Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư của các alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l ) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

Hiện nay trên thế giới các nhà khoa học đang nỗ lực tìm kiếm thuốc điều trị ung thư và hỗ trợ điều trị ung thư từ dược thảo bởi vì các sản phẩm thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp hóa học và bán tổng hợp còn có nhiều tác dụng không mong muốn. Thuốc sản xuất từ dược thảo có tính ưu việt hơn hẳn làm cho người bệnh trên thế giới ngày càng mong muốn sử dụng thuốc từ nguồn gốc thiên nhiên. Hiện nay có một câu hỏi được đặt ra trước các nhà khoa học Có phải chăng có bao nhiêu loại bệnh trên trái đất này sẽ có bấy nhiêu cây thuốc để chữa trị mà con người chưa khám phá được hết? Câu hỏi này đã thôi thúc các nhà khoa học tiếp tục tìm kiếm, nghiên cứu trong thiên nhiên từ dược thảo, từ động vật, khoáng vật, v.v…...để tìm ra những loại thuốc mới cứu con người thoát khỏi nguy cơ của căn bệnh ung thư. Thật kinh hoàng khi người bệnh phải trải qua những khoảnh khắc chờ đợi kết quả xét nghiệm tế bào, sinh thiết để khẳng định mình có bị ung thư hay không? Nếu các nhà khoa học đã tìm ra được thuốc chữa bệnh ung thư, chắc hẳn người bệnh sẽ không phải quá lo âu chờ đợi kết quả xét nghiệm. Cũng vì vậy, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã và đang không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm và hy vọng sẽ tìm được các loại thuốc mới điều trị ung thư đi từ nguồn gốc tự nhiên. Để góp một phần nhỏ trong sự nghiệp nghiên cứu tìm thuốc mới điều trị ung thư từ dược thảo và tạo điều kiện cho các nhà khoa học mở rộng hợp tác nghiên cứu với các nước, Bộ Khoa Học Công Nghệ và Bộ Y Tế đã giúp đỡ chúng tôi thực hiện Nghị định thư giữa Việt Nam và Bungari, với sự cộng tác nghiên cứu khoa học của các chuyên gia Bungari và các cộng sự trong nước. Chúng tôi đã được thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư của các alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư”.

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

VỀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

GIỮA VIỆT NAM VÀ BUNGARI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC ALCALOID VÀ FLAVONOID ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L.) ĐỂ SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN

XUẤT THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Công ty CP Dược Liệu TW2

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Ngọc Trâm

7588

08/01/2010

Hà Nội - 2009

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Trong báo cáo này chúng tôi có sử dụng một số từ viết tắt và các ký hiệu như sau:

HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR Infrared spectroscopy – phổ hồng ngoại

UV Ultraviolet spectroscopy – phổ tử ngoại

1H - NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân H1

13C - NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân

EIMS Electron Impact Mass Spectroscopy – Phổ điện tử

PBMN Peripherial Blood Mononuclear Cells

FCS Foetal Calf Serum

FBS Fetal Bovine Serum ( Huyết Thanh Bê)

PBS Psychedelic Benzodiazepin Solution

GTBHS Graffi Tumors Bearing Hamster

TLC Sắc ký lớp mỏng

5 Bảng 5: Các dưới nhóm tế bào lympho máu ngoại vi (xác định bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp) ở chuột bị chiếu tia và điều trị bằng Crila

6 Bảng 6: Tỉ lệ % của các dưới nhóm tế bào lympho lách (xác định bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp)

7 Bảng 7: Khả năng chế tiết TNFα và IL-2 của tế bào lách của chuột chiếu tia được điều trị với Crila

8 Bảng 8: Hoạt tính chống ôxy hóa của Crila và các phân đoạn

9 Bảng 9: Sơ đồ pha mẫu theo các thang nồng độ chất thử

13 Ảnh 13: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum

latifolium L phân đoạn H1

14 Ảnh 14: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum

latifolium L phân đoạn H1

15 Ảnh 15: Hoạt tính chống khối u (gây độc tế bào) của Crinum

latifolium L phân đoạn H1

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

1 Biểu đồ 1: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)

2 Biểu đồ 2: Tỷ số Kyn/trp (% các tế bào đã được kích thích bằng PHA)

3 Biểu đồ 3: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích

4 Biểu đồ 4: Sự tạo thành neopterin % các tế bào đã được kích thích

5 Biểu đồ 5: Đồ thị tính giá trị IC50 của mẫu

6 Biểu đồ 6: Mẫu C3- Dòng Hep-G2

7 Biểu đồ 7: Mẫu C2- Dòng Hep-G2

8 Biểu đồ 8: Hiệu quả in vivo của Crila và các phân đoạn đối với sự tăng

trưởng khối u của chuột cống dùng trong thí nghiệm với methylcholanthrene

9 Biểu đồ 9: Thời gian sống trung bình (MST) của chuột cống mang

khối u được chữa trị với Crila và các phân đoạn

10 Biểu đồ 10: Tỉ lệ chết (%) của chuột cống mang khối u, được chữa trị với Crila và các phân đoạn

11 Biểu đồ 11: Kích thước khối u (mm) của chuột Hamster, được chữa trị với CRILA

12 Biểu đồ 12: Thời gian sống trung bình của chuột Hamster mang khối

u Graffi được chữa trị với Crila

13 Biểu đồ 13: Khả năng cấy ghép (%) ở chuột Hamster, được chữa trị với Crila

14 Biểu đồ 14: Tỉ lệ chết (%) của chuột Hamster mang khối u Graffi, được chữa trị với Crila

15 Biểu đồ 15: Khả năng cấy ghép (%) khối u tế bào tủy Graffi của chuột Hamster, được chữa với thuốc viên Crila

16 Biểu đồ 16: Tỉ lệ chết (%) của chuột Hamster mang khối u tế bào tuỷ, được chữa trị với thuốc viên Crila

17 Biểu đồ 17: Thời gian sống trung bình của GTBH, được chữa trị với thuốc viên Crila

18 Biểu đồ 18: Kích thước (mm) khối u ở chuột Hamster mang khối u điều trị với Crila

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ Crinum latifolium L……… 2

1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc 2

1.2 T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc 8

1.3 Các thuốc kích thích hệ miễn dịch 11

2 TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13

3 MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ 13

4 NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ 13

4.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L 13

4.2 Đánh giá tác dụng sinh học in vitro và in vivo của các phân đoạn alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ cây TNHC (Crinum latifolium L.) 14

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17

3.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L 17

3.1.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây TNHC (Crinum latifolium L.) 17

3.1.2 Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 20

3.1.3 Máy móc thiết bị 22

3.1.4 Xác định thành phần hóa học của phân đoạn alcaloid C1 và phân đoạn flavonoid H1 22

3.1.5 Tiêu chuẩn hóa sản phẩm 26

3.2 Đánh giá tác dụng sinh học của các phân đoạn Alcaloid và

Flavonoid chiết xuất từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung 38

3.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo và in vitro của các phân đoạn alcaloid, flavonoid và viên nang Crila 38

3.2.1.1 Thí nghiệm in vivo 39

3.2.1.2 Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro của Crila và các phân đoạn H1 (Flavonoid), C1(Alcaloid) 44

3.2.1.3 Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của viên nang Crila và các phân đoạn C1, C2, C3 (alcaloid), H1 (flavonoid) trên bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi 47

3.2.1.4 Tác dụng viên nang Crila trên tủy xương chuột nhắt nuôi cấy in vitro 49

3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của viên nang Crila thông qua phản ứng bao vây gốc tự do 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DPPH) 51

3.2.3 Thử gây độc tế bào với các dòng ung thư nuôi cấy in vitro 53

3.2.3.1 Với các dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro 53

3.2.3.2 Thử độc tế bào in vitro của viên nang Crila và phân đoạn H1 trên tế bào ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy 59

3.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo được chứng minh trên chuột Wistar và chuột Hamster 65

3.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng của viên nang Crila và phân đoạn C1, H1 trên chuột Wistar được gây ung thư do hoá chất 20 – methylcholanthrene 65

3.2.4.2 Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo của viên Crila Việt Nam sử dụng tại chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi ở chuột Hamster 70

3.2.4.3 Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch chống khối u của viên nang Crila trên chuột Hamster được cấy ghép khối u tế bào tủy Graffi 75

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 80

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

Tài liệu tham khảo 86

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trên thế giới các nhà khoa học đang nỗ lực tìm kiếm thuốc điều trị ung thư và hỗ trợ điều trị ung thư từ dược thảo bởi vì các sản phẩm thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp hóa học và bán tổng hợp còn có nhiều tác dụng không mong muốn Thuốc sản xuất từ dược thảo có tính ưu việt hơn hẳn làm cho người bệnh trên thế giới ngày càng mong muốn sử dụng thuốc từ nguồn gốc thiên nhiên Hiện nay có một câu hỏi được đặt ra trước các nhà khoa học - Có phải chăng có bao nhiêu loại bệnh trên trái đất này sẽ có bấy nhiêu cây thuốc để chữa trị mà con người chưa khám phá được hết? Câu hỏi này đã thôi thúc các nhà khoa học tiếp tục tìm kiếm, nghiên cứu trong thiên nhiên từ dược thảo, từ động vật, khoáng vật, v.v… để tìm ra những loại thuốc mới cứu con người thoát khỏi nguy cơ của căn bệnh ung thư

Thật kinh hoàng khi người bệnh phải trải qua những khoảnh khắc chờ đợi kết quả xét nghiệm tế bào, sinh thiết để khẳng định mình có bị ung thư hay không? Nếu các nhà khoa học đã tìm ra được thuốc chữa bệnh ung thư, chắc hẳn người bệnh sẽ không phải quá lo âu chờ đợi kết quả xét nghiệm Cũng vì vậy, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã và đang không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm và hy vọng sẽ tìm được các loại thuốc mới điều trị ung thư đi từ nguồn gốc tự nhiên

Để góp một phần nhỏ trong sự nghiệp nghiên cứu tìm thuốc mới điều trị ung thư từ dược thảo và tạo điều kiện cho các nhà khoa học mở rộng hợp

tác nghiên cứu với các nước, Bộ Khoa Học Công Nghệ và Bộ Y Tế đã giúp đỡ chúng tôi thực hiện Nghị định thư giữa Việt Nam và Bungari, với

sự cộng tác nghiên cứu khoa học của các chuyên gia Bungari và các cộng

sự trong nước Chúng tôi đã được thực hiện nhiệm vụ: “Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn dịch chống ung thư của các alcaloid và

flavonoid được chiết xuất từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc hỗ trợ điều

trị ung thư”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ

Crinum latifolium L

1.1 T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc

a T×nh h×nh bƯnh ung th− vµ đ¸p øng miƠn dÞch chèng ung th−:

Bệnh ung thư là căn bệnh hiểm nghèo, cả thế giới chưa tìm được thuốc đặc trị Theo thông tin từ tổ chức Y Tế thế giới số lượng bệnh nhân ung thư hàng năm khoảng 9 triệu người, số người chết vì căn bệnh ung thư năm 1909 4%, năm 1990 20% Từ năm 1990 đến nay tỉ lệ người mắc bệnh bị tử vong tăng lên nhanh [1] Trước hiểm hoạ đó các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tìm kiếm từ thiên nhiên hoặc từ con đường bán tổng hợp và tổng hợp hoá học hy vọng rằng sẽ tìm được thuốc chữa trị ung thư có hiệu quả

Hiện nay các phương pháp chữa trị ung thư được sử dụng nhiều : phẫu thuật, xạ trị, hoá trị, điều trị miễn dịch Thuốc cho bệnh ung thư trên thế giới hiện có khoảng 90 loại [24], trong đó có nguồn gốc thực vật là 62% Thực tế đó đã thúc dục các nhà khoa học tiếp tục đi tìm thuốc chữa trị ung thư từ dược thảo trong đó có các nhà khoa học Việt Nam

Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC) có tên khoa học Crinum latifolium

L họ thủy tiên Amaryllidaceae, là một cây thuốc quý đã được lưu truyền

trong y học dân gian, nhân dân ta đã sử dụng lá TNHC sắc uống trong vòng 63 ngày để điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt [6] Cây TNHC là cây hoang dại, theo tác giả Võ Văn Chi [3] cây TNHC còn gọi là cây náng lá rộng, tỏi lơi lá rộng, mọc hoang ở ven suối trong rừng, một số nơi ở

Đồng Nai và cội nguồn của cây TNHC là sống ở vùng Bà Rịa Vũng tàu Trong những năm qua, Trung tâm Nghiên cứu Phát Triển Sản Xuất

Dược Phẩm CRINA trực thuộc Công ty CP Dược Liệu TW2 đã tập trung cây TNHC hoang dại về thành vùng trồng dược liệu sạch theo quy trình GAP (Good Agricultural Practice) tại Huyện Long Thành – Tỉnh Đồng Nai, để có nguyên liệu ổn định hoạt tính sinh học, sản xuất thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung Theo tác giả Vũ Ngọc Lộ, và các tác giả viện Dược liệu (cây thuốc và động vật làm thuốc tập II) đã viết, theo kinh nghiệm dân gian nhân dân ta thường hái lá cây Trinh nữ hồng cung phơi khơ, sau đĩ sao khơ hạ thổ để làm thuốc chữa các bệnh ung thư vú, ung thư tử cung, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, và một số bệnh ung thư khác Cây TNHC được biết tới như loài cây chữa bệnh ung thư nhiều năm nay nhưng nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu khoa học đầy đủ về tác dụng chữa bệnh của nó Do đó, chúng tôi nhận thấy cần phải hợp tác với các nước tiên tiến có điều kiện về trang thiết bị máy móc hiện đại với sự giúp đỡ của các nhà khoa học có trình độ chuyên môn cao, để chứng minh khả năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư của cây Trinh nữ hoàng cung

(Crinum latifolium L.)

Cây Trinh nữ hồng cung là một cây thuốc quý hiếm Cây thuốc này

cĩ khả năng tự tổng hợp các chất ức chế sự phát triển của tế bào u Một trại dược liệu Trinh nữ hồng cung với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng Việt Nam cĩ thể thay cho một nhà máy tổng hợp các alcaloid và flavonoid

cĩ tác dụng kháng u Thiên nhiên đã ban tặng cho Việt Nam một điều may mắn là cĩ được cây Trinh nữ hồng cung và thực tế từ kinh nghiệm dân gian chúng tơi muốn nắm bắt và nhận được từ dược thảo Việt Nam một

viờn thuốc quý điều trị ung thư Trong số cỏc phương phỏp điều trị ung thư, phương phỏp điều trị miễn dịch là phương phỏp hiện nay đang được quan tõm vỡ con người đó phỏt hiện ra cỏc khỏng nguyờn đặc hiệu của cỏc khối u của người Tiếp theo đú người ta cũng nhận thấy cỏc phản ứng hỗn hợp giữa cỏc lympho T với cỏc khỏng nguyờn của khối u Trong cỏc trường hợp ung thư, cỏc lympho T được sinh sản chủ yếu là dạng lympho

T CD4+ và một phần là cỏc lympho T CD8+ đặc hiệu với cỏc tế bào ung thư tiết ra TNFα, Boon và cỏc cộng sự (1994) đó phỏt hiện được một họ cỏc gen của khỏng nguyờn của ung thư melanoma và gọi là MAGE (melanoma associated genes) Từ mỏu của bệnh nhõn mang bệnh melanoma MZ2, họ đó tỏch được cỏc lympho Tc CD8+ đặc hiệu với khối u MZ2-E

b Cỏc kết quả đó đạt được của Đề tài và Dự ỏn của Cụng ty CP Dửụùc

Lieọu TW2 đã nghiên cứu về cõy Trinh nữ hoàng cung (Crinum

latifolium L.)

Trong nhửừng naờm qua ủửụùc sửù giuựp ủụừ cuỷa Boọ Khoa Hoùc Coõng

ngheọ vaứ Boọ Y Teỏ, TS Nguyeón Thũ Ngoùc Traõm cuứng caực coọng sửù cuỷa Coõng ty vaứ caực Vieọn nghieõn cửựu trong vaứ ngoaứi nửụực ủaừ nghieõn cửựu thaứnh coõng vaứ ủửa ra saỷn phaồm vieõn nang cửựng CRILA chieỏt xuaỏt tửứ Trinh nửừ hoaứng cung ủieàu trũ phỡ ủaùi laứnh tớnh tuyeỏn tieàn lieọt (u xụ tuyeỏn tieàn lieọt) Saỷn phaồm naứy dửùa treõn keỏt quaỷ nghieõn cửựu khoa hoùc cuỷa hai ủeà taứi caỏp Boọ vaứ moọt Dửù aựn saỷn xuaỏt thửỷ nghieọm caỏp Nhaứ nửụực:

- ẹeà taứi 1: “Nghieõn cửựu hoaứn thieọn quy trỡnh coõng ngheọ chieỏt xuaỏt

alcaloid toaứn phaàn tửứ laự caõy Trinh Nửừ Hoaứng Cung (Crinum latifolium L.) duứng laứm nguyeõn lieọu saỷn xuaỏt thuoỏc ủieàu trũ u xụ tuyeỏn tieàn lieọt, u

xụ tửỷ cung”

- Đề tài 2: “Nghiên cứu tác dụng sinh học và bào chế viên nang cứng từ cao khô alcaloid toàn phần của lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung trong điều trị u xơ tuyến tiền liệt” Dự án SXTN – KC.10.DA17: “Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung

(Crinum latifolium L Amaryllidaceae) để sản xuất viên nang điều trị phì

đại lành tính tuyến tiền liệt”

Hai đề tài trên đã được nghiệm thu đánh giá đạt loại khá và dự án SXTN KC.10.DA17 đạt loại xuất sắc

Dựa trên kết quả nghiên cứu lâm sàng và đánh giá của Hội Đồng Khoa Học, Bộ Y Tế đã cho phép Viên nang CRILA được lưu hành toàn quốc với số đăng ký: VNB-3391-05, sản phẩm được người bệânh tin dùng vì hiệu quả điều trị cao, đạt 89,18% đối với u xơ tuyến tiền liệt và 79,5% đối với u xơ tử cung

Để cĩ được một sản phẩm thuốc đặc trị cho bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt), u xơ tử cung và thuốc hỗ trợ điều trị ung thư địi hỏi phải cĩ nguồn nguyên liệu ổn định về hoạt tính sinh học

ức chế khối u, do đĩ phải cĩ giống và qui trình trồng trên vùng đất ổn định Cơng ty CP Dược Liệu TW2 đã phát triển vùng trồng 20 hecta và nghiên cứu bảo tồn gen cây Trinh nữ hồng cung Hiện đang tiếp tục phát triển vùng trồng và chuẩn bị nghiên cứu phương pháp cấy mơ để so sánh hoạt tính sinh học ức chế khối u của cây cấy mơ với cây nhân giống tự nhiên

c Thành phần hĩa học

* Alcaloid

- Cơng ty Dược Liệu TW2 - Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã tìm ra các alcaloid: 9-Octadecenamideb ,

Dihydro-oxo-demethoxyhaemanthamine, Augustamine, Oxoassoanine, Crinane-3α-ol, Buphanidrine, Powelline, Undulatine, Ambelline,

6-hydroxybuphanidrine, 6-hydroxypowelline, Crinamidine,

6-hydroxyundulatine, 1β,2β - epoxyambelline, 6-hydroxycrinamidine, Epoxy-3,7-dimethoxycrinane-11-one [48]

- Trửụứng ẹaùi hoùc Dửụùc Haứ Noọi – Nguyeón Vaờn Baống, Vuừ ẹoan Trang, vaứ caực coọng sửù, ủaừ xaực ủũnh trong laự Trinh Nửừ Hoaứng Cung coự alcaloid, saponin, acid hửừu cụ, amino acid [2]

- Traàn vaờn Sung vaứ coọng sửù xaực ủũnh theõm 2 hoaùt chaỏt: Lycorin vaứ Pratorin (Hippadin) [11]

- Voừ Thũ Baùch Hueọ, Nguyeón Khaộc Quyứnh Cửự, vaứ caực coọng sửù xaực ủũnh ủửụùc 4 alcaloid: Augustamin, ambelin, crinamidin, 6-hydroxycrinamidin

[5]

- Nguyeón Thũ Ngoùc Traõm vaứ coọng sửù ủaừ nghieõn cửựu vaứ coõng boỏ 32

chaỏt bay hụi coự trong laự caõy Trinh nửừ hoaứng cung [49]

* Flavonoid

- Việc tìm kiếm thuốc chữa trị ung thư từ thực vật là hướng đi của thời

đại, được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Trong những năm qua nhiều loại thuốc đã được ra đời phục vụ cho y học, song việc tìm ra các loại thuốc có hiệu lực chữa trị ung thư vẫn còn là câu hỏi lớn đối với các nhà khoa học Trong các hướng nghiên cứu nhằm tìm ra các hoạt chất có khả năng chống ung thư – Flavonoid là moọt nhoựm chaỏt cuừng ủửụùc nhieàu nhaứ khoa hoùc quan tâm do chúng có tác dụng chống oxy hoá cao, tác dụng đến nhiều hệ Enzym và ít độc tố với cơ thể, Flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hoá học

- Nguyễn Hải Nam và Nguyễn Tiến Vững [8] đã chiết xuất và phân lập xác định cấu trúc của 2 chất sau:

* 4’7 – dihydroxy -3- vinyloxyflavan

* 4’7 – dihydroxyflavan

Kết quả này hoàn thiện thêm nghiên cứu về thành phần hóa học của cây

Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

* Thành phần hóa học khác của lá Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

- Nguyễn Công Hào và cộng sự [14] đã chiết tách và phân lập từ lá tươi Trinh nữ hoàng cung 4 hợp chất: p – hydroxycinnamat metyl, 3,4-dihidroxycinnamat etyl, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosit và kaempferol-3-4’-di-O-β-D-glucopyranosit

d Tác dụng sinh học

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã chứng minh trong dịch chiết bằng nước nóng từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung có chứa đựng những yếu tố hoạt hóa tế bào Lympho T làm cho tế bào Lympho T phát triển và hoạt động.[12]

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova Đã tiến hành thử nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi bằng cách cấy dưới da hoá chất gây ung thư 20-methylcholanthrene, và tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây

Crinum latifolium L (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam) Kết quả

đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [50]

- Các tác giả còn chứng minh thêm được 4 phân đoạn alcaloid có tác dụng gây độc tế bào ung thư da, ung thư màng tử cung, ung thư cơ tim có kết quả dương tính mạnh [13]

- Để có thuốc hỗ trợ cho điều trị u xơ tuyến tiền liệt (phì đại lành tính tuyến tiền liệt) và tránh nhầm lẫn cây Trinh Nữ Hoàng Cung với các cây náng khác có ở Việt Nam, Công ty CP Dược Liệu TW2 đã sản xuất trà túi lọc Trinh Nữ Hoàng Cung từ 1998 cho đến nay, sản phẩm đã và đang có uy tín trên thị trường

- Năm 2001 tại BV Hữu Nghị, Bác sĩ Nguyễn Xuân Hướng sử dụng nước sắc lá Trinh Nữ Hoàng Cung của Công ty Dược Liệu TW2 cung cấp để điều trị u xơ tuyến tiền liệt cho các bệnh nhân của bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội, đạt hiệu quả cao [4]

- Tháng 7 năm 2005 theo quyết định của Cục Trưởng Cục Quản lý Dược Việt Nam, viên nang cứng CRILA do Trung tâm NCPTSX Dược Phẩm CRINA thuộc Công ty CP Dược liệu TW2 sản xuất từ cao khô Trinh nữ hoàng cung đã được phép lưu hành toàn quốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) và tháng 10 năm 2007 được bổ sung thêm tác dụng thứ hai điều trị u xơ tử cung

1.2 T×nh h×nh nghiªn cøu ngoµi n−íc

Từ những năm 1984 cho đến nay các công trình nghiên cứu về thành

phần hoá học và tác dụng dược lực của Crinum latifolium L cũng đã

được công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước

a Thành phần hoá học

- Năm 1984, Ghosal (Ấn Độ) đã phân lập và xác định từ cán hoa Crinum latifolium một glucoalcaloid có tên latisolin Thủy phân bằng enzym thu được aglycon có tên latisodin (J Chan Res 1984) [27]

- Ghosal và Shibnath còn phân lập được từ thân hành lúc cây đang ra hoa Pratorimin và Pratosin là 2 alcaloid pyrolophenanthrindon mới cùng với những chất đã được biết như pratorimin, ambelin và lycorin [28]

- Năm 1986, Ghosal còn công bố tách được từ Crinum latifolium L một

số dẫn xuất alcaloid có tác dụng chống ung thư: Crinafoline và Crinafolidine Các chất này đã được thử nghiệm với tế bào và cho kết quả dương tính [29]

- Năm 1989, Ghosal còn chiết từ dịch ép của cán hoa cây Crinum latifolium 2 alcaloid mới có nhân pyrrolophennanthaidin là 2-epilycorin và 2-epipancrassidin [30]

- Một số nhà khoa học Nhật Bản cũng tìm thấy một số ít alcaloid khác từ cây Crinum latifolium như: crinamin, hamayne [40]

b Tác dụng sinh học

Song song với các nghiên cứu về mặt hóa học, có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý từ cây Trinh nữ hoàng cung đã được công bố Các tác giả đã chứng minh được rằng tác dụng dược lý của các alcaloid trong họ Amaryllidaceae rất rộng, bao gồm các đặc tính chống ung bướu, chống vi khuẩn và kích thích miễn dịch

- Tác giả Yui và cộng sự đã chứng minh alcaloid lycorine là họat chất

chính từ Crinum latifolium L có tác dụng gây kích thích cho tế bào T

trong ống nghiệm và trên sinh vật hoạt động và phát triển [54]

- Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E.ZVETKOVA, E.NIKOLOVA, E.KATZAROVA và G.KOSTOV cũng đã chứng minh được rằng dịch

chiết nước nóng từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD3 +T và CD4 + T trong ống nghiệm [51]

- Nguyễn Thị Ngọc Trâm, I.Yanchev, E.Zvetkova Đã tiến hành thử nghiệm gây ung thư trên chuột đực giống Wistar từ 50 đến 55 ngày tuổi bằng cách cấy dưới da hoá chất gây ung thư 20-methylcholanthrene, và tiến hành thí nghiệm cho uống những chất chiết bằng nước nóng của cây Crinum latifolium L (cây Trinh Nữ Hoàng Cung –Việt Nam) Kết quả đã làm chậm sự tăng trưởng khối u của chuột thí nghiệm [53]

- Theo tác giả Ghosal , một số alcaloid từ Crinum latifolium như: Crinafoline, crinafolidine đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả dương tính [29]

- Theo tác giả E Zvetkova, N.T.Tram, D.Fuchs dịch chiết nước nóng của trà túi lọc Trinh nữ hoàng cung có khả năng kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát triển tăng sức đề kháng của cơ thể mạnh hơn trà xanh [58]

- Dịch chiết nước của Crinum latifolium L có khả năng kích thích tế bào lympho T của người hoạt động và phát triển [52]

- Dịch chiết nước nóng từ Crinum latifolium L Việt Nam tạo nên một

số tác dụng mạnh trực tiếp mà nguyên nhân do kích thích một số hỗn hợp những tế bào Lympho CD4+/CD8+, là sự sản xuất số lượng lớn

những tác nhân diệt ung bướu như TNF - α trong các sinh vật và bệnh nhân ung thư

- Các alcaloid ngăn chặn sự phát triển của khối u và kích thích hệ miễn dịch

• Epoxyambellin [31] ở nồng độ 5 mg/ml kích họat vừa phải tế bào Lympho trong lách chuột

• Hỗn hợp Epoxyambellin và ambellin [31] theo tỉ lệ (1:1) gây hoạt hóa tế bào Lympho T giống như concanavalin A [32]

• Crinamine và 6 – Hydroxycrinamine [33]

• Hoạt động chống lại tế bào u hắc tố chuột BL6

• Lycorin, crinamin và Augustin [34]

Lycorin ở nồng độ 0,1 – 0,5 mg/ml diệt tế bào MM46 và ức chế sự tổng hợp DNA (Deoxyribonucleic Acid)

- Lycorin ức chế sự tổng hợp protein và DNA của tế bào lách chuột và ức chế tế bào u báng cấy ở chuột

- Lycorin làm giảm khả năng sống của tế bào u

- Lycorine ức chế sự tổng hợp vitamin C trong cây cỏ, làm ngừng sự phát triển virus gây bệnh bại liệt

- Ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt và Enzym polipeptidas và có tác dụng kháng virus

- Lycorin có độc tính cấp thấp

- Lycorin - O – Glycosid ở mức liều microgram gây kích thích các tế bào lympho lách chuột nhắt trắng, cĩ tác dụng tăng cường miễn dịch Psendolycorin cĩ tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào Hela, ngăn cản

sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại quá trình tổng hợp DNA

- Chống vi khuẩn và chống nấm [36]

1.3 Các thuốc kích thích hệ miễn dịch

Trên thế giới đã có một số loại thuốc kích thích hệ miễn dịch được sử dụng như:

a Các chất miễn dịch nội sinh:

• Interleukin-2; Interferon [9, 43, 45, 15]

b Các chất kích thích miễn dịch từ các nguồn khác:

• Từ vi khuẩn, virút, ký sinh trùng, nấm như: BCG, MDP, Bronchovachon, lentinan [20, 16, 17, 18, 19, 39, 47, 25]

• Từ nguồn tổng hợp hóa học: Levanisal, nimuthiol [26, 35, 39, 59, 22]

c Từ nguồn gốc thực vật lectin của một số loại họ đậu, tầm gửi và taxol chiết từ cây thông đỏ (Taxus baccata L.) [21, 23,]

Hiện nay bệnh ung thư ngày càng nhiều Đứng trước thảm họa đó chúng tôi thấy rằng cần tìm ra loại thuốc mới hỗ trợ điều trị bệnh ung thư từ những alcaloid và flavonoid chiết xuất từ lá và hoa của cây Trinh nữ

hoàng cung (Crinum latifolium L.)

Việt Nam sẽ cĩ một viên thuốc hỗ trợ điều trị ung thư cĩ hiệu quả cao từ

dược thảo Việt nam – cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)

Sản phẩm ra đời sẽ chứng minh được ngành Dược Việt Nam, trí tuệ Việt Nam cĩ thể tạo ra sản phẩm mới cĩ tầm quốc tế nếu các nhà khoa học đem hết tâm huyết, sức lực tập trung cho nghiên cứu khoa học và thật sự muốn nâng tầm hiểu biết của mình cần phải hợp tác quốc tế để học hỏi kinh nghiệm nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trong nước và quốc tế Tính đến tháng 12 năm 2006 trong nước chưa cĩ một dạng thuốc nào được bào chế từ nguyên liệu chiết xuất của cây Trinh nữ hồng cung hỗ

trợ điều trị ung thư Do đó, nhiệm vụ của đề tài phải khẳng định được và tạo ra nguyên liệu làm thuốc là các phân đoạn alcaloid và flavonoid có khả năng hỗ trợ điều trị ung thư, kích thích tế bào lympho T hoạt động và phát triển, ức chế sự phát triển của tế bào để kéo dài thời gian sống của động vật bị ung thư

2 TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

- Người mắc bệnh ung thư ngày càng tăng, do vậy nhu cầu thuốc chữa bệnh ung thư là cần thiết và cấp bách Kết quả nghiên cứu đánh giá được tác dụng điều trị ung thư của các phân đoạn alcaloid và flavonoid chiết

xuất từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) có thể sử dụng làm

nguyên liệu để sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Kết quả này sẽ tạo công ăn việc làm cho người lao động, có thuốc tốt phục vụ sức khỏe cộng đồng với giá thành hợp lý phù hợp với thu nhập của người lao động Việt Nam Sản phẩm có khả năng sẽ xuất khẩu sang các nước thu ngoại tệ góp phần làm cho đất nước giàu mạnh Sản phẩm thuốc mới đi từ Trinh nữ hoàng cung sẽ góp phần bình ổn giá thuốc trong nước và thể hiện trí tuệ của người Việt Nam có thể tạo ra được những sản phẩm thuốc mới từ dược thảo hỗ trợ điều trị bệnh ung thư

3 MỤC TIÊU CỦA NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ

1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây Trinh nữ

hoàng cung (Crinum latifolium L.)

2 Đánh giá được khả năng kích thích miễn dịch chống ung thư của các phân đoạn alcaloid và flavonoid được chiết xuất từ lá của cây Trinh

nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản

xuất thuốc hỗ trợ điều trị ung thư

4 NỘI DUNG CỦA NHIỆM VỤ

4.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá cây Trinh nữ

hoàng cung (Crinum latifolium L.)

- Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung

4.2.1 Chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch in vivo và in vitro của

các phân đoạn Alcaloid và Flavonoid và viên nang Crila

- Thí nghiệm in vivo:

Đánh giá khả năng phục hồi, tăng cường dòng tế bào lympho T và dòng tủy của viên nang Crila trên chuột nhắt trắng random bị chiếu tia gamma

- Tác dụng gây phân bào (mitogenic activity) in vitro của các phân đoạn

H1 (flavonoid), C1(alcaloid) và viên nang Crila

- Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của viên nang Crila

và các phân đoạn C1, C2, C3 (alcaloid), H1 (flavonoid) trên bạch cầu đơn nhân người từ máu ngoại vi (peripheral blood mononuclear cells – PBMN)

- Tác dụng viên nang Crila trên tủy xương chuột nhắt nuôi cấy in vitro

(trong môi trường lỏng và trong thạch)

4.2.2 Nghiên cứu hoạt tính chống ôxy hoá của viên nang Crila thông qua

phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

4.2.3 Thử gây độc tế bào với các dòng ung thư nuôi cấy in vitro

- Với các dòng ung thư phổi, gan, màng tim in vitro

- Thử độc tế bào in vitro của viên nang Crila và phân đoạn H1 trên tế bào

ung thư tuỷ Graffi nuôi cấy

4.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vivo được chứng minh trên chuột

Wistar và chuột Hamster

- Nghiên cứu tác dụng của viên nang Crila và phân đoạn C1, H1 trên chuột Wistar được gây ung thư do hoá chất 20 – methylcholanthrene

- Đánh giá hoạt tính gây độc in vivo của viên Crila Việt Nam sử dụng tại

chỗ khối u tế bào tuỷ Graffi ở chuột Hamster

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

- Nguyên liệu dùng để chiết xuất:

Lá cây Trinh nữ hoàng cung thu hái vào tháng 4 năm 2007 tại Trại dược liệu Long Thành – Đồng Nai

- Nguyên liệu dùng để thử tác dụng sinh học:

+ Các phân đoạn chiết xuất alcaloid C1, C2, C3

+ Phân đoạn chiết xuất Flavonoid

+ Viên nang Crila được sản xuất từ alcaloid tổng C = C1+ C2 + C3 viên thuốc Crila đang được lưu hành trên thị trường với SĐK

VNB-3391-05

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp nghiên cứu chiết xuất: phương pháp ngấm kiệt

- Các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Phương pháp hoá lý: cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), khối phổ (MS), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), quang phổ hồng ngoại (IR), quang phổ tử ngoại (UV)

- Phương pháp gây độc tế bào – tác giả Skehan (1990) và

Likhiwitayawuid (1993)

- Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của các tác giả Shela G., Olga, M B., Elena, K (2003) Dựa trên nguyên tắc chất 1,1-

diphenyl – 2 – picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bên trong dung dịch EtOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất đem thử có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxy hóa thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm

- Các nghiên cứu in vitro (trong ống nghiệm):

Tác động trong ống nghiệm của Crila và các phân đoạn H1, C1,C2,C3 lên

sự hoạt hoá và lên sự sinh sôi nảy nở của các tế bào đơn nhân của máu ngoại vi của người (hPBMCs) (106 tế bào/ml ở môi trường nuôi cấy) đã được nghiên cứu trong các điều kiện nuôi cấy tế bào dễ thay đổi trong thời gian ngắn Các liều Crila dùng là 10-25µg/ml ở môi trường nuôi cấy RPMI 1640 được bổ sung với FBS v.v…, liều của các phân đoạn H1, C1, C2, C3

Máu ngoại vi và các mạch bạch huyết cũng là 10-25 µg/ml ở môi trường nuôi cấy (RPMI 1640 đã được bổ xung với FBS v.v…)

Các kiểm tra rõ ràng chắc chắn bằng lectin, convanavaline A (Con A) cũng đã được thực hiện ở các liều 10 và 25 µg/ml môi trường nuôi cấy Các kết quả thí nghiệm thu được đã được ghi chép, (bằng kính hiển vi quang học) trên Giemza

Việc tìm hiểu tính gây độc tế bào (cũng là các tác động chống khối u) của Crila đã được thực hiện trong các điều kiện nuôi cấy tế bào u tủy sống Graffi (106 tế bào/ ml môi trường nuôi cấy) với các liều của Crila 10 - 25µg/ml môi trường nuôi cấy (RPMI 1640 được bổ sung với FBS v.v ) và

bổ sung bằng các phương pháp về tế bào học đã được mô tả

Các khám phá in vivo (ở cơ thể sống)

50 con chuột đực thuộc loại Wistar 50-55 ngày tuổi đã được dùng cho việc tạo khối u bằng hóa chất gây ung thư Thực hiện việc tiêm dưới da chất

vật được chia thành 2 nhóm – (một nhóm được điều trị bằng thuốc Crila và các phân đoạn) và một nhóm để đối chứng (không được điều trị)

Các liều của Crila và các phân đoạn H1, C1, C2, C3 bước đầu đưa vào trong

10 ngày/28,35 g) - sau khi xuất hiện các khối u là 500mg/kg thể trọng chuột/ngày

Việc xác định các con chuột sống sót, việc ức chế sự tăng trưởng của khối

u, cũng như việc áp dụng các kỹ thuật về mô học và thực hiện thống kê đã được áp dụng theo các phương pháp P.Zajac

- Phương pháp nghiên cứu in vitro Gây suy giảm miễn dịch và suy tế

bào dòng tuỷ: Chuột được chiếu tia gamma 100rad/ngày x 06ngày (tại bệnh viện K Hà Nội) trên máy Picker (Mỹ), trường chiếu 35cm x 35cm, khoảng cách 80cm, xuất liều 94,38rad/min

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid và flavonoid từ lá của cây trinh

nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

3.1.1 Chiết xuất các phân đoạn alcaloid từ lá của cây trinh nữ hoàng

cung (Crinum latifolium L.)

a Chiết alcaloid toàn phần

Chiết alcaloid dựa vào tính tan của chúng, các alcaloid dạng muối tan trong nước, các alcaloid dạng bazơ tan trong dung môi hữu cơ Để có mẫu

là các phân đoạn alcaloid đưa thử sàng lọc tác dụng sinh học điều trị ung thư, chúng tôi tiến hành chuẩn bị mẫu thử để chuyển sang nghiên cứu tại Viện Hàn Lâm Khoa học Bungari và Áo

Chúng tôi tiến hành chiết alcaloid toàn phần theo quy trình sau:

• Chuẩn bị nguyên liệu lá Trinh nữ hoàng cung được thu hái vào tháng 4/2007 tại Trại Dược Liệu, Long Thành, Đồng Nai

- Lá TNHC được rửa sạch, phơi khô, sấy khô ở nhiệt độ 50 đến 60o, xay thành bột

- Lấy 10 kg bột lá TNHC làm ẩm bằng dung môi chiết xuất

- Ngâm với ethanol 70o/acid acetic 2% (chỉnh pH = 4) các dịch chiết cồn, acid thu được đem lọc rồi kiềm hóa bằng amoniac đến pH = 9-10, sau đó lắc với chloroform nhiều lần đến khi chiết kiệt hết alcaloid, ( kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff)

- Tinh chế: dịch chloroform được lọc, sau đó lắc nhiều lần với HCl 0,1N gộp dịch chiết acid rồi kiềm hóa dịch bằng NH4OH đến pH= 9-

10 Dịch chiết đã kiềm hoá tiếp tục lắc với CHCl3, sau đó cất thu hồi dung môi CHCl3 thu được 135g alcaloid toàn phần

b Tiến hành tách các phân đoạn alcaloid bằng sắc ký cột nhanh, chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải CHCl 3 :MeOH

- Tăng dần tỷ lệ MeOH (1, 5, 7%) thu được 9 phân đoạn từ C1 đến C9 Chúng tôi đã đem tất cả các phân đoạn sàng lọc tác dụng sinh học nhưng chỉ có 3 phân đoạn từ C1 đến C3 có tác dụng kích thích hệ miễn dịch ngăn ngừa sự phát triển của tế bào u, kết quả này sẽ được chứng minh ở phần nghiên cứu đánh giá tác dụng của các phân đoạn alcaloid

có hoạt tính sinh học điều trị ung thư ở phần sau

Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần và

C2

Bột lá TNHC + ethanol 70o/acid acetic

Dịch lọc

Dịch chiết acid Dịch chiết CHCl3

Lọc

+ NH4OH (pH = 9-10) + CHCl3

+ HCl 0,1N

Lọc + NH4OH (pH = 9-10) + CHCl3

Alcaloid toàn phần

Đã được tinh chế

Dịch chiết CHCl3

Loại dung môi CHCl3

Sắc ký cột nhanh với hệ dung môi rửa giải CHCl3: MeOH MeOH tăng dần

C1

C3

3.1.2 Chiết xuất các phân đoạn flavonoid từ lá của cây trinh nữ hoàng cung

(Crinum latifolium L.)

a Chiết xuất flavonoid toàn phần

- Dược liệu lá TNHC được sấy khô ở nhiệt độ từ 50 đến 60oC tán bột

- Cân 5kg bột dược liệu

- Làm ẩm, ngâm bột dược liệu trong MeOH (3 lần) Dịch chiết thu được, cô loại dung môi, cặn thu được hòa tan trong nước nóng rồi lọc, phần dịch chiết thu được điều chỉnh pH = 4 với acid acetic, sau đó chiết với EtOAC

- Làm khan dịch chiết EtOAC bằng Na2SO4 khan, loại dung môi, thu được 18,3g flavonoid toàn phần

b Tách các phân đoạn flavonoid bằng phương pháp sắc ký cột nhanh với, chất hấp phụ silicagel 60

- Rửa giải bằng hệ dung môi EtOAC/n-Hexan với lượng EtOAC tăng dần từ 5%, 10%, … 50% và hệ dung môi EtOAC/MeOH với MeOH tăng từ 0%, 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, thu được 11 phân đoạn flavonoid từ H1 đến H11

- Phân đoạn H1 được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển n-hexan/EtOAC 50% Kiểm tra bằng thuốc thử FeCl3 cho màu xanh đen và phản ứng Shinoda cho kết quả dương tính (+)

Sơ đồ chiết xuất phân đoạn flavonoid H1 từ lá cây

Dịch chiết MeOH

Dịch chiết EtOAc Dịch chiết

Dịch chiết nước Cắn

3.1.3 Máy móc thiết bị chiết xuất

- Hệ thống thiết bị chiết xuất được thiết kế, chế tạo, lắp đặt dựa trên yêu cầu kỹ thuật chiết xuất ngấm kiệt và bào chế viên nang cứng

- Máy móc thiết bị được thiết kế chế tạo trong nước

- Hệ thống thiết bị có thể chiết xuất alcaloid và flavonoid

- Hệ thống thiết bị có công suất phù hợp với yêu cầu tăng số lượng sản phẩm theo yêu cầu của thị trường

Bảng 1: Máy móc thiết bị chủ yếu

2 Hệ thống xử lý nước 01 hệ

thống

250lít /giờ Việt Nam

3 Hệ thống bình ngấm kiệt 12 bình 220-250kg/bình Việt Nam

4 Hệ thống cô chân không

và thu hồi dung môi

01 hệ thống

Tốc độ thu hồi cồn và tách nước 50lít/giờ

Việt Nam

7 Bồn Inox chứa dịch, cồn 5 cái 1200 lít Việt nam

8 Bồn Inox chứa dịch, cồn 5 cái 500 lít Việt Nam

11 Máy xay dược liệu 1 cái 50kg/giờ Việt Nam

3.1.4 Xác định thành phần hóa học của phân đoạn alcaloid C 1 và phân đoạn flavonoid H 1

3.1.4.1 Xác định thành phần hóa học của phân đoạn alcaloid C 1

Sau khi sàng lọc thông qua kết quả nghiên cứu in vitro và in vivo của

Viện Hàn Lâm Khoa học Bungari, chúng tôi mới tiến hành xác định thành phần hóa học của các phân đoạn C1, C2, C3 Do điều kiện thời gian và kinh phí nên chúng tôi mới xác định được thành phần hoá học của phân đoạn C1 bằng phương pháp sắc ký khí/ khối phổ GC-EIMS với máy Hewlett packard 5972, có cột mao dẫn (capillary) HP1-MS độ dày 0,25 µm khí mang là Helium, chương trình nhiệt độ là 150 tăng dần lên đến 270, thế năng 70 eV, đã xác định phân đoạn C1 gồm 16 alcaloid Kết quả thể hiện ở bảng 2 (kết quả nghiên cứu này đã được đăng tải trên tạp chí Z.Naturforch (đính kèm báo cáo ở phần phụ lục)

Bảng2: Các acaloid trong phân đoạn C 1

3.1.4.2 Xác định thành phần hóa học phân đoạn flavonoid H 1

- Sau khi đánh giá tác dụng sinh học điều trị ung thư của các phân đoạn từ H1 đến H11 thông qua nghiên cứu in vitro và in vivo của các phân đoạn ở Viện Hàn Lâm Khoa Học Bungari Kết quả cho thấy chỉ có phân đoạn H1 có tác dụng sinh học

- Để có chất chuẩn hoặc chất điểm chỉ trong nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn (định tính, định lượng phân đoạn flavonoid H1) chúng tôi tiến hành tách các chất có trong phân đoạn H1, làm sạch và xác định cấu trúc

- Phân lập các chất từ phân đoạn H1 bằng sắc ký cột nhanh với hệ dung môi CHCl3/MeOH với cột silicagel có đường kính 10 cm, khối lượng mẫu H1 40g(được tách từ 1098g flavonoid toàn phần), silicagel 800g, dung môi ổn định cột là CHCl3, hệ dung môi rửa giải CHCl3/MeOH tăng dần theo tỉ lệ (95:5, 90:10, 85:15, 80:20) Tại phân đoạn 90:10 thu được chất HcBO1 (80mg)

- Kiểm tra HcBO1 bằng sắc ký lớp mỏng, chất hiện vết là H2SO4 trong EtOH Kết quả cho thấy trong hệ dung môi CHCl3/MeOH (75:25), HcBO1 có giá trị Rf = 0,33 và trong hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O (8:2:0,3) Trong hệ dung môi này HcBO1 có giá trị Rf = 0,36, vết tròn có màu vàng

- Tiến hành nghiên cứu cấu trúc của chất HcBO1 bằng các phương pháp phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều proton-proton) Phổ hồng ngoại IR (λ max, cm-1) của chất HcBO1 được đo trên máy FT-IR spectometek Vectok 22 của Mỹ

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và HMBC được ghi trên máy DRX500, tần số 500 MHz (BRUCKER AVANCE) độ dịch chuyển hóa học được tính theo δ ppm, hằng số tương tác J tính bằng Hz

* Xác định cấu trúc của chất HcBO1:

- Chất HcBO1 có dạng bột màu vàng điểm nóng chảy 160-161oC Kết quả phổ hồng ngoại: có đỉnh hấp thụ 3423,36 (OH), ở giá trị

- Phổ DEPT 135 cho 1 peak CH2- kề oxygen

- Tín hiệu CH ở δ = 104.18 ppm là mũi tại vị trí C1' của đường, kết hợp phổ 1H-NMR và phổ HSQC có tín hiệu δ = 5.25 ppm (1H, d, J

= 7.5 Hz) gắn vào vị trí C1' chứng tỏ đường nối với khung aglycon bằng liên kết β Mặt khác 5 tín hiệu tại 75.77; 78.42; 71.41; 78.08; 62.68 kết hợp các tương tác trên các phổ HSQC, HMBC Như vậy trong phân tử có một gốc đường glucose có 6 carbon

- Khi định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) cùng với chất đối chứng

là kaempferol, với hệ dung môi CHCl3/MeOH 82:2:0,3 cho hai vết tròn màu vàng có cùng giá trị Rf = 0,36, với chất hiện màu là H2SO4, điều đó chứng tỏ chất HcBO1 là kaempferol

- Để có thêm thông tin khẳng định HcBO1 là kaempferol, chúng tôi

đã nghiên cứu với phổ HMBC cho thấy có sự tương tác H1” và C3, như vậy phần đường gắn vào aglycon ở vị trí 3 (bảng 3)

Hz)

HMBC (H - > C)

5.25, d, J=7.5 H1”→ C3 2” 75.77 >CH–O– 3.41, m H2”→ C3”

3” 78.42 >CH–O– 3.48, m H3”→ C4”,2”,5”

OH OH

HO

H

OH O

2

3 4 5 6

7

8 9

Việc xác định được một chất trong phân đoạn H1 kaempferol là cơ sở để

có chất điểm chỉ tinh khiết sử dụng trong định tính, định lượng phân đoạn H1 flavonoid Chất kaempferol là một trong những chất được đánh giá có tác dụng sinh học gây độc tế bào ung thư Tác dụng sinh học của phân đoạn H1 được đánh giá bằng hàm lượng của kaempferol có trong phân đoạn H1

3.1.5 Tiêu chuẩn hóa sản phẩm

Để đánh giá được chất lượng của sản phẩm phân đoạn C1, C2, C3 chúng tôi tiến hành xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của phân đoạn C1, C2, C3 dựa trên kết quả nghiên cứu của dự án KC.10.DA17 phần nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao do Viện Kiểm Nghiệm TW thực hiện

TỔNG CÔNG TY DƯỢC VIỆT NAM Số: 08-P 1 -0107-2009

CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

CAO LỎNG

TRINH NỮ HOÀNG CUNG PHÂN ĐOẠN C 1

Có hiệu lực từ :

Ban hành theo quyết định số : ………… ngày………

I YÊU CẦU KỸ THUẬT

- Escherichia coli: Khơng được cĩ

- Pseudomonas aeruginosa: Khơng được cĩ

- Staphylococcus aureus: Khơng được cĩ

- Thuốc hiện màu: Dragendorff (TT)

- Bột lá khô cây Trinh Nữ Hoàng Cung

b.) Mẫu thử:

Lấy 1g cao lỏng chế phẩm, phân đoạn C1 cho vào một bình nón dung tích 50ml Thêm vào đó 25ml Ethanol rồi đun trong cách thủy 30 phút Lọc

dịch chiết sang một bình nón khác có dung tích 25ml, làm khô trên cách thủy Hòa tan cắn với 3ml Chloroform – Methanol (9:1) ta có dung dịch mẫu thử

c.) Mẫu đối chiếu:

Lấy 1g cao lỏng chuẩn (phòng thí nghiệm) phân đoạn C1 cho vào một bình nón dung tích 100ml Chiết 3 lần mỗi lần 15ml Ethanol ở 900: Gộp dịch chiết và lọc; cô dịch lọc đến khô trên cách thủy Hòa tan cắn với 3ml Chloroform – Methanol (9:1) ta có dung dịch mẫu đối chiếu

d.) Tiến hành:

Chấm lần lượt dung dịch mẫu thử và mẫu đối chiếu lên bản mỏng Silicagel

GF 254 (mỗi mẫu 20 µl), để khô ngoài không khí Triển khai sắc ký theo chỉ dẫn của Dược điển Việt Nam III, 2002 (phụ lục 4.4, PL 86) với hệ

dung môi Chloroform – Methanol – Amoniac 25% (7 : 1 : 1)

Thuốc thử hiện màu: Dragendorff

e.) Kết quả:

Trên sắc ký đồ, mẫu thử phải cho các vết có trị số Rf và cường độ màu sắc tương ứng với các vết của mẫu đối chiếu

4 Định lượng

4.1 Định lượng alcaloid tồn phần

Cân chính xác khoảng 3g chế phẩm cao lỏng phân đoạn C1 cho vào một bình nón dung tích 100ml Thêm vào đó 30 ml dung dịch acid sulfuric 2%, đun cách thủy ở 600C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc cho tan hết, lọc, tráng bình và giấy lọc với 10ml dung dịch acid sulfuric 2% Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac đến pH = 11 Chiết alcaloid base bằng 45ml chloroform (15

ml, 10 ml, 10ml).Gộp và rửa dịch chiết chloroform với nước cất đến hết phản ứng kiềm Làm khan với Na2SO4 rồi bốc hơi chloroform trên cách thuỷ đến khô Thêm 1ml cồn trung tính 900 để hoà tan

Thêm chính xác 25ml acid hydrocloric 0,02 N (TT) vào dung dịch và

3-4 giọt dung dịch Methyl đỏ (CT) Chuẩn độ acid hydrocloric thừa bằng dung dịch Natri hydroxyd 0,02 N (TT) cho đến khi màu của dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

Song song làm một mẫu trắng đối chứng

Hàm lượng % alcaloid toàn phần được tính theo công thức sau, biết rằng 1ml dung dịch acid hydrocloric 0,02N tương đương với 0,0057464g lycorin

X% =

(V1 – V2) x 0,0057464(g) x 100

m (g)

Ở đây:

V1: Số ml dung dịch Natrihydroxyd 0,02N đã dùng cho mẫu trắng

V2: Số ml dung dịch Natrihydroxyd 0,02N đã dùng cho mẫu thử

m: Khối lượng cao khô đã cân để định lượng

X%: Hàm lượng % của alcaloid toàn phần tính theo lycorin của cao

4.2 Định lượng Crinamidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Acetonitril: Loại dùng cho sắc ký lỏng

- Kali dihydrophosphat, triethylamin, acid hydrocloric, chloroform, methanol, amoniac: loại tinh khiết phân tích

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao cĩ khả năng chạy gradient dung mơi

- Detector: UV 285nm

- Pha động: Acetonitril - Đệm phosphat 100mM, pH 3,0 với chương trình

rửa giải như sau:

Thời gian (phút) % Acetonitril % đệm phosphat pH

3,0

0 → 40 10 90 40→41 10→40 90→60

60→61 40→10 60→90

- Tốc độ dịng: 1,0 – 1,5ml/phút (điều chỉnh tốc độ dịng để thời gian lưu

của crinamidin khoảng 30phút)

- Thể tích tiêm: 50µl

- Đệm phosphat 100mM, pH 3,0: pha dung dịch kalidihydro phosphate

trong nước cĩ nồng độ 100mM, thêm 3ml triethylamin cho 1 lít dung dịch trên,

lắc đều, điều chỉnh pH = 3,0 bằng acid phosphoric đặc Lọc qua màng lọc

0,45µm

* Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử:

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch crinamidin trong acid hydrocloric 0,1 N

cĩ nồng độ chính xác khoảng 0,1mg/ml

amoniac đặc, trộn đều đậy kính, để yên trong 1giờ Thêm 50ml hỗn hợp dung

mơi chloroform – methanol (3 :1), lắc siêu âm 30 phút, để lắng, lọc qua giấy lọc

Bã được chiết như trên 4 lần nữa, mỗi lần với 40ml hỗn hợp dung mơi Gộp các dịch chiết hỗn hợp dung mơi, cơ trên cách thuỷ đến cạn Hồ tan và chuyển tồn

bộ cắn vào bình định mức 20ml bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 N, thêm acid hydrocloric 0,1 N đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy lọc thường rồi lọc tiếp qua màng lọc 0,45µm

* Tiến hành:

vào hệ thống sắc ký, tiến hành phân tích theo điều kiện đã nêu trên, ghi sắc ký

đồ Hệ thống sắc ký chỉ đạt yêu cầu khi độ lệch chuẩn tương đối (%) của diện tích pic crinamidin khơng quá 2,0ml, hệ số bất đối xứng trung bình của pic crinamidin khơng quá 1,5, số đĩa lý thuyết trung bình của cột tính theo pic crinamidin khơng dưới 10 000

- Tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ

thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mơ tả, ghi sắc ký đồ

- Tính tốn kết quả:

Hàm lượng % (kl/kl) crinamidin (C17H19NO5) trong lá Trinh nữ hồng cung tính theo dược liệu khơ được tính theo cơng thức:

b)(100M

x A

10

x 20

x C

x AX(%)

- C: nồng độ crinamidin trong mẩu chuẩn (mg/ml)

- M: khối lượng chế phẩm cân để định lượng (g)

- b: Độ ẩm của dược liệu

5 Độ nhiễm khuẩn

Thử theo Dược điển Việt Nam III, 2002 (Phụ lục 10.7, PL191)

TỔNG CƠNG TY DƯỢC VIỆT NAM Số: 08-P 2 -0107-2009

CƠNG TY CP DƯỢC LIỆU TW 2

CAO LỎNG

TRINH NỮ HỒNG CUNG PHÂN ĐOẠN C 2

Cĩ hiệu lực từ: Ban hành theo quyết định số : ………… ngày………

I YÊU CẦU KỸ THUẬT

Dịch lỏng màu đen, hơi sánh, mùi đặc trưng, vị đắng

- Escherichia coli: Khơng được cĩ

- Pseudomonas aeruginosa: Khơng được cĩ

- Staphylococcus aureus: Khơng được cĩ

- Thuốc hiện màu: Dragendorff (TT)

- Bột lá khô cây Trinh Nữ Hoàng Cung

b.) Mẫu thử:

Lấy 1g cao chế phẩm cao lỏng phân đoạn C2 cho vào một bình nón dung tích 50ml Thêm vào đó 25ml Ethanol rồi đun trong cách thủy 30 phút Lọc dịch chiết sang một bình nón khác có dung tích 25ml, làm khô trên cách thủy Hòa tan cắn với 3ml Chloroform – Methanol (9:1) ta có dung dịch mẫu thử

c.) Mẫu đối chiếu:

Lấy 1g cao lỏng chuẩn (phòng thí nghiệm) phân đoạn C2 cho vào một bình nón dung tích 100ml Chiết 3 lần mỗi lần 15ml Ethanol ở 900: Gộp dịch chiết và lọc; cô dịch lọc đến khô trên cách thủy Hòa tan cắn với 3ml Chloroform – Methanol (9:1) ta có dung dịch mẫu đối chiếu

d.) Tiến hành:

Chấm lần lượt dung dịch mẫu thử và mẫu đối chiếu lên bản mỏng Silicagel

GF 254 (mỗi mẫu 20 µl), để khô ngoài không khí Triển khai sắc ký theo chỉ dẫn của Dược điển Việt Nam III, 2002 (phụ lục 4.4, PL 86) với hệ

dung môi Chloroform – Methanol – Amoniac 25% (7 : 1 : 1)

Thuốc thử hiện màu: Dragendorff

e.) Kết quả:

Trên sắc ký đồ, mẫu thử phải cho các vết có trị số Rf và cường độ màu sắc tương ứng với các vết của mẫu đối chiếu

4 Định lượng

Cân chính xác khoảng 3g chế phẩm cao lỏng phân đoạn C2 cho vào một bình nón dung tích 100ml Thêm vào đó 30ml dung dịch acid sulfuric 2%, đun cách thủy ở 600C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc cho tan hết, lọc, tráng bình và giấy lọc với 10ml dung dịch acid sulfuric 2% Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac đến pH = 11 Chiết alcaloid base bằng 45ml chloroform (15 ml, 10

ml, 10ml).Gộp và rửa dịch chiết chloroform với nước cất đến hết phản ứng kiềm Làm khan với Na2SO4 rồi bốc hơi chloroform trên cách thuỷ đến khô Thêm 1ml cồn trung tính 900 để hoà tan

Thêm chính xác 25ml acid hydrocloric 0,02 N (TT) vào dung dịch và

3-4 giọt dung dịch Methyl đỏ (CT) Chuẩn độ acid hydrocloric thừa bằng dung dịch Natri hydroxyd 0,02 N (TT) cho đến khi màu của dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

Song song làm một mẫu trắng đối chứng

Hàm lượng % alcaloid toàn phần được tính theo công thức sau, biết rằng 1ml dung dịch acid hydrocloric 0,02N tương đương với 0,0057464g lycorin

Ở đây:

V1: Số ml dung dịch Natrihydroxyd 0,02N đã dùng cho mẫu trắng X% = (V1 – V2) x 0,0057464(g) x 100

m (g)

m: Khối lượng cao khô đã cân để định lượng

X%: Hàm lượng % của alcaloid toàn phần tính theo lycorin của cao

5 Độ nhiễm khuẩn

Thử theo Dược điển Việt Nam III, 2002 (Phụ lục 10.7, PL191)

TỔNG CƠNG TY DƯỢC VIỆT NAM Số: 08-P 3 -0107-2009

CƠNG TY CP DƯỢC LIỆU TW 2

CAO LỎNG

TRINH NỮ HỒNG CUNG PHÂN ĐOẠN C 3 Cĩ hiệu lực từ :

Ban hành theo quyết định số : ………… ngày………

I YÊU CẦU KỸ THUẬT

- Escherichia coli: Khơng được cĩ

- Pseudomonas aeruginosa: Khơng được cĩ

- Staphylococcus aureus: Khơng được cĩ