đề tài tìm hiểu và thực tập qui trình định đanh vi khuẩn staphylococcus aureus, heamophilus influnenae và klebsiall peneumoniae trên bệnh phẩm đàm tại bệnh viện nhân dân gia định

Bên cạnh sự nỗ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được

INDUSTRIAL ˆ

OF HOCHIMINH CIT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

DE TAI:

TIM HIEU VA THUC TAP QUI TRINH DINH DANH VI KHUAN STAPHYLOCOCCUS

AUREUS, HEAMOPHILUS INFLUNENAE VA KLEBSIALL PENEUMONIA4E TREN

BỆNH PHẨM ĐÀM TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH

Niên khóa: 2010 — 2013

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013

LOI CAM ON

Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp và bài báo cáo thực tập này Bên cạnh sự nỗ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được sự quan tâm cũng như hướng dẫn tận tâm của Quý Thây Cô, Cán Bộ và các Anh ( Chị ) tại bệnh viện, cùng với những lời động viên và khích lệ từ phí gia đình và bạn bè trong lúc em gặp khó khăn

Chúng em xin được gởi lời cảm ơn đến Quý Thây Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công

Nghiệp Thành Phó Hô Chí Minh, Quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm đã tận

tình dạy dỗ, trang bị cho chúng em những kiến thức, những kinh nghiệm quí báo, để chúng em có được kiến thức thực hành trong thực tiển và vận dụng trong cuộc sống

Chúng em xin cảm ơn chân thành đến Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết và KS Nguyễn Thùy Trang

đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em thực tập và tận tình giúp đỡ, hướng dẩn trong suốt quá trình thực tập khoa vi sinh của bệnh viện

Chúng em xin gởi lời cảm ơn Th.Š Lưu Huyền Trang, Cô đã tận tình hướng dẫn, cung cấp kiến thức và giúp đỡ nhóm chúng em để hoàn thành bài báo cáo thực tập này

Chúng em cũng xin cảm ơn các Anh (chị) tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Dinh đã chỉ dạy, quan tâm và giúp đỡ chúng em trong quá trình thực tập tại Bệnh Viện

Đồng thời chúng em xin cảm ơn đến gia đình và tập thể lớp CDSHI2 trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phó Hô Chí Minh đã động viên, giúp đỡ trong những năm học vừa qua và trong quá trình thực tập

Nhóm chúng em xin chân thành cảm!

T.p Hồ Chí Minh tháng 5 năm 2013

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định

GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang

Nhận xét:

T.p Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2013

Giảng viên hướng dẫn:

Trang 4

Lịch sử hình thành và phát triỂn -22++£+22EEEEEE+++++ttttEEEEEEYvrrrrrrrrrrrrrres 9

Cơ cấu tổ chức -222222++++22222222111121122222211111111.2222121111111 22121111112 crrrrrrrrrk 11 KHOA VI SINH wiseesssssssssssssssssssssccscsssssssssssescsssssssuunssesecssssssnsusscsesceesssssuuusssseceessssssunseseeesessss 13

Chức năng và nhiỆm VỤ - - ¿5% xxx 101111111 1 xxx ng ng 13

Thành tích đạt được 2++£°22VEVVVvv2+++tt2EEEEE2211211122222211111222 221221111112 crrrrrrrrrer 14 Hướng phát triển trong tương lai - + ©2+£++EEV+++£+EEEE+E+ttEEEEAeertrrvAzeerrrrrrcee 15

CƠ SỞ LÝ THUYÉT VÈ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUÂN GÂY

15

Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm 2 £+EV22££+EEE+E+£EEEEEeertEEvEEeerrrrrrree 15 Phương pháp nhuộm TraIm ¿+ + + xxx k*k#k#E£EEESEeEeEeEeEEsrkrkrkrkrkrkrkekrkrkrrrrrrsre 15 Phương pháp định danh sinh hóa - 2-5 x*#E#EeEeEeEeExEkrkrkrkrkrkrkrkekrkerrrrrrrsre 16 Phương pháp làm kháng sinh đỗ với kỹ thuật KIRB.Y .-2 -c¿2c5se2 25

Trang 5

Thời điểm lấy mẫu

Cách lấy mẫu đàm . 2-V2+£+EE++++£EEEE.EEEEEE2151227211111222211112227111112271122.22211Xee 51

ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHÂM ĐÀM -22- +2 +E++++EEEEESEEEEEEEEEEtEEELerrrkrerrrr 52 Khảo sát đại thể mẫu đàm 22-2 ++£+SE+EESEEEEEEEEE1E1271112271111711112711117112 271 re 52

Khảo sát vi thỂ -2222222222+E2222221111111.2222211111111T 211111111111T 211111111 ccrrrrrrrrrii 53

TIỀN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUÂN .-2-2©+++E++e£+E2+e2+tzxeerr+ 53

Quy trình định danh H irjfÏUU€HZ€ 5 k$kEE‡E$EeEeEeEeEeEererrkrkrkrkrkekrkerrrrrrrsre 53 giải thích quy trÌnh - - << + xvvvvvTnTTTHgTT Tn HH nrre 54 Phương pháp định danh Klebsiella pneurmoniae - - + + + x+x+zxexexexexexexexsrs 56

MỤC LỤC BẢNG+HÌNH

Trang 6

MUC LUC CAC CHU VIET TAT(NEU CO)

1 GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VAN DE

Nhiễm khuẩn đường hô hấp không chỉ là gánh nặng bệnh tật mà còn là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm trùng ở các nước có thu nhập thấp Yếu tó rất quyết định để góp phần chống đở được gánh nặng này là vấn đề tìm ra tác nhân đích gây bệnh và tìm ra loại kháng sinh phù hợp trong điều trị kinh nghiệm khi đứng trước một bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hap Chính vì vậy sự hiểu biết về các tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp cũng như các thách thức phải quan tâm hiện nay trong đề kháng các kháng sinh của các vi khuẩn này là những vấn đề gì

Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang, viêm tai giữa , viêm amydale là các

bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, và viêm phổi, viêm phế quản — phổi là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây các bệnh lý

nhiễm khuẩn hô hấp cấp là Š£repfococcus pneumoniae, Haemophilus infÏluenzae và Moraxella cafarrhalis Riêng đối với bệnh lý viêm amydale thì mặc dù tác nhân siêu vi được xem là

nguyên nhân của gần 50% các trường hợp, nhưng S/repfococeus pyogenes là tác nhân vi khuẩn hàng đầu phải được các nhà lâm sàng nghĩ đến Ngoài các tác nhân vi khuẩn trên thì các tác nhân

vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila cũng là những tác nhân vi khân cần phải được quan tâm

Đó là van đề chung trong tình hình bệnh hô hấp hiện nay Vì vậy quy trình tìm khuẩn gây bệnh

đường hô hấp là rất quan trọng trước hết là lấy bệnh phẩm rồi đánh giá có tồn tại sự có mặt của

khuẩn hay không Theo xét nghiệm thường quy thì bệnh phẩm có liên quan đến bệnh đường hô hấp nhiều nhất được lấy từ mẫu đàm Vì trong bệnh phẩm đàm có chứa rất nhiều vi khuẩn liên quan đến bệnh lý theo khảo sát tại nhiều bệnh viện trong nước

Trang 7

Đàm tươi thường chứa nhiều lao khuẩn ẩn trú dịch phế quản và vùng họng vì vậy đánh giá mẫu

dam là đánh giá khá chính xác nguyên căn bệnh về đường hô hấp.các vi khuẩn thường chứa

trong mau dam gém Staphylococci,Streptococci,Haemophilus influenza ,Klebsiella pneumoniae,

M catarrhalis va bacillus Koch Sy_ c6 mat cia cdc vi khuẩn này theo khảo sát có ảnh hưởng

quan trong đến bệnh lý đường hô hắp

Vi khuẩn là tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp phổ biến nhất Vi khuẩn hiếu khí chiếm ít nhất 73% và nâm chiếm 4% các vi sinh vật phân lập được từ đàm và dịch hút phế quản ở bệnh nhân

Vi khuẩn thường là nhiễm khuẩn đa tác nhân và trực khuẩn Gram âm là các thường gặp Tuy nhiên, MRSA và các cầu khuẩn Gram đương khác kế cả phế cầu (Streptococcus pneumoniae) ngày càng xuất hiện phổ biến Tại các bệnh viện thì các chủng Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens va Proteus sp

chiếm 50% các tác nhân phân lập được từ bệnh pham dudng h6 hap.Trong d6 Escherichia coli

(29,7%), Klebsiella spp (26%), Pseudomonas aeruginosa (13,7%), Staphylococcus aureus (6%), Acinetobacter spp (5%), Haemophilus influenza,(thang 8/2008, khoa vi sinh bénh vién nhan dân Gia Dinh)

Trong tất cả các tác nhân gây bệnh kể trên thi ba tác nhân: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,Klebsiella pneumoniaelà những vi khuẩn thường có mặt trong mẫu bệnh đàm đáng được quan tâm Chính vì lẽ đó, nhóm chúng tôi đã thực hiện quá trình tìm hiéu , quy trình

định danh và phương pháp thực hiện kháng sinh đồ đối với ba loại vi khuẩn này

1.2 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Là những mẫu bệnh phâm đàm của các bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh tại bệnh

viên nhân dân Gia định có chỉ định cấy vi khuẩn, định danh và làm kháng sinh đồ

1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ

s* Mục đích

Tìm hiểu, theo dõi và thực hành thao tác phân lập và định danh,kháng sinh đồ với các chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phan lap tt’ mau bénh

pham dam

s* Nhiệm vụ

Hiểu được nguyên lý, nắm vững các thao tác về lầy mẫu bệnh phẫm, các thao tác trong quy trình định danh, làm kháng sinh đồ v6i ching Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,

Klebsiella pneumoniae trong mau bénh pham dam

1.4PHAM VIDE TAI

Dé tài được thực hiện trên tất cả các bệnh phẩm đàm thu nhận được tại khoa vi sinh bệnh viện

nhân dân Gia định Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo là những thao tác, quy trình đang được áp dụng tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định

2.1 GIỚI THIỆU VẺ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH

Vị trí địa lý: Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Trang 9

Bệnh viện Nhân Dân Gia Định sơ khai do người Pháp xây dựng với bảng hiệu là Hospital de

Gia Định, trong những thập niên đầu của thế kỷ XX

-Năm 1945, Hôpital de Gia Định được đổi tên thành bệnh viện Nguyễn ‘Van Hoc

- Đến năm 1968 bệnh viện được phá đi va xây dựng mới với mô hình 4 tầng để tiếp nhận điều trị khoảng 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và đổi tên thành Trung tâm thực tập y khoa Gia Định

- Từ sau năm 1975, bệnh viện Nguyễn Van Học được đổi tên thành bệnh viện Nhân Dân Gia

Định

- Đến năm 1996, bệnh viện được phân hạng là bệnh viện loại I (quyết định số 4630/QĐÐ-UB-NC)

với nhiệm vụ khám chữa bệnh và là cơ sở thực hành của trường Đại học Y — Dược TP Hồ Chí

Minh

- Từ bệnh viện ban đầu được xây dựng với quy mô cho 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và khoảng

1.000 lượt người đến khám chữa bệnh ngoại trú, hiện nay số lượng người đến khám chữa bệnh

ngoại trú trung bình khoảng 3.000 lượt/ngày và bệnh nhân điều trị nội trú trên 1.000 bệnh

Trang

10

nhân/ngày Trước tình hình qúa tải tram trọng cả khu vực nội trú và ngoại trú, bệnh viện đã được

xây dựng mới khu khám bệnh — cấp cứu 4 tầng với tổng diện tích 10.100 m2, đã đưa vào sử dụng

vào tháng 7/2007

- Hiện tại, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là bệnh viện đa khoa loại 1 trực thuộc Sở Y tế TP Hồ Chí Minh với quy mô 1.200 giường, khám chữa bệnh cho nhân dân sinh sống trên địa bàn TP

Hồ Chí Minh (các quận trong tuyến: Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, một phần Quan I va cdc

quận ngoài tuyến: Thủ Đức, Quận 2, 12, 9 ), ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bệnh nhân đến

từ các tỉnh thành lân cận như Đồng Nai, Bình Dương, Vũng Tàu và một số tỉnh miền Trung Bệnh viện có đủ các chuyên khoa lớn, với nhiều phân khoa sâu, bệnh viện được trang bị khá đầy

đủ trang thiết bị y tế nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán, điều trị và chăm sóc bệnh nhân, đáp

ứng được nhu cầu khám chữa bệnh ngày càng cao của nhân dân

- Bệnh viện còn là cơ sở thực hành của 2 trường Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh và Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Trung bình mỗi năm bệnh viện tiếp nhận khoảng 1500 học viên đến thực tập thuộc hệ trung học, hệ đại học và sau đại học

Khoa nội hô hấp — cơ xương khớp

Khoa nội tiết — thận — niệu

Khoa nội thần kinh — huyết học — y

Khoa ngoại thần kinh

Khoa ngoại tiêu hóa

Khoa ngoại thận — tiết niệu

Khoa ngoại lồng ngực - mạch máu Khối sản:

Khoa sản bệnh Khoa sản phụ

Khoa sản trường

Khoa sanh

Khoa bệnh lý sơ sinh

Khoa nhi Chuyên khoa:

Khoa tai mũi họng Khoa răng hàm mặt Khoa mắt

Các khoa khác:

Khoa cấp cứu

Khoa khám bệnh Khoa cận lâm sàng:

Khoa dược

Khoa dinh dưỡng Khoa sinh hóa huyết học Khoa vi sinh

Khoa chuẩn đoán hình ảnh

Khoa nội soi - thăm dò chức năng

Khoa giải phẩu bệnh lý

Khoa chống nhiễm khuẩn

Trong nhiều năm qua bệnh viện đã có nhiều thành tích đáng ghi nhận trong việc cứu chữa bệnh

và nghiên cứu khoa học chẳng hạn như có thể mổ ghép thận, phau thuat vi mach diéu tri co giat nita mat, va nhiều nghiên cứu khoa học khác

Với nhiều trang thiết bị ngày càng tiên tiến cùng với đội ngũ y bác sĩ giàu kinh nghiệm,bệnh viện

sẽ có nhiều hướng phát triển hơn nữa trong tương lai

2.2 KHOA VISINH

2.2.1 Giới thiệu khoa

Năm 1978, từ khoa xét nghiệm bao gồm sinh hoá - huyết học — vi trùng, bộ phận vi trùng học tách ra để lập khoa riêng với tên gọi KHOA VI TRÙNG hoạt động độc lập với khoa Sinh hoá - Huyết học

Năm 1998, khoa được đổi tên thành KHOA VI SINH cho đến nay

Khoa gồm có 17 công nhân viên chức

Phó trưởng khoa: Ths.Bs Nguyễn Sử Minh Tuyết

Cán bộ trên đại học: 01 (thạc sỹ vi sinh y học)

Khoa Vi sinh là nơi thực hiện các kỹ thuật về vi khuẩn học, ký sinh trùng học, miễn dịch học

nhằm đáp ứng yêu cầu khám chữa bệnh của bệnh nhân

s Thực hiện các xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho bệnh nhân nội trú và ngoại trú tại bệnh viện Bên cạnh đó, chúng tôi còn thực hiện nuôi cấy vi khuẩn cho các đơn vị bạn: bệnh viện Ủng

Bướu, Bình Thạnh, Quận 1, bệnh viện quốc tế Vũ Anh

» Thực hiện các xét nghiệm miễn dịch học bao gồm: HIV, viêm gan siêu vi A, B, C, sốt xuất huyết Dengue, Helicobacter pylori; xét nghiệm sàng lọc một số bệnh bâm sinh (Toxoplasmosis, Rubella, Cytomegalovirus) Các phản ứng huyết thanh học như: Widal, ASO, RF; thử phản ứng

lao t6 (IDR), test thtr thai

+ Thực hiện nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm; thẩm định kết quả xét nghiệm trước khi trả cho

các khoa lâm sàng

» Thực hiện công tác kiểm tra vô khuẩn chung trong toàn bệnh viện và một số bệnh viện tuyến dưới (bệnh viện Bình Thạnh, bệnh viện Quan 1)

* Theo dõi sự đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được

s Nghiên cứu khoa học các đề tài thuộc lãnh vực vi sinh y học

+ Phối hợp với các khoa lâm sàng giải quyết các vấn đề liên quan về chuyên môn, hội chân các

trường hợp nhiễm trùng đa kháng thuốc

2.2.3 Thành tích đạt được

Nuôi cấy các loại bệnh phẩm như máu, mủ, đàm, nước tiểu, phân, các loại dịch (mật, não tuỷ,

màng phổi .); phân lập và định danh các loại vi khuẩn thông thường; tiến hành làm kháng sinh đồ; theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn mỗi 6 thang — 1 nam

+ Kiểm tra vô khuẩn định kỳ các khoa trong bệnh viện, lưu ý các khoa trọng điểm như Hồi sức

tích cực - chống độc, Hồi sức ngoại, Phòng mồ, Bệnh lý sơ sinh Thực hiện cấy không khí, nước, tay phẫu thuật viên, y dung cu

« Các xét nghiệm miễn dịch học: HIV (Determine, Vironostika, Murex), viêm gan siêu vi

(HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, antiHBc-IgM/IgG, antiHCV, antiHAV-IgM/IgG),

Toxoplasma gondii (IgM, IgG), Rubella (IgM, IgG), Cytomegalovirus (IgM, IgG)

+ Tham gia công tác ngoại kiểm tra chất lượng của Trung tâm Kiểm chuẩn TP.HCM với đánh giá

“Kết quả hoàn toàn phù hợp”

« Hướng dẫn sinh viên các trường Đại học đến thực tập và làm Luận văn tốt nghiệp

s Tham dự và báo cáo trong các hội nghị Khoa học kỹ thuật, lao động sáng tạo — sáng kiến cải tiến trong và ngoài bệnh viện

2.2.4 Hướng phát triển trong tương lai

Triển khai nuôi cấy vi khuẩn ky khí, huyết thanh chân đoán bệnh do ký sinh trùng, các xét

nghiệm sinh học phân tử đáp ứng nhu cầu cung cấp các dịch vụ xét nghiệm chân đoán toàn diện

243 CO SG LY THUYET VE CAC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUÂN GÂY

BỆNH

2.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm

2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram

Mục đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước định danh tiếp theo

Nguyên tắc: khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu tím gentian và một chất gắn màu Iodine như Lugol nếu ta tẩy màu bằng aceton, vi khuẩn Gram dương có lớp peptidolycan dày ăn màu tím của gentian, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tay mất màu tím Khi nhuộm lại với safranin 0,5%, nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu đỏ

Tiến hành

- Phết nhuộm được có định trên lame

Trang

15

- Phủ tím Genatin lên phết nhuộm trong 1 phút Rửa nước và nghiêng kính đếcho ráo

- Phu Lugol lên phết nhuộm trong 2 phút.Rửa nước và nghiêng kính cho ráo

- Rửa acetol lên phết nhuộm, tẩy giọt cuối cùng còn phết tím Rửa bằng nước và nghiêng kính cho ráo

- phủ lại với dung dịch Safranin trong 30 giây Rửa nước và thấm khô vết nhuộm

- Quan sát ở vật kính dầu

Đọc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ mầu tím của tím gentian, vi khuẩn

Gram âm giữ màu hồng đỏ của Safranin

2.3.3 Phương pháp định danh sinh hóa

Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên các loại môi trường khác nhau như MC,

BA, Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh

Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh

* Thử nghiệm khả năng lên men

Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2, Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

s Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ

tự do trong điều kiện kị khí Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-

napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng

* Thử nghiệm ONPG

Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả2 loại men lactose permease va B-galactosidase Mot số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được B-galactosidase Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi B-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng

+ Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối

ammonium làm nguồn đạm duy nhất.Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

* Thử nghiệm Urease

Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa Chất chỉ thi Phenol Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường

chuyển sang màu đỏ

* Phenylalanine deaminase (PAD)

Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% dé cho ra màu xanh lá cây

* Thử nghiệm bile esculine

Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen

* Thử nghiệm khả năng sinh indol

Trang

17

Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ

s Thử nghiệm VP (Voges — Proskauer)

Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao

đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành

diacetyl, đưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ

+ Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường Các vi sinh vật biến đưỡng malonate sẽ sửdụng chu trình glyoxylic acid

để biến dưỡng năng lượng Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một

chất diệt khuẩn Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng

ammonium là nguồn đạm duy nhất Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự

phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH

* Thử nghiệm KIA

Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S

và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1% Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:

+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid Điều này có thẻ giải thích do visinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít oi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Ở phần sâu trong môi

trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men ky khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH

của môi trường.Nếu trong môi trường có chat chi thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phân sâu sẽ có màu vàng

+ Nếu vi sinh vật có thê sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton đẻ tạo năng lượng

+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng đề biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật Tuy nhiên, do pepton

chỉ được biến đưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của

bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu

trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu

Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ

các khí này đây ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch Thử nghiệm này cũng có thé phát hiện khả

năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate Vi sinh vật khử sulfate

có thể khử hợp chất này đề giải phóng H2S Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng

tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi

trường

sThử nghiệm tính di động

Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium

chloride dé phat hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất

này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ

* Thử nghiệm decarboxylase

Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axit amin đặc hiệu đề xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện ky khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự

đổi màu của chỉ thị pH

Trang

19

Thử nghiệm MR

Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong qusa trình taaoj và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose Vỉ sinh vật lên men glucose tap và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến thành các sản phẩm trung tinh,

không làm đổi màu thuốc thử

-chất chỉ thị màu Ph môi trường là methyl red đỏ

-môi trường thử nghiệm: môi trương VP-MR

-Sau thử nghiệm: môi trường chuyền sang đỏ :+

Môi trường không đổi màu: -

Thử nghiệm catalase

Dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí va vi khuẩn ky khí Vi sinh vật hiếu khí có enzyme

catalase, có khả năng phân giải H2Oa thành HO và Oz

Hóa chất : H20230% dugc giữ lạnh

Nhỏ một giọt sinh khối lên H2O2: Néu sui bọt : +

Nếu không sủi bọt :-

(BO SUNG THU NGHIEM VA HINH ANH)

Cách tiến hành

Bộ hóa chất bao gồm:

¢ Dia giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase

~ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame

- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame

- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase

- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng đương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm

tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen

+ Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng

- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành

huyền dịch có độ đục McFarland 2,0

- Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống

chưa các thử nghiệm tượng ứng

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ

-Đọc kết quả theo bảng 2.1

Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm

-cách dùng: dùng Micropipetcho vào mỗi giếng 200 u1 huyền dịch, đậy nắp

Ket qua thử nghiệm

[ Sô điệm nẻn nhu ket qua dvong tinh

Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa

ve MLO | LOC MOB

Thuốc Kết quả thử nghiệm

Giéng | Ký Thử nghiệm | thử thêm

7 ESC Thủy giải Đen( có màu từ đen nhạt Không

Esculine qua đen đậm) đen

Trang

22

hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hinh 2.1

3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHÀN NÀY CHƯA NĂM RÕ CÀN TÌM HIỂU KỸ)

Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC

(SPUTAPREP-QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đàm Tiến hành như sau:

~ Trong một tube 15 ml vô trùng (loại Falcon) đã chứa 10 ml nước muối sinh lý vô tring (NS), cho thêm vào 50 mg NALUC (NÑ-Acetyl-L-Cystein), tức là toàn bộ bột NACL chứa trong một tube Eppendorf Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và

đủ cho 2 — 3 mẫu Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 4 °C

- Lay một thể tích đàm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha Lắc nhẹ cho đến khi đàm tan trong dung dịch này Như vậy chúng ta đã có đàm pha loãng 1/2 Sau khi đàm tan hoàn toàn, pha loãng tiếp mẫu đàm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng Như vậy chúng ta đã có mẫu đàm pha loãng 1/20

- Tiến hành cấy định lượng mẫu đàm đã pha loãng 1/2 trên các hộp thạch máu cừu ( BA ), thạch nâu máu ngựa có Bacitracin (CAHI) và thạch MC bằng khuyên cấy định lượng 10 pl (0,01 ml)

Trang

23