Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tử pptx

Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tử Bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu.. Bên cạnh các phương pháp truyền thống được sử dụng để x

Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

bằng kỹ thuật Sinh học phân tử

Bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Hằng năm, căn bệnh này cướp đi sinh mạng của hàng triệu người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển

Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium (P falciparum, P vivax, P.malarie, P

ovale) với trung gian truyền bệnh là muỗi cái Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn

xóc) Các triệu chứng điển hình của bệnh là sốt, đau đầu, nôn… Nếu không điều trị kịp thời hoặc ký sinh trùng kháng lại thuốc có thể dẫn đến tử vong do ký sinh trùng xâm nhập, phá vỡ hồng cầu làm tắc nghẽn các mạch máu

Bên cạnh các phương pháp truyền thống được sử dụng để xét nghiệm phát hiện 4 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh trên người như: nhuộm giemsa, QBC, ELISA, Paracheck…Các kỹ thuật dựa trên nguyên lý của phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) như: Nested-PCR, Real-time PCR, LAMP đang được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

1/ Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):

Phương pháp PCR có khả năng tạo ra hàng triệu bản sao của trình tự gen mục tiêu thông qua hoạt động sao chép tổng hợp mạch mới của enzyme DNA polymerase trong điều kiện in vitro với sự hiện diện của các cặp mồi chuyên biệt

Hiện nay, trên thị trường đã có bộ máy luân nhiệt sử dụng cho thực địa Điều này khắc phục được điểm yếu của phương pháp PCR là cần phòng thí nghiệm với các máy móc chuyên dụng khá phức tạp

Bộ trang thiết bị thí nghiệm PCR sử dụng ở thực địa

2/ Phương pháp Nested PCR:

Trong phương pháp Nested PCR (PCR lồng), sản phẩm của phản ứng PCR lần 1

sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2 Nested PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để

nhân bản bộ gen của loài Plasmodium trong phản ứng PCR lần 1 Sau đó tiếp tục

sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho P falciparum, P vivax, P malariae, P ovale

trong phản ứng PCR lần 2 Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện ký sinh trùng ở mật độ rất thấp mà các phương pháp thông thường khó có thể phát hiện được (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu) Đây được xem là “tiêu chuẩn vàng” mới trong tầm soát ký sinh trùng sốt rét do độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó

Kết quả chạy điện di phát hiện P vivax và P falciparum với các mật độ

ký sinh trùng khác nhau trong phương pháp Nested PCR

3/ Phương pháp Real-Time PCR:

Real-Time PCR có cùng nguyên lý với phương pháp PCR, cũng là một phản ứng nhân bản các trình tự đặc hiệu nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang Việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang được thực hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài Nhờ đó, phương pháp này vừa có thể phát hiện vừa có thể định lượng ký sinh trùng trong mẫu xét nghiệm theo thời gian thực dựa trên mẫu dò

Có 2 dạng cơ bản:

- Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium bromide)

Nguyên lý Real-Time PCR với SYBR Green

- Chất phát huỳnh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (TaqMan probe, Beacon molecular, Hydrolysis probe, Hybridization probe,…)

Nguyên lý Real-Time PCR với Taqman probe

4/ Phương pháp LAMP (Loop-Mediated Isothermal PCR):

Đây là một phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử mới, đơn giản, rẻ tiền dùng

để xác định trình tự gen 18S ribosom RNA của P falciparum Phương pháp này

không cần các máy móc đắt tiền như PCR, nhiệt độ thực hiện cũng thấp hơn (khoảng 65oC), thời gian thực hiện ngắn, chỉ bằng 1/3 so với phương pháp PCR

và có hiệu quả tương tự Tuy nhiên, phương pháp này tương đối mới, các Primer

sử dụng phức tạp và cần có những nghiên cứu nhiều hơn trước khi áp dụng vào việc chẩn đoán thường quy 4 loài ký sinh trùng sốt rét

Phương pháp LAMP

Ưu điểm của các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử là có thể định danh và định lượng ký sinh trùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Đặc biệt thích hợp cho những ca nhiễm ký sinh trùng ở mật độ thấp hoặc nhiễm phối hợp nhiều loài

Tuy nhiên, hiện nay, kỹ thuật PCR vẫn chưa thể thay thế kỹ thuật xét nghiệm bằng kính hiển vi trong chẩn đoán thường quy do quy trình thực hiện còn phức tạp, cần

có trang thiết bị chuyên biệt, phòng thí nghiệm phù hợp, hóa chất đắt tiền, kỹ thuật viên phải được đào tạo và huấn luyện… Mặc dù vậy, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các kỹ thuật cao trong nghiên cứu sẽ đóng một vai trò quan trọng trong công tác phòng chống bệnh sốt rét