CHỦ ĐỀ : KỸ THUẬT CHUYỂN GENE THỰC VẬT docx

Các khái niệmCÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN: là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào gen của cơ thể đa bào, sau đó DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau.. Mộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chủ đề

KỸ THUẬT CHUYỂN GENE THỰC VẬT

Các khái niệm

CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN: là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào gen của cơ thể đa bào, sau đó DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau.

GEN CHUYỂN :(transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền

GMP (genetically modified plant): thực vật biến đổi gen

Một số nguyên tắc trong chuyển công nghệ chuyển gene thực vật

- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)

- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai

- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây

- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng

cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan

- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai.

- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen

Các khâu của kỹ thuật cấy gen

Kỹ thuật cấy gen gồm 3 khâu chủ yếu:

 Tách ADN NST của tế bào cho và tách plasmid ra khỏi tế bào vi

khuẩn.

 Cắt và nối đoạn ADN của tế bào cho vào ADN plasmid ở những

điểm xác định tạo nên ADN tái tổ hợp.

• Việc cắt nhờ enzim cắt (restrictaza)

• Việc nối nhờ enzim nối (ligaza)

 Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận và tạo điều kiện cho gen

đã ghép được biểu hiện.

Vì sao phải phát triển công nghệ chuyển gene thực vật?

III) Các kỹ thuật biến đổi gene:

Kỹthuậttrựctiếp

Kỹ thuật bắn gene

Kỹ thuật siêu âm

Kỹ thuật điện xung

Chuyển gen nhờ virus và phage

Kỹ thuật bắn gene

Đâu là súng bắn gene?

Chính xác

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học

ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA

Kỹ thuật bắn gene

Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990

Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt

biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung))

Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí

helium để gia tốc các hạt

Cấu tạo súng bắn gen:

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6″x7″x10″ nối với hai bơm chân không

Đạn ở đây là các hạt tungsen có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm m chứa DNA ngoại lai (các kim loại năng khác như vàng và bạc

cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt)

Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng

Kỹ thuật bắn gene

Kỹ thuật bắn gene

CÁC LOẠI SÚNG BẮN

GEN

Kỹ thuật bắn gene

PDS-1000 Sauter1991 PDS-1000He

* Ưu điểm

- Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào

- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh)

- Tần xuất thành công khá cao(ở cây một lá mầm) Hơn nữa việc thiết

kế vector khá đơn giản

* Nhược điểm

- Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của

phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời

Tuy nhiên, những năm gần đây phương pháp này đã thành công trên

lúa, mía, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này

Kỹ thuật bắn gene

Kỹ thuật siêu âm

Nguyên tắc: Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm

có hiện diện của DNA ngoại lai Sóng siêu âm giúp DNA đi vào

tế bào và thể hiện

Cách tiến hành:

Các bước:

Kỹ thuật siêu âm

Kỹ thuật điện xung

Là một phương pháp cơ học sử dụng để đưa các phân tử

phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào

Một xung điện cao thế trong khoảnh khắc điện thế cao (200 –

400 V/cm) trong khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid

Tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA

ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.

Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên

dụng Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi

trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường

chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp

Tiếp theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn

lọc cây chuyển gen

Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất

Kỹ thuật điện xung

Máy xung điện

Kỹ thuật vi tiêm

Là phương pháp tiêm các đại phân tử vào trong tế bào thực vật

Brinster, 1981; Costantini và Lacy; 1981 đã chứng minh rằng

với phương pháp vi tiêm, các gen chuyển đã tích hợp và có

khả năng biểu hiện Vào năm 1982, lần đầu tiên sự thay đổi

kiểu hình có thể nhìn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đã được mô

tả (Palmiter, 1982)

Brinster

Kỹ thuật vi tiêm

Nguyên tắc phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm

trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách

cơ học dưới kính hiển vi

1.Máy gia cố kim Microforge

2 Máy mài kim

3 Máy kéo kim tự động Pipette Puller

Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm và kim giữ

Kim được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 1,5 mm có sợi bằng wolfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim

0,1-Hệ thống này gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim và máy gia cố kim

Kỹ thuật vi tiêm

Máy vi thao tác Olympus

Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian

Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược

(vật kính xoay ngược lên)

Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

Vi tiêm ngoại lai tiền nhân của trứng thụ tinh

Ưu điểm

- Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào

- Quyết định được đưa ADN vào loại tế bào nào

- Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được

- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc

dù hạn chế về số lượng cũng có thể tiêm chính xác

- Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây

Nhược điểm

- Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào

- Thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao

Kỹ thuật vi tiêm

Kỹ thuật chuyển gene qua ống phấn

Ray Wu1988

Phương pháp chuyển gen qua ống phấn là phương

pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro.

Phương pháp này được nhóm Ray Wu đại học

Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp

theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của

hai tác giả Trung Quốc Duan và Chen (1985)

Kỹ thuật chuyển gene qua ống phấn

Nguyên tắc ADN ngoại lai chuyển vào

cây theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái

Thời gian chuyển gen là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh

tử vào thụ tinh, tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn

và cho tế bào hợp tử chưa phân chia Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không hình thành thể khảm

Kỹ thuật chuyển gene qua ống phấn

Cách tiến hành

- Sau thời gian hoa nở 1- 2 giờ, cắt 2/3 hoặc 3/4 phần trên của hoa lúa

- Sau khi cắt hoa, dùng ống mao quản nhỏ có đường kính 0,2mm đưa dung dịch ADN tái tổ hợp mang gen mong muốn vào đầu ống nhụy

đã bị cắt (nồng độ ADN tái tổ hợp khoảng 50 g/ml)

- Bao bông lúa lại, chờ lúa chín thu hái

- Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau

- Lúa trồng trong chậu với các điều kiện nước, phân, nhiệt độ, chiếu sáng thích hợp Khi lúa trỗ, chọn các hoa có hai vỏ trấu mở hoàn toàn

và đánh dấu để khỏi nhầm lẫn với các hoa khác

Kỹ thuật PEG

Kỹ thuật PEG (Chuyển gen bằng phương pháp hóa học)

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học là phương pháp chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như poly-1-ornithin hoặc polyethylen glycol (PEG)

Phương pháp chuyển gen bằng hóa chất có thể áp dụng với nhiều loài thực vật nhưng khả năng chuyển gen với tần số chuyển gen rất thấp.

Tuy nhiên, với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này

Kỹ thuật PEG

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium là nhóm các vi khuẩn đất Gram âm gây ra các triệu chứng bệnh ở cây Khi ở trong đất sẽ sinh độc tố, gây ung thư ở thực vật, gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh lông rễ ở nhiều loài cây cảnh và cây ăn quả nhưng mang những plasmid lớn

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Hình :Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra A: một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng

B: một dãy khối u nằm trên nhánh của cây Nho

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl

acetosyringon)

Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn

dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật

Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u

Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin Tỷ lệ

auxin/xytokinin kích thích sự hình thành callus tạo lên các khối u

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

bộ gen của

Vi khuẩn đất A tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng trong công nghệ gen

thực vật gồm có 2 loại: vector liên hợp và vector nhị thể

Vector liên hợp dựa trên sự tái tổ hợp của 2 plasmid Một vector

liên hợp gồm có: vị trí để ghép các gen quan tâm, thường vị trí

này có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn E.coli

Gen chỉ thị kháng sinh giúp cho chọn lọc trong vi khuẩn E.coli,

Agrobacterium và gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực

vật

Vector nhị thể là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: một cung cấp T-ADN đã mất độc tính gây khối u, plasmid kia là Ti plasmid có khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (mang các gen vir)

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

1.Thiết kế vector mang gen

4 Lây nhiễm A.tumefaciens

chứa gen biến nạp với tế bào,

mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích.

5 Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công.

6 Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây biến nạp hoàn chỉnh.

Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn

A.tumefaciens

Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

Ưu điểm

- Gen ít bị đào thải

- Số lượng bản sao ít hơn Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau và câm lặng lẫn nhau

- Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do sự phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống protein Vir, còn ở những phương pháp khác gen mục tiêu được tái tổ hợp chuyên biệt nhờ hai trình tự IS hai đầu nhưng dễ dàng bị tách ra ngay sau đó

Nhược điểm

- Có phổ tấn công giới hạn

- Gây khối u cho cả cây khỏa tự và cây hai lá mầm nhưng lại không gây khối u cho cây một lá mầm

Chuyển gen nhờ virus

Virrus dễ dàng bám và lây nhiễm vào tế bào trên những thực vật nguyên vẹn.

Một số Virrus lây nhiễm vào thực vật từ vị trí xâm nhiễm và chuyển acid nucleic của nó vào mỗi tế bào sống của ký chủ.

Virrus có thể sao chép vài ngàn lần và tồn tại khoảng 103 -105

bản sao trong mỗi tế bào thực vật.

Gen của Virrus được đi khắp nơi và vì vậy có biểu hiện

mạnh.

Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen cần phải có các tiêu chuẩn sau:

- Hệ gen của virus phải là ADN

- Virus có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào

- Có khả năng mang được đoạn ADN (gen) mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật

- Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)

- Không gây tác hại đáng kể cho thực vật

Chuyển gen nhờ virus

Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có hai loại virus được sử

dụng làm vector chuyển gen là caulimovirus và geminivirus

Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít

được sử dụng vì ADN virus khó ghép nối với hệ gen của thực

vật

thuật ngữ chỉ các sinh vật tiếp

nhận những gen mới từ các sinh

vật khác thông qua phương pháp

chuyển gen trong phòng thí

nghiệm

tất cả các sinh vật còn sống có chứa tổ hợp vật chất di truyền mới do sử dụng công nghệ sinh học hiện đại

Sự khác nhau cơ bản của GMO và LMO: LMO tồn tại ở dạng

sống, còn GMO có thể tồn tại ở dạng sống hay không sống

Lịch sử xuất hiện GMO

- Từ khi Công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ, những ứng dụng tác động vào tất cả các mặt của nghiên cứu khoa học và ứng dụng sản xuất

- Trong đó, mối quan tâm hàng đầu là lai tạo ra những giống cây, con có nhiều tính trạng tốt, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người

- Những vấn đề mới phát sinh ngày càng nhiều: thiếu đất canh tác trầm

trọng, nhiều sâu bệnh hại không trị được dứt điểm, nhu cầu số lượng ngày càng lớn… trong khi các biện pháp lai tạo truyền thống tỏ ra không hiệu quả, đặc biệt đối với vật nuôi

Kĩ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) được đề xuất lần đầu

tiên bởi Peter Lobban và A Dale Kaiser (Cục hóa sinh, ĐH Stanford,

California, Hoa Kỳ ) đã mở ra một tương lai cho việc nghiên cứu lai tạo

các giống mới, phục vụ nền sản xuất nông nghiệp hiện đại, đó chính là

cơ sở cho sự xuất hiện của các sinh vật biến đổi gene (GMO) ngày nay

GMO được hình thành như thế nào?

Sinh vật biến đổi gene được hình thành trên cơ sở ứng dụng kỹ

thuật chuyển gene, phương pháp DNA tái tổ hợp( recombinant DNA)

Dùng enzyme cắt gene mong muốn (ở đây là

Vector mang gene mong muốn được đưa vào Plasmid của vi khuẩn

Gene ngoại lai được đưa vào hệ gene của Ngô, nhờ sự xâm nhiễm của vi khuẩn

Từ tế bào Ngô chứa gene ngoại lai, bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, hình thành cây hoàn chỉnh mang gene mong muốn, hoàn toàn khác cây ban đầu.

Kỹ thuật chuyển gene đã tác động mạnh mẽ vào các loại giống cây trồng, đặc biệt là các loại cây lương thực, thực phẩm, dược liệu.

Thành tựu về GMO

Ngày nay, số lượng cây trồng mang các gene mới quy định những tính trạng như kháng sâu bệnh, kháng thuốc trừ cỏ, chứa gene quy định tổng hợp Protein, vitamin… vô cùng lớn, giúp các quốc gia đặc biệt là quốc gia đang phát triển phần nào giải quyết được vấn đề an ninh lương thực

Diện tích đất canh tác: diện tích đất canh tác cây trồng biến đổi gene trên quy mô toàn cầu đạt ngưỡng 100 triệu hectare với sự tham gia của hơn 10 triệu nông dân ở 22 quốc gia

Hoa Kỳ dẫn đầu với 54,6 triệu hectare, Argentina đứng thứ hai với 18

triệu hectare, Brazil có 11,5 triệu hectare, Canada có 6,1 triệu hectare, Ấn

Độ 3,8 triệu hectare và Trung Quốc xếp thứ sáu với 3,8 triệu hectare

Thành tựu về GMO

Bốn đối tượng cây trồng biến đổi gene chính được gieo trồng thương mại bao gồm đậu tương, ngô, bông và cải dầu

Hai tính trạng được sử dụng phổ biến hiện nay là tính trạng kháng thuốc

diệt cỏ và kháng côn trùng Trong đó, các cây trồng có khả năng kháng

thuốc diệt cỏ được canh tác trên diện rộng nhất

Ngoài ra, rất nhiều tính trạng khác cũng được chuyển vào cây trồng nông nghiệp Tuy nhiên, các giống biến đổi gene này mới được trồng ở quy mô nhỏ hoặc chưa được thương mại hóa

Thành tựu về GMO