương pháp định lượng vi khuẩn pdf

Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào thuốc nhuộm, chất kháng sinh, muối kim loại nặng, một số e

3.1: Cơ sở lý luận của phương pháp cố định tiêu bản và nhuộm tế bào:

Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển

vi quang học là phương pháp không thể

thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi

khuẩn.

 Thành tế bào (Cell wall)

Thành tế bào còn gọi là vách tế bào,

chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất

định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất

lợi

 Nồng độ đường muối bên trong tế bào

thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất

thẩm thấu tương đương với dung dịch

glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá

nhiều nước từ bên ngoài vào Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá

vỡ Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau:

Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của

O hoặc ít

5-20 0 20 Cao

Vách vi khuẩn Gram dương có thành phần

cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn

gọi là glucopeptit, murein, chiếm 95 % trọng

lượng khô của thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh

tế bào thành mạng lưới Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N- acetylglucozamin, N-

acetylmuramic và galactozamin Thành tế bào

vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp

(chiếm >50% trọng lượng khô của thành)

Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào.

 Vách vi khuẩn Gram âm có thành tế bào với

cấu trúc phức tạp, ngoài cùng là 2 lớp

lipopolysaccharit có đan xen với các phân tử protein Các protein này đã được chứng minh

là có khả năng chống lại sự tấn công của các

vi khuẩn khác Thành tế bào cho phép các

chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể

ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, chất kháng

sinh, muối kim loại nặng, một số enzym phân giải…)

 Tính chất nhuộm màu của vsv là khả năng của

chúng có thể giữ lại các chất có màu (thuốc

nhuộm) Tính chất đó có mối liên hệ chặt chẽ

với thành phần hoá học và các tính chất hoá-lý Màu và khả năng của các chất nhuộm

(chromogene) được xác định bởi các nhóm hữu

cơ trong phân tử của nó Các nhóm này tham gia vào các mối liên kết hoá học với các gốc khác

nhau trong thành phần hoá học của vsv và được giữ lại, biến đổi màu của vsv Các chromogene

khi phân cực và tạo thành các cation hay anion

có màu Trong thực tế vsv học người ta sử dụng

fucsin, Crystal violet, Xanh metylen… tham gia

nhuộm màu là các nhóm amin Trong các thuốc nhuộm khác, tính chất này được thực hiện bởi các nhóm OH-

 Khi vsv có chứa các phức chất của protein,

nucleoproteid có tính acid, vsv bắt màu mạnh với thuốc nhuộm có tính kiềm Chính vì vậy, vsv trong giai đoạn phát triển, với hàm lượng nucleoproteid cao rất dễ bắt màu

 Các tế bào sống bắt màu yếu, vì các dung dịch

có màu khó đi qua thành tế bào Đó là lý do tại sao người ta thường tiêu diệt vsv và cố

định tiêu bản bằng nhiệt hoặc hoá chất.

 Các bào tử của vsv, đặc biệt là của một số vi khuẩn rất khó nhuộm màu Người ta phải

nung nóng tiêu bản và sử dụng thuốc nhuộm

ở nồng độ cao (đậm đặc hơn).

 Nguyên tắc nhuộm Gram :

- Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất

và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh

và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.

- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên

màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương.

- Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ

sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.

 3.2 Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học

Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi

quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của

vsv có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu

bản.

Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có

ion mang màu là các cation (mang điện tích dương)

Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình

hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung

quanh vật được nhuộm.

Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene

blue, crystal violet, fuchsin

 +Phương pháp nhuộm Gram

Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước:

-Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal violet)

trong khoảng 1 phút Rửa bằng nước.

-Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%) trong 1phút, rửa lại bằng nước.

-Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton 1:1) hoặc cồn 96 0 trong khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng

nước,

-Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía) hay

safranin (đỏ vàng) để 1 phút, rửa nước, để khô tự nhiên sau

đó soi dưới kính hiển vi.

Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung

môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod Kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod,

do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.

1 Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)

 Vật liệu, hoá chất:

 · Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):

 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%

 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất

 Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong

lọ tối, sử dụng vài tháng.

 · Dung dịch Iod:

 Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali

iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản trong lọ tối.

 · Dung dịch tẩy màu:

 Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.

 · Dung dịch nhuộm bổ sung:

 Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.

 Các bước tiến hành:

· Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ

thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

· Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.

· Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

· Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

· Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

· Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước,

để khô trong không khí

· Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.

 Kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.

2 Nhuộm tiên mao

· Dung dịch B: 2 g AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể

riêng Nhỏ dung dịch NH4OH đậm đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho đến khi tan hết tủa Lấy 10ml AgNO3 đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết váng thì thôi.

· Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn

rồi mới sử dụng.

 Các bước tiến hành:

· Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về

một phía, làm khô trong không khí

· Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.

· Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất

· Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước Nhuộm bằng dịch B

trong 30-60 giây Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất.

· Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.

 Kết quả:

Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm, tiên mao bắt màu nâu.

3 Phương pháp nhuộm âm bản

· Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính.

· Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí

· Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1

4 Phương pháp Đỏ Congo

 Vật liệu, hoá chất:

· Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước

· Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước

· Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh

· Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl

· Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô

· Soi kính: dùng vật kính dầu 100´.

 Kết quả:

Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu

 1 Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi

 Sử dụng buồng đếm (Bürker, Neubauer, Thomas) để đếm tế bào vi khuẩn.

Nguyên tắc chung: Đếm số lượng tế bào vsv có trong một đơn vị thể tích

của phòng đếm, từ đó suy ra số lượng tế bào có trong 1ml dung dịch,

nhân với độ pha loãng để biết số tế bào có trong dung dịch ban đầu.

 Buồng đếm Neubauer: Là một phiến kính đặc biệt, trên bề mặt chia thành các ô vuông nhỏ, cạnh ô vuông nhỏ là 1/20mm, khoảng cách giữa phiến kính và lá kính 0,1 mm Ta nhỏ lên buồng để đếm một giọt huyền phù chứa vi khuẩn muốn đếm, đậy lá kính lại khi đó ta có thể tích mỗi ô nhỏ là: 1/10 x 1/20 x 1/20mm3=1/4000mm3.

 Gọi độ pha loãng của dung dịch vi khuẩn cần đếm là K, trung bình số

vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ là A (ta đếm vài ô lớn, sau đó lấy trung bình

số vi khuẩn trên mỗi ô nhỏ), khi đó số vi khuẩn có trong 1ml dung dịch là N:

 N=A x 4 x 106 x K (số tế bào/1ml)

 Phương pháp này cho kết quả nhanh, tuy nhiên không thể phân biệt được tế bào vi khuẩn sống và tế bào vi khuẩn chết Hơn nữa tế bào vi khuẩn rất bé nên việc đếm dưới kính hiển vi là không dễ dàng

(Phương pháp này chủ yếu áp dụng cho những tế bào không cần

nhuộm màu).

Đếm vi khuẩn đã nhuộm: Nhỏ một thể tích nhất định của huyền phù muốn đếm lên một diện tích nhất định trên phiến kính, cố định và nhuộm màu, thường là với xanh metylen hoặc với màu phù hợp với vi khuẩn ấy Sau đó, đếm số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích.

 2 Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc trên đĩa thạch)

 Phương pháp pha loãng

 Dùng dung dịch cần đếm vi khuẩn pha loãng ở các độ liên tiếp nhau, theo cơ

số 10, thông thường lấy vi khuẩn đã pha loãng ở ba nồng độ liên tiếp thích hợp với từng loại vi khuẩn Đảm bảo có thể đếm được khuẩn lạc, ít nhất là có hai ống có thể nhìn thấy khuẩn lạc.

 Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (cfu-colony forming units) Khi có số

khuẩn lạc ta tính toán như sau:

 Số lượng tế bào/ml = a x K: V

a: số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa thạch có cùng độ pha loãng

V: Thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa thạch (ml)

K: độ pha loãng tương ứng của dịch được cấy.

Phương pháp này nó cho phép đếm được số tế bào sống có trong 1ml dung dịch.

Pha loãng mẫu

Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc)

- Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật

MPN (Most Probable Number):

Phương pháp MPN là phương pháp có thể thay thế phương

pháp đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu,

phương pháp này được dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Mỗi

độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần trong các môi trường lỏng đã được chọn, thông thường phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại

mỗi nồng độ pha loãng Các độ pha loãng được tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho dấu hiệu dương tính và một

số lần cho dấu hiệu âm tính Số lần lặp lại cho dấu hiệu dương tính

và âm tính được ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ được giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu Qui trình MPN

cho giá trị số lượng vi sinh vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật trong mẫu khi sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn

Phương pháp MPN để định lượng vi sinh vật cho

đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui

trình dễ dàng và tốn ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn Trong nhiều trường hợp qui trình MPN được thiết lập sao cho gia tăng số lượng lần lặp cho kết quả dương tính bằng tín hiệu phát triển của vi sinh vật Trong một số trường hợp khác, qui trình

được thiết lập có nhiều thử nghiệm khẳng định sau

khi các lần lặp lại ở các độ pha loãng cho tín hiệu phát triển của vi sinh vật như phát hiện protein hay một

emzym nào đó Các thử nghiệm sau này cho kết quả dương tính thì các lần lặp lại ban đầu mới được khẳng định là dương tính Cũng giống như qui trình đếm

khuẩn lạc, qui trình MPN cũng được sử dụng các môi trường chọn lọc, không chọn lọc hay môi trường phân biệt

Cũng giống như qui trình đếm đĩa, trong phương pháp MPN, môi trường và nồng độ nuôi cấy cũng

được điều chỉnh để chọn lọc cho một nhóm vi sinh vật hay phân biệt các nhóm vi sinh vật này với các nhóm vi sinh vật khác với các đặc điểm mong muốn,

rỏ ràng rằng sự kết hợp giữa điều kiện nuôi cấy và môi trường cũng có thể định lượng những nhóm vi sinh vật đặc biệt nào đó theo định nghĩa cụ thể Mỗi qui trình phải được chọn lọc một cách cụ thể và cẩn thận để có thể thu được kết quả một cách chính xác

thực chất con số MPN biểu diển số lượng vi sinh vật trong mẫu là số lượng trung bình sau các lần lặp lại Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu lớn thì sự khác

biệt của các mẫu giữa các lần lặp lại là nhỏ, kết quả

riêng lẻ của tất cả các lần lặp gần với kết quả trung

bình Nếu số lượng vi sinh vật trong mẫu nhỏ, sự khác biệt này sẽ lớn Nếu trong một mẫu chất lỏng chứa 100

vi sinh vật/100 ml, thì trong 10 ml mẫu sẽ chứa trung bình 10 tế bào Dĩ nhiên có một số phần mẫu nhiều

hơn 10 tế bào, thậm chí có những phần mẫu có thể

chứa 20 tế bào trong 10ml mẫu và một số phần mẫu

chứa ít hơn Nếu tất cả các phần mẫu trên được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp, các vi

sinh vật trong mẫu sẽ phát triển và cho tín hiệu dương tính

Tương tự như vậy, 1 ml sẽ chứa trung bình 1

tế bào vi sinh vật, như vậy có những lần lấy sẽ

có 2 hay 3 tế bào và có những lần lấy sẽ không

có tế bào nào Nếu các lần hút này được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp

sẽ thu được những ống nghiệm cho kết quả dương tính và những ống cho kết quả âm

tính.

Nếu hút 0,1 ml thì sau 10 lần hút mới có khả năng nhận được 1 lần hút có 1 tế bào, như vậy hầu hết các lần nuôi cấy khi lấy 0,1 ml thì đều cho kết quả âm tính.

Có thể tính toán con số chắc chắn số lượng vi sinh vật trong 100ml mẫu bằng sự kết hợp các kết quả

nhận được từ các chuỗi cấy như trên Bảng giá trị

MPN khi sử dụng hệ thống cấy với các dãy 5 ống 10ml,

5 ống 1ml và 5 ống 0.1ml đã được tính sẵn và dùng cho phân tích các mẫu nước hay các mẫu đã pha loãng

Cho đến nay có rất nhiều bảng giá trị MPN được sử

dụng với độ chính xác và các khoảng tin cậy khác

nhau và được sử dụng cho các mục đích khác nhau

Phương pháp MPN được dùng chủ yếu để phân tích Coliforms và các vi sinh vật khác khi chúng phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng cho các tín hiệu dễ

dàng nhận dạng như sinh hơi, làm đục môi trường

chọn lọc, thay đổi pH môi trường