Khảo sát thành phần hóa học của lá dâm bụt được thu hái tại huyện hương thủy, tỉnh thừa thiên huế

MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta. Trong vô số các loài thực vật đang tồn tại và phát triển, dâm bụt là một trong những loại hoa được trồng làm cây cảnh và hàng rào khá phổ biến ở Việt Nam. Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt còn được biết đến với nhiều ứng dụng chữa bệnh khác trong các bài thuốc dân gian. Theo Đông y, lá dâm bụt có vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ, nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt, ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ. Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi hộp, đái đỏ. Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho tiêu viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường tiết niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh. Mặt khác, theo nghiên cứu mới nhất, hoa dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh thấp tim. Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây dâm bụt như trên, có rất nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dâm bụt. Thế nhưng đa phần các đề tài đều tập trung vào hoa của cây dâm bụt. Vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ phận khác của cây dâm bụt, nhất là lá cây dâm bụt. Xuất phát từ thực tế trên, với mục đích góp phần nghiên cứu thành phần hóa học loài cây này em xin chọn đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học của lá dâm bụt đƣợc thu hái tại huyện Hƣơng Thủy, tỉnh Thừa Thiên Huế”, nhằm làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn các hoạt tính sinh học cũng như việc sử

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn Một trong những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta

Trong vô số các loài thực vật đang tồn tại và phát triển, dâm bụt là một trong những loại hoa được trồng làm cây cảnh và hàng rào khá phổ biến ở Việt Nam Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt còn được biết đến với nhiều ứng dụng chữa bệnh khác trong các bài thuốc dân gian Theo Đông y,

lá dâm bụt có vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ, nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt, ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi hộp, đái đỏ Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho tiêu viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường tiết niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh Mặt khác, theo nghiên cứu mới nhất, hoa dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh thấp tim

Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây dâm bụt như trên, có rất nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dâm bụt Thế nhưng đa phần các đề tài đều tập trung vào hoa của cây dâm bụt Vẫn còn rất ít nghiên cứu về các bộ phận khác của cây dâm bụt, nhất là lá cây dâm bụt

Xuất phát từ thực tế trên, với mục đích góp phần nghiên cứu thành phần

hóa học loài cây này em xin chọn đề tài: “ Khảo sát thành phần hóa học của lá

dâm bụt được thu hái tại huyện Hương Thủy, tỉnh Thừa Thiên- Huế”, nhằm

làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn các hoạt tính sinh học cũng như việc sử

dụng cây dâm bụt trong tương lai Qua đó, góp phần tăng thêm giá trị sử dụng

của loại cây này

2 Đối tượng nghiên cứu

Lá dâm bụt được lấy từ vườn tại huyện Hương Thủy , tỉnh Thừa Thiên –

Huế

3 Mục đích nghiên cứu

- Xác định một số thông số hóa lý của lá dâm bụt

- Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số hợp chất có trong lá dâm bụt

4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:

4.1 Nghiên cứu lý thuyết

Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồng nghiệp

4.2 Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lí mẫu

- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng hữu cơ

- Phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử để xác định hàm lượng các kim loại trong lá dâm bụt, phương pháp sắc ký khí – khối phổ liên hợp (GC–MS), phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ liên hợp (LC–MS) nhằm phân tách và xác định thành phần định tính và định lượng các hoạt chất chính trong các dịch chiết

- Phương pháp ngâm chiết mẫu

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp những thông tin khoa học ban đầu về thành phần hóa học có trong lá dâm bụt ở Thừa Thiên - Huế

- Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang

Kết quả và thảo luận: 25 trang

Kết luận và kiến nghị: 2 trang

Tài liệu tham khảo: 3 trang

Phụ lục: 15 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chi Dâm bụt

Chi Dâm bụt, chi Râm bụt hay chi Phù dung (danh pháp khoa học:

Hibiscus) là một chi lớn chứa khoảng 200-220 loài thực vật có hoa trong họ Cẩm

quỳ (Malvaceae), có nguồn gốc ở khu vực ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới

trên khắp thế giới

Chi này bao gồm các loại cây thân thảo sống một đến nhiều năm giống

như các loại cây bụi thân gỗ và cây thân gỗ nhỏ Lá mọc so le, loại lá đơn hình

trứng hay hình mũi mác, thông thường với mép lá dạng răng cưa hay dạng thùy

Hoa lớn, dễ thấy, hình kèn, với 5 cánh hoa, có màu từ trắng tới hồng, đỏ, tía hay

vàng và rộng từ 4–15 cm Quả là loại quả nang năm thùy khô, chứa vài hạt trong

mỗi thùy, được giải phóng khi quả nang tách ra khi chín [1, 3]

Nhiều loài trong chi này được trồng do có hoa sặc sỡ cũng như làm hàng

rào trong một số vườn hay công viên Hibiscus syriacus là loài quốc hoa của Hàn

Quốc, trong khi Hibiscus rosa-sinensis là loài quốc hoa của Malaysia còn

Hibiscus brackenridgei là loài hoa của bang Hawai„i

Hình 1.1 Loài Hibiscus rosa-sinensis

(Quốc hoa của Malaysia)

Hình 1.2 Loài Hibiscus syriacus

(Quốc hoa của Hàn Quốc)

Trong khu vực ôn đới, loài được trồng làm cảnh nhiều nhất có lẽ là

Hibiscus syriacus Tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, Hibiscus rosa-sinensis

với nhiều giống lai có hoa sặc sỡ, là loại cây cảnh phổ biến [1, 3]

Trong chi dâm bụt có 200-220 loài đã được biết, các loài được đặt tên theo đặc điểm riêng của chúng

+ Phân loại theo đặc điểm của hoa:

 Hibiscus brackenridgei - dâm bụt hoa vàng, dâm bụt Hawaii

 Hibiscus hamabo - dâm bụt hoa vàng Nhật Bản

 Hibiscus tiliaceus - dâm bụt hoa vàng, hoàng cận, dâm bụt Hawaii

 Hibiscus clayi - dâm bụt Hawaii ( hoa đỏ)

 Hibiscus kokio - dâm bụt Hawaii (koki'o 'ula), dâm bụt hoa đỏ

 Hibiscus schizopetalus - dâm bụt hoa đỏ cánh nhỏ

+ Phân loại theo đặc điểm của lá

 Hibiscus dasycalyx - dâm bụt lá hẹp

 Hibiscus macrophyllus- dâm bụt lá to, đại diệp mộc cận

 Hibiscus laevis hay Hibiscus militaris - dâm bụt lá kích

 Hibiscus acetosella - phù dung lá đỏ, phù dung châu Phi

+ Phân loại theo đặc điểm của thân cây

 Hibiscus mutabilis - phù dung thân gỗ, phù dung núi, hoa phù dung

 Hibiscus mutabilis versicolor

 Hibiscus rosa-sinensis - dâm bụt thân gỗ, mộc cận, đại hồng hoa,

phù tang (phật tang)

 Hibiscus rosa-sinensis L 'Cooperi hay Hibiscus cooperi

 Hibiscus rosa-sinensis L 'Hawaiano'

 Hibiscus syriacus - dâm bụt thân gỗ, mộc cận

+ Phân loại theo khu vực mọc:

 Hibiscus moscheutos - phù dung quỳ, dâm bụt đầm lầy

 Hibiscus coulteri - dâm bụt sa mạc

 Hibiscus taiwanensis - phù dung núi

+ Phân loại theo địa diểm phân bố

 Hibiscus furcellatus - dâm bụt Hawaii ('akiohala)

 Hibiscus coccineus hay Hibiscus semilobatus - dâm bụt Mỹ, Texas

Star

 Hibiscus splendens - dâm bụt Úc

 Hibiscus yunnanensis - phù dung Vân Nam

 Hibiscus trionum hay Hibiscus africanus, Hibiscus hispidus - cẩm

quỳ Venice, hoa một giờ

1.2 Khái quát về cây dâm bụt ở Việt Nam

Tên thường gọi : Cây dâm bụt, Bông bụt

Tên khác : Hồng bụt, Phù tang, Xuyên cân bì, Mộc cẩn, Bụp, Co ngắn (Thái), Bioóc ngàn (Tày), Phầy quấy phiằng (Dao)…

Tên khoa học : Hibiscus rosa – sinensis L

Hình 1.3 Cây dâm bụt thường

Phân loại khoa học

Chi : Dâm bụt (Hibiscus L.)

Loài : Cây dâm bụt (Hibiscus rosa sinensis L.) [1,3]

Dâm bụt là loài cây thân gỗ, sống lâu năm, cây nhỏ, chiều cao trung bình

1,5- 2 m Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to Hoa ở

nách lá, lưỡng tính, khá lớn, 6-7 mảnh đài nhỏ (tiểu đài), hình sợi; đài hợp màu

lục dài gấp 2- 3 lần đài nhỏ; tràng 5 cánh hoa màu đỏ; nhị nhiều, tập hợp trên 1

trụ đài; bầu hình trụ hay hình nón, mùa hoa chủ yếu vào tháng 5-7

Dâm bụt là 1 cây cảnh và cây hàng rào phổ biến nước ta và nhiều nước

nhiệt đới khác Dâm bụt có nhiều loại:

+ Dâm bụt thường có dáng hoa cong, cánh hoa có răng cưa

+ Dâm bụt kép với hoa thẳng, nhiều cánh hoa

+ Dâm bụt xẻ hoa buông thõng, cánh hoa xe thùng và răng không đều

+ Dâm bụt hoa nhỏ, hoa mọc rủ, cánh hoa nguyên không bao giờ nở xòe

Hình 1.4 Dâm bụt thường Hình 1.5 Dâm bụt kép

Dâm bụt là loại thực vật được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới khí hậu ẩm Đặc biệt, dâm bụt là loại cây rất thông dụng tại Viêt Nam được trồng nhiều tại các khu vực ven biển do cây có biên độ sinh thái rất lớn, có khả năng chịu đựng được các điều kiện khí hậu khắc nghiệt rất cao: nắng nóng, mưa bão, đất cát… Loài dâm bụt của Trung Quốc, Nhật Bản, được trồng làm hàng rào, làm cây cảnh phổ biến ở nhiều nơi Người ta thu hái rễ và lá quanh năm, thu hái hoa vào mùa hè Có thể dùng tươi hay phơi khô dùng dần

1.3 Một số ứng dụng của cây dâm bụt trong thực tế

Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt được biết đến như

là một vị thuốc trong Đông y [2, 4]

+ Lá dâm bụt vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ,

nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt, ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ

+ Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi hộp, đái đỏ… + Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho tiêu viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường tiết niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh

Đặc biệt, y dược học hiện đại cũng chú ý nghiên cứu cây dâm bụt Gần đây Giáo sư Chau Jong Wang trường Đại học Y Chung San (Đài Loan) phát hiện hoa dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol trong máu và giảm nguy cơ bệnh thấp tim (The Guardian 9-2004) [23] Nghiên cứu nước chiết xuất hoa dâm bụt các nhà khoa học phát hiện nước chiết này làm hạ thấp đáng kể mức cholesterol trong máu, ngăn ngừa có hiệu quả quá trình oxy hoá của lipoprotein, bảo vệ thành động mạch thêm vững chắc (Science of Food and Agrriculture) Đây là nghiên cứu đầu tiên cho thấy hiệu quả kỳ diệu của hoa dâm bụt Các nhà khoa học còn cho biết tác dụng chữa bệnh của hoa dâm bụt được nâng cao hơn nữa nếu kết hợp với rượu vang đỏ và chè để làm giảm lượng cholesterol và lipid

trong máu Như vậy cây dâm bụt vừa là cây cảnh đẹp vừa là cây thuốc quý, là nguồn gen quý của nước ta

1.4 Tình hình nghiên cứu các loài dâm bụt trên thế gi i

Theo nghiên cứu của Shivananda Nayak và đồng nghiệp, loài dâm bụt

Hibiscus rosa sinensis có tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương ở chuột Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết của Hibiscus rosa sinensis L với

ethanol khi được hòa vào nước uống (120 mg/kg - 1 ngày) có tác dụng làm lành vết thương trên nhóm chuột được thí nghiệm Quá trình làm lành vết thương được đánh giá bằng tỉ lệ co vết thương, độ bền kéo (tensile strength), trọng lượng các mô hạt của vết thương Kết quả, diện tích của vết thương giảm 86% trong khi nhóm động vật chỉ cho uống nước giảm 75% Độ bền kéo, trọng lượng khô và ướt của mô hạt tăng lên đáng kể Đồng thời, dịch chiết còn có tác dụng ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương [20]

Theo nghiên cứu của Khan Mohammed Junaid, Ajazuddin , Vyas Amber, Singh Manju và Singh Deependra, dịch chiết của loài dâm bụt Hibiscus rosa sinensis có ảnh hưởng đến sự lo lắng và vận động ở chuột Cụ thể, dịch chiết của

loài dâm bụt này với rượu và chloroform có tác dụng làm giảm đáng kể hành vi chạy nhảy của chuột khi bị hoảng loạn Dịch chiết với ethanol cho kết quả tốt hơn so với dịch chiết từ chloroform Cả hai dịch chiết đã cho thấy không có sự gia tăng đáng kể trong tiểu tiện và đại tiện của chuột [15]

`Theo nghiên cứu của A A Osuntoki, T A Oyede và A A Otunba, dịch

chiết của lá dâm bụt Hibiscus rosa-sinensis với dung dịch muối được xem là chất

chống viêm khớp và chống viêm Kết quả cho thấy khi so sánh hiệu quả chống viêm với acetylsalicylic acid và indomethacin, dịch chiết từ lá làm cho màng tế bào hồng cầu của con người hoạt động ổn định hơn Điều này được giải thích đó

là do trong lá có chứa các chất có hoạt tính sinh học: alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, saponin, các glycosides, steroid, triterpenic và leucoanthocyanydines [10]

Theo nghiên cứu của Moqbel FS, Naik PR, Najma HM và Selvaraj S,

trong 5 phân đoạn chiết xuất lá Hibiscus rosa sinensis L với ethanol, phân đoạn

3 và 5 đã được chọn để điều trị bệnh tiểu đường ở chuột không mắc bệnh béo phì Với liều lượng 100 mg phân đoạn 3 và 200 mg phân đoạn 5 cho 1 kg trọng lượng cơ thể động vật, đã chứng minh lá dâm bụt có tác dụng hạ đường huyết ở chuột [19]

Theo nghiên cứu của Olagbende-Dada SO , Ezeobika EN và Duru FI, dịch

chiết từ lá dâm bụt Hibiscus rosasinensis Linn với góp phần tăng cường giá trị

dinh dưỡng, nâng cao đời sống sức khỏe Cụ thể, lá dâm bụt có tính chất đồng hóa, hỗ trợ cho sự tổng hợp protein và tăng cường khả năng tình dục ở nam giới Kết quả cho thấy, ở nhóm chuột được thí nghiệm có sự gia tăng về trọng lượng

về bộ phận sinh dục (tinh hoàn, mào tinh hoàn, túi hội thảo và tuyến tiền liệt) Về hiệu quả, dịch chiết của lá dâm bụt với rượu cho kết quả cao hơn dịch chiết với nước nóng hoặc nước lạnh Hiệu quả của lá dâm bụt xuất phát từ ảnh hưởng của

lá dâm bụt lên các hormon gonadotrophin điều hòa hoạt động của nội tiết tố androgen ( nội tiết tố liên quan đến sự sinh tinh) [21]

Bên cạnh đó lá của loài dâm bụt Hibiscus mutabilis có tác dụng điều trị

bệnh lao viêm hạch bạch huyết cổ tử cung [22] và hoa có tác dụng điều trị ung

thư biểu mô mũi họng [12] Dịch chiết từ loài Hibiscus esculentus giúp cải thiện

nếp nhăn bằng cách co cơ ức chế và loại bỏ các gốc oxy tự do [11] Dịch chiết từ dâm bụt giàu polyphenol có khả năng tiêu diệt tám loại dòng tế bào ung thư biểu

mô, hiệu quả nhất là ung thư biểu mô dạ dày của [16] Mặt khác, protocatechuic

( một hợp chất phenolic acid), phân lập từ hoa khô của Hibiscus sabdariffa là một

chất chống oxy hóa, ức chế hoạt động khối u và cũng có hiệu quả chống lại bệnh bạch cầu của con người [17]

Như vậy, hoạt tính dược lý của cây dâm bụt đã được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên các công trình về thành phần hóa học của cây dâm bụt hầu như vẫn còn rất ít

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâm bụt thường lấy từ huyện Hương Thủy, tỉnh Thừa Thiên – Huế vào tháng 8 năm 2011 Cây dâm bụt được chọn lấy lá cao khoảng 1,5 m, có nhiều lá và hoa Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, mép có răng to, mặt lá trơn bóng, mặt trên đậm hơn mặt dưới và không bị sâu Cuống lá hình trụ, màu xanh lục, có nhiều lông đa bào hình sao Hoa có màu đỏ đậm, có nhiều nhị

Hình 2.2 Bột lá dâm bụt khô

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có:

- Tủ sấy, lò nung, bếp điện, cân phân tích

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS ( phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng)

- Sắc ký lỏng - khối phổ liên hợp (LC/MS) được thực hiện trên máy Xevo

TQ hãng Waters, Mỹ ( tại phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội) Hệ dung môi: methanol - nước Tốc độ dòng: 0,25ml/phút Nguồn ion hoá của máy phổ khối: phun mù điện tử

- Sắc ký khí- khối phổ liên hợp (GC/MS) được thực hiện trên máy Agilent 7890A/5975C (tại trung tâm đo lường kỹ thuật chất lượng kỹ thuật , số 2, Ngô Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng) Cột sắc ký HP5MS (dài 30m; đường kính trong 0,25mm; lớp phim dày 0,25μm) Khí mang Heli (7 psi), thể tích tiêm 1μl, split 10:1, nhiệt độ buồng tiêm mẫu :280oC Chượng trình nhiệt độ lò: nhiệt độ đầu

80oC, giữ ở 0 phút, sau đó tăng lên 290o

C với tốc độ gia nhiệt 10o

C/phút, giữ ở nhiệt độ này trong 20 phút Điều kiện khối phổ : nguồn ion hoá (EI), năng lượng

ion hoá (70eV), nhiệt độ MS source (230oC), nhiệt độ MS Quad (150 oC), nhiệt

độ giao diện sắc ký khí với detector khối phổ (280oC), chế độ quét Fullscan ( Thời gian trễ 0-3 phút; thời gian quét: 3-50 phút, khoảng khối quét: 35-600amu)

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá tình thí nghiệm gồm có: bình tam giác 100 mL, 250 mL, cốc thủy tinh loại 100 mL, loại 250 mL, pipet, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10 mL, 10 mL, nhãn hóa chất

2.1.3.2 Hóa chất

Các dung môi: n–hexane, ethyl acetate, methanol, nước cất

Hóa chất vô cơ: dung dịch H2SO4 98%, HNO3, các dung dịch chuẩn của các muối: Pb2+

* Xử lí theo phương pháp khô:

Cách này thường dùng và đơn giản nhất, ta không dùng dung môi mà dùng nhiệt độ để phân hủy mẫu, đem nung mẫu ở 500-5500

C trong chén plantin hay thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi như các halogen, thủy ngân, lưu huỳnh…Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất hữu cơ trong bình kín, dưới áp suất cao hoặc khi phân hủy bằng cách nung chảy như đối với các chất vô cơ nhưng phải thêm chất oxi hóa: HNO3, H2O2

Ưu điểm: - Không tốn dung môi

- Tốn ít thời gian hơn so với phương pháp ướt

Hạn chế: - Ở nhiệt độ cao nhiều chất bay hơi, ví dụ ở 5000C lượng Pb, Cd bay hơi xấp xỉ 20% dẫn đến sai số kết quả lớn

* Xử lý theo phương pháp ướt

Cách này rất ít được dùng vì không thuận tiên, nó chỉ dùng khi không dùng phương pháp xủ lí khô được Ta đưa mẫu về dạng dung dịch bằng các dung môi như: H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 + HNO3, HClO4 …hoặc thêm H2O2, KMnO4 để làm tăng quá trình phân hủy

Ưu điểm: - Hạn chế được việc bay hơi của các chất trong mâu phân tích, kết quả phân tích gần với kết quả thực hơn

Hạn chế: - Rất tốn dung môi, dung môi phải tinh khiết

- Hàm lượng phân tích có khi lớn hơn lượng thực dẫn đến hiệu suất

thu hồi lớn hơn 100%

* Xử lí theo phương pháp khô ướt kết hợp

Nguyên tắc của phương pháp này là mẫu được phân hủy trong cốc sứ Mẫu được xử lí ướt sơ bộ bằng lượng nhỏ axit, nhằm mục đích phá vỡ sơ bộ cấu trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo điều kiện giữ một số nguyên tố có thể bay hơi khi nung Sau đó mới đem nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt

để hơn xử lý ướt và hạn chế bớt được sự mất của một số kim loại khi nung

Ưu điểm: - Giảm bớt được các hóa chất tinh khiết cao khi tro hóa ướt

- Dung dịch thu được là trong và sạch hơn tro hóa ướt

2.2.2 Xác định độ ẩm

Cân chính xác một khối lượng bột lá dâm bụt cho vào cốc sứ đã sấy đến khối lượng không đổi, cho cốc sứ đựng mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 1000

C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng đến khi khối lượng chén và mẫu không đổi để xác định

độ ẩm

2.2.3 Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

Để xác định hàm lượng tro trong mẫu thực vật người ta dùng phương pháp tro hóa mẫu [5]

Trong đề tài này tôi dùng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp khô ướt kết hợp Mẫu xử lí sơ bộ, có thể phân hủy các chất hữu cơ bằng H2SO4, HNO3… Sau đó được nung ở 500 – 550o

C trong chén thạch anh hay platin, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi

2.2.4 Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

 Nguyên tắc phép đo AAS

Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử ( phép đo AAS) Cơ sở lý thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử

tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố

ấy trong môi trường hấp thụ [7, 8].Vì thế muốn thực hiện được phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các quá trình sau:

- Quá trình nguyên tử hóa mẫu: chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) về trạng thái hơi của các nguyên tủ tự do Mục đích của quá trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích, làm môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử Có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc kỹ thuật nguyện tử hóa không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến phép đo AAS Bởi vì chỉ

có các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi mới cho phổ hấp thụ nguyên tử

- Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần phân tích, chiếu chùm tia sáng đơn sắc đó vào đám hơi của nguyên tố cần phân tích Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó Phần cường độ của chùm tia sáng đã bị một loại nguyên tử hấp thụ sẽ phụ thuộc vào nồng độ của nó trong môi trường hấp thụ

- Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi qua môi trường hấp thụ, phân li chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích vào khe đó để đo

cường độ của chúng Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ

- Ghi nhận tín hiệu và đo kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp

 Các bộ phận trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

* Nguồn đơn sắc

Nguồn đơn sắc là nguồn phát ra chùm bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần phân tích, nguồn này sẽ chiếu vào đám hơi nguyên tử tự do và nó phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Nguồn phát ra tia bức xạ đơn sắc tạo ra phải là các tia bức xạ nhạy của nguyên tố cần phân tích Chùm tia phát xạ phải có cường độ ổn định, lặp lại được nhiều lần đo khác nhau trong cùng một điều kiện và phải điều chỉnh được để có cường độ cần thiết cho mỗi phép đo

- Phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch nhạy của nguyên tố cần phân tích, phổ nền của nó không đáng kể

- Phải có cường độ cao nhưng bền với thời gian

* Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích

Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyển mẫu cần phân tích từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của nguyên tử tự do dưới tác dụng của nhiệt độ Đám hơi của các nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử

 Những ưu điểm và nhược điểm của phép đo AAS

* Ưu điểm

- Độ nhạy và độ chọn lọc cao Gần 60 nguyên tố hóa học có thể xác định

bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10-4

đến 10-5 Phương pháp nà áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực để xác định vết các kim loại

- Không cần làm giàu nguyên tố cần xác định trước khi phân tích Do đó tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian và không cần dùng nhiều hóa chất tinh khiết cao khi làm giàu mẫu Mặt khác cũng tránh được sự nhiễm bẩn mẫu khi xử

lí qua các giai đoạn phức tạp

- Các động tác thực hiện nhẹ nhàng, các kết quả phân tích lại có thể ghi lại trên băng giấy để lưu trữ lại sau này Đồng thời có thể xác định liên tiếp nhiều nguyên tố trong một mẫu Các kết quả phân tích lại rất ổn định, sai số nhỏ

- Cần phải có kĩ sư có trình độ cao để bảo dưỡng và chăm sóc các trang thiết bị máy móc khá là tinh vi và phức tạp

- Chỉ cho biết thành phần nguyên tố của chất ở trong mẫu phân tích, mà không chỉ ra trạng thái liên kết của nguyên tố ở trong mẫu

2.3 Phương pháp ngâm chiết

Phương pháp ngâm chiết là phương pháp hoá học dùng để tách một hoặc

nhiều cấu tử ra khỏi một hỗn hợp bằng cách ngâm hỗn hợp vào một dung môi thích hợp để hoà tan cấu tử định tách trước khi chiết [6] Phương pháp này được

áp dụng rộng rãi trong hoá dược để tách các hợp chất từ các vị thuốc có nguồn gốc từ động, thực vật

2.4 Khảo sát thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

2.4.1 Phương pháp sắc ký khí (GC)

Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ [7, 8]

Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi

để đưa vào cột sắc ký, thường hóa hơi dưới 2500C Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay một màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản)

Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ Pha động mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có

độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu

Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động

Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ, được gọi là sắc ký

đồ Mỗi peak trong sắc ký đồ mô tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung biểu diễn cường độ của tín hiệu

2.4.2 Phương pháp khối phổ (MS)

Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của

nó [7, 8] Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa (mass spectrometry) Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng,

do đó chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc nhỏ Những mảnh vụn thực tế là các ion, tiêu điểm của các mảnh vụn đi xuyên

qua các khe hở và đi vào đầu dò detector, được thành lập bởi phần mềm chương

trình và hướng các mảnh vụn đi vào các khe của khối phổ

Về việc phân tích kết quả máy tính sẽ ghi lại các biểu đồ của mỗi lần quét Trục hoành biểu diễn tỉ lệ m/z còn trục tung biểu diễn cường độ tín hiệu của mỗi mảnh vụn được quét bởi đầu dò detector Đây là đồ thị của số khối

Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này

có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở để đăng ký một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

2.4.3 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)

Hình 2.3 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) là một trong những phương pháp sắc

ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này, các nhà hoá học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cách giải quyết đối với một số hóa chất Ngày nay,

người ta ứng dụng kỹ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay) Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất mới này

Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của mỗi thành phần hóa chất

2.5 Khảo sát thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS)

+ Sắc ký lỏng áp suất cao (sắc ký lỏng cao áp )

- Trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thường, tuy thiết bị rẻ nhưng hiệu suất tách thấp, rất tốn dung môi để rửa giải, nên hiện nay dùng HPLC

- Kỹ thuật:

+ Giữ cho thành phần và tốc độ của pha động là không đổi: tách kém hiệu quả

+ Thay đổi cả thành phần, tốc độ của pha động: tách được hỗn hợp tương đối phức tạp [7, 8]

Phương pháp phổ khối lượng có độ nhạy tuyệt vời (10-6

-10-9g) và tốc độ ghi nhanh sẽ cho thông tin xác định cấu trúc từ những lượng tách ra được như phương pháp sắc ký lỏng

Việc liên kết hai kĩ thuật đó đã tạo ra một công cụ mạnh mẽ để tách biệt

và nhận biết các hợp phần của các hỗn hợp tự nhiên và tổng hợp Nhờ có sự liên kết chặc chẽ này người ta có thể thu được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với tất cả các hợp phần mà sắc ký lỏng tách được, kể cả những hợp phần với khối lượng chỉ cỡ picrogam và có mặt trong vài giây

Ở hệ thống LC-MS người ta phải áp dụng những kĩ thuật đặc biệt để loại những dung môi phân cực dùng cho sắc ký lỏng trước khi chuyển sang máy phổ khối lượng toàn bộ quá trình vận hành và ghi kết quả đều được tự động điều khiển bởi computer

Hình 2.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng ghép khối phổ

2.6 Thăm dò hoạt tính sinh học

2.6.1 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện theo phương pháp pha loãng nồng độ của Hadacek F và Greger H [14], tiến hành trên phiến vi lượng 96 giếng theo hai bước

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm dịch chiết và các chất có hoạt tính

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất và của dịch chiết có hoạt tính

Chất đối chứng bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn [Gram (+)] Tetraxilin đối với vi khuẩn [Gram (–)], Nystasin đối với nấm sợi

Các chủng vi sinh vật được chọn để thử gồm các vi khuẩn [Gram (–)],

Escherichia coli (E.C.) và Pseudomonas aeruginosa (P.A.)

E.C thuộc nhóm trực khuẩn Gram (–) thường sống ở đường ruột và gây một số bệnh ở người như tiêu chảy, viêm ruột thừa P.A là trực trùng mủ xanh thường gây mủ nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, tiêu chảy, khó điều trị

Các chủng vi sinh vật [Gram(+)] bao gồm: Bacillus subtilis (B.S.), Staphylococcus aureus (S.A.), Candida albicans (C.A.)

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud dextros broth và Trypcase soya broth (TSB) Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm)

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch DMSO 100% với 4 – 10 thang nồng độ được pha loãng từ dịch gốc rồi nhỏ trong phiến vi lượng 96 giếng Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt hóa được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị MeLand (khoảng 108 vsv/ml) Để trong

tủ ấm 37oc trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC trong 48 giờ đối với nấm Sau

đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC)

Mẫu thô có giá trị MIC  200 μg/ml, mẫu tinh có MIC  50 μg/ml là có hoạt tính

2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa

 Phương pháp kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., M.B., Elena, K

và cộng sự (2003) Dựa theo nguyên tắc chất 1,1–diphenyl–2–picrylhydratzyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethyl acetate bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50

 Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza

Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose citrate), pha loãng 10 – 20 lần bằng nước cất Chia thành các ống nhỏ 0,5 – 1 ml Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh – 80oC Khi dùng pha loãng thêm 25 – 50 lần bằng RB H2O2 (0,2N hay 2%)

Indigo: chuẩn bị dung dịch stock – 80oC: 0,1N, pha loãng 100 lần sẽ thu được dung dịch phản ứng 0,001N

Chất thử:

– Pha loãng bằng DMSO: dịch gốc 20 mg/ml, tiếp theo pha loãng 1:4 tạo thành 1 dãy 5 nồng độ

– Pha loãng bằng dung dịch đệm: tạo một dãy 5 nồng độ mới từ dãy nồng

độ trên bằng cách pha loãng 7,8 lần với dung dịch đệm

Phản ứng:

– 50 l dung dịch đệm axetat natri pH 4,7 0,1N

– 10l chất thử pha trong DMSO và RB

– 60 l enzyme pha loãng 500 lần

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Xácđịnh hàm lượng kim loại Thu lá dâm bụt, xử lí, xay

Ngâm kiệt trong dung môi n-hexane trong 2 ngày đêm

Cặn còn lại Dịch chiết methanol

Đo phổ GC-MS

Thử hoạt tính sinh học

Lấy 30g bột lá dâm bụt khô ngâm kiệt bằng dung môi n-hexane ở nhiệt độ phòng từ 03/01/2012 đến 05/01/2012 Sau đó, đem đi lọc để thu được dịch chiết với n-hexane, tiếp tục ngâm kiệt bã rắn với dung môi n- hexane thêm 2 lần và lọc

để thu dịch chiết

Bã rắn tiếp tục ngâm kiệt với dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ phòng từ ngày 10/01/2012 đến ngày 12/01/2012 Sau đó, đem đi lọc để thu được dịch chiết với ethyl acetate Tiếp tục ngâm kiệt bã rắn với dung môi ethyl acetate thêm 2 lần và lọc để thu dịch chiết ethyl acetate Tương tự, bã rắn tiếp tục được ngâm kiệt 3 lần với dung môi methanol và lọc, thu dịch chiết với methanol

Dịch chiết n - hexane thu được đem cô đuổi dung môi thu được cao chiết Cao chiết n- hexane được đem đi xác định thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khí ghép phổ (GC- MS) tại trung tâm đo lường kỹ thuật chất lượng

kỹ thuật , số 2, Ngô Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng

Dịch chiết ethyl acetate và methanol thu được các cao chiết tương ứng Các cao chiết này được đem đi xác định thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp ghép khối phổ (LC-MS) tại phòng nghiên cứu cấu trúc – Viện hóa học – Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội

Các dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và methanol của lá dâm bụt được thử họat tính sinh học tại phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lí của lá dâm bụt

3.2.1 Độ ẩm

 Tiến hành:

- Chuẩn bị các cốc được rửa sạch, được đánh số thứ tự, và được sấy khô trong

tủ sấy đến khối lương không đổi m0 Sấy xong bỏ vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng các cốc sứ

- Mẫu để xác định độ ẩm là mẫu lá dâm bụt đã nghiền thành bột, cân lấy khối lượng chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào cốc sứ chuẩn bị sẵn và đem đi sấy

ở nhiệt độ 1000C Cứ sau 2 giờ lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt

độ phòng rồi cân đến khối lượng mẫu và cốc không đổi m2

m

m m

m  

Trong đó: m0: khối lượng cốc sứ (g)

m1: khối lượng mẫu (g)

m2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

W (%): độ ẩm của mỗi mẫu

Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 4 mẫu

Kết quả khảo sát độ ẩm của lá dâm bụt như được trình bày qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của lá dâm bụt

- Lấy 5 mẫu lá dâm bụt sau khi được xác định độ ẩm, đem than hóa sơ bộ trên bếp điện rồi cho vào lò nung ở 500-5500C trong thời gian từ 4 đến 6 tiếng, cho đến khi thu được tro trắng

- Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi

Khối lượng các chất hữu cơ tổng được tính là tổng chất hữu cơ bị đốt cháy, là hiệu số giữa khối lượng mẫu ban đầu và khối lượng tro sau khi nung

m1: khối lượng lá dâm bụt (g)

m3: khối lượng của cốc sứ và lá dâm bụt sau khi tro hóa (g)

% tro : hàm lượng tro (g)

Hàm lượng tro được lấy trung bình từ các mẫu trên Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lƣợng tro trong lá dâm bụt

Từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trung bình là 4,171%, hàm lượng hữu

cơ là 8,136%

3.2.3 Xác định hàm lượng kim loại

Mẫu lá dâm bụt sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch H2SO4 đặc

và được định mức bằng nước cất đến 10ml Lấy dung dịch đã định mức trên được đem đi xác định hàm lượng các kim loại bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, tại phòng thí nghiệm trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng, số 459, đường Tôn Đức Thắng, Quận Liên Chiểu, Thành Phố Đà Nẵng Kết quả xác định hàm lượng kim loại của lá dâm bụt được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại trong lá dâm bụt

Kim loại

Hàm lượng trong lá dâm bụt

( mg/ kg)

Hàm lượng cho phép ( mg/ kg)

Nhận xét: Căn cứ vào Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007

về việc ban hành “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm” thì hàm lượng kim loại trong lá cây dâm bụt không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

3.3 Hiệu suất chiết

Cân 30g bột lá dâm bụt cho vào cốc 100ml Sau đó lần lượt chiết kiệt với các dung môi n- hexane , ethyl acetat và methanol

Dịch chiết trong n-hexane có màu xanh đậm Tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không cho đến khi khối lượng không đổi Khối lượng cặn khô thu được là 0,37g

Dịch chiết trong ethyl acetate có màu xanh đen Tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không cho đến khi khối lượng không đổi Khối lượng cặn khô thu được là 0,24g

Dịch chiết trong methanol có màu xanh nâu Tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không cho đến khi khối lượng không đổi Khối lượng cặn khô thu được là 1,785g

Kết quả cảm quan về các dịch chiết được trình bày qua hình 3.2

(a) dịch chiết n-hexane (b) dịch chiết ethyl acetate (c) Dịch chiết methanol

Hình 3.1 Các hình ảnh về kết quả chiết lá dâm bụt lần lƣợt v i từng

Trong đó:

mC: Khối lượng cặn khô tính theo gam

mM : Khối lượng mẫu khô tính theo gam

Bảng 3.4 Hiệu suất chiết

Dung môi Khối lượng cặn khô (g) Hiệu suất chiết (%)

Từ bảng 3.4 cho thấy dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất Từ

đó có thể dự đoán thành phần hóa học chính trong lá cây dâm bụt chứa một lượng lớn các chất tương đối phân cực và phân cực

3.4 Thành phần hóa học dịch chiết lá dâm bụt trong dung môi hexane

n-Dịch chiết lá dâm bụt trong n-hexane có màu xanh Ký hiệu: HDB1 Mẫu dịch HDB1 được đo phổ GC/MS tại trung tâm đo lường kỹ thuật chất lượng kỹ thuật , số 2, Ngô Quyền, Quận 3, TP Đà Nẵng Sắc ký đồ của dịch chiết được trình bày trên hình 3.2

Hình 3.2 Sắc ký đồ GC của dịch chiết lá dâm bụt trong dung môi n-hexane

Kết quả phân tích sắc ký đồ GC-MS và so sánh với thư viện chuẩn cho

thấy có 23 cấu tử, trong đó, có 11 cấu tử đã được định danh chiếm 43, 08%, chủ

yếu là chất có một nhóm OH, các ester và acid béo, các chất còn lại chiếm tỷ lệ

rất nhỏ với thời gian lưu tương ứng là 31,560; 30,75; 29,461; 24,793; 13,692;

5 18,355 6,13 Hexanedioic acid, bis ( 2-

ethylhexyl) ester (C22H42O4)

6 21,630 1,12

2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19,23 – hexamethyl -,(all-

hexadecanoic acid (4,02%); campesterol (3,95 %); phytol (2,63%); vitamin E (2,48 %); và các cấu tử còn lại chiếm tỉ lệ dưới 2%

Trong số các chất trên: chất stigmasterol, gama.–sitosterol, campesterol là các sterol là lớp chất phổ biến trong thực vât, có nhiều hoạt tính Stigmasterol là chất chống oxi hóa mạnh, có tác dụng hạ đường huyết, chống viêm khớp, làm giảm cholesterol và đặc biệt là có tác dụng phòng chống ung thư ruột kết, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư buồng trứng Bên cạnh đó, campesterol là chất có tác dụng chống viêm, làm ức chế quá trình gây viêm xương khớp, làm giảm hấp thụ cholesterol trong ruột, đặc biệt có tác dụng giảm xơ vữa động

mạch, phòng chống các bệnh về tim mạch [18]

Vitamin E còn gọi là tocopherol là một chất chống oxy hóa tốt, ngăn ngừa các dấu hiệu lão hóa, chống các loại ung thư, vitamin E còn làm giảm nồng độ cholesterol xấu trong máu, tăng cường tuần hoàn máu nên giảm các nguy cơ mắc các chứng bệnh về tim mạch, kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bảo vệ các

tế bào [9]

Phytol là sản phẩm của quá trình trao đổi chất diệp lục ở thực vật Nó được được sử dụng để tổng hợp các vitamin thiết yếu trong cơ thể con người, như vitamin E và vitamin K Nó là chất cần thiết trong việc kích hoạt các enzym có tác dụng tích cực đến việc sản xuất insulin Nó cũng có hiệu quả trong việc giảm mức cholesterol trong máu và giảm huyết áp Phytol cũng có lợi trong việc điều hòa lượng đường trong máu và có thể có thể khôi phục lại các chức năng trao đổi chất của người mắc bệnh tiểu đường type 2 [26]

Trong lá dâm bụt còn có axit béo thiết yếu có nhiệm vụ tổng hợp các hormone có nhiệm vụ điều chỉnh huyết áp, sự đông máu , nồng độ lipid trong máu, khả năng miễn dịch của cơ thể và phản ứng viêm nhiễm chấn thương Palmitic acid (n-hexadecanoic acid) là một trong những acid béo bão hòa phổ biến nhất được tìm thấy ở động vật và thực vật Đây là chất chống oxy hóa nhẹ

và có đặc tính chống xơ vữa động mạch Linolenic acid (9,12,15-octadecatrienoic acid) là acid béo có tác dụng giảm nguy cơ của bệnh tim mạch, mức độ căng