Nghiên cứu đa dạng di truyền và cải tiến nguồn gen khoai môn sọ bản địa bằng công nghệ sinh học và đột biến thực nghiệm

Qui trình thiết lập bộ sưu tập hạt nhân khoai môn sọ các nước Thái Bình Dương 38 3.1 Sự phân bố của 40 mẫu giống khoai môn sọ theo một số đặc điểm hình thái – nông học quan trọng 59 3.3

ĐẶNG THỊ THANH MAI

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CẢI TIẾN

NGUỒN GEN KHOAI MÔN SỌ BẢN ĐỊA BẰNG CÔNG NGHỆ

SINH HỌC VÀ ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2014

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Nguyễn Xuân Viết

Hà Nội, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Nguyễn Xuân Viết Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày … tháng 7 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi đãnhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của PGS TS Nguyễn Xuân Viết Vớitất cả tấm lòng mình, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thày về sựgiúp đỡ quý báu đó

Xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ,cảm ơn cô đã tư vấn và có những góp ý khoa học để bản luận án này có thể đượchoàn thành một cách tốt nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn các giảng viên và cán bộ Bộ môn Di truyền học,Công nghệ Sinh học và vi sinh, Sinh lí học thưc vật và Ban chủ nhiệm khoa Sinhhọc, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội; các cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền - Viện

Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa Học Nông nghiệp Việt Nam; Các cán bộ PhòngSinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệViệt Nam đã ủng hộ, tạo mọi điền kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án

Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu, các bạn đồng nghiệpTrường Cao đẳng Sư phạm Bắc Ninh đã giúp đỡ, tạo những điều kiện thuận lợi nhấttrong suốt những ngày tháng tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Cuối cùng nhưng rất nhiều, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình những người thân yêu đã luôn động viên, tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôiyên tâm học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian qua

-Hà Nội, ngày … tháng 7 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Đặng Thị Thanh Mai

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 CĂN CỨ PHÁP LÝ VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 3

3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 3

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 4

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 5

6 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 6

7 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI 6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI MÔN SỌ 8

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm sinh thái của cây khoai môn sọ 8

1.1.2 Phân loại học cây khoai môn sọ 9

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây khoai môn sọ 13

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng của cây khoai môn sọ 14

1.1.5 Tình hình sản xuất khoai môn sọ trên thế giới và Việt Nam 16

1.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY KHOAI MÔN SỌ 19

1.2.1 Khái niệm đa dạng di truyền 19

1.2.2 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền 20

1.2.3 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ 21

1.3 THU THẬP, BẢO TỒN VÀ SỬ DỤNG NGUỒN GEN KHOAI MÔN SỌ 30

1.3.1 Một số vấn đề về thu thập, bảo tồn và sử dụng nguồn gen thực vật 30

1.3.2 Thu thập, bảo tồn và sử dụng nguồn gen khoai môn sọ 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 VẬT LIỆU 41

2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 44

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.3.1 Phương pháp bố trí trồng và chăm sóc các giống nghiên cứu trên đồng ruộng 45

2.3.2 Các phương pháp sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống nghiên cứu 46

2.3.4 Phương pháp nuôi cây mô, tế bào thực vật 50

2.3.5 Phương pháp chọn dòng đột biến 51

2.3.6 Phương pháp xử lí số liệu 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN KHOAI MÔN SỌ 55

3.1.1 Đa dạng về các đặc điểm hình thái và nông học các mẫu giống khoai môn sọ và một số loài gần 55

3.1.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ và một số loài gần sử dụng chỉ thị phân tử ADN 64

3.1.3 Mối tương quan giữa chỉ thị hình thái – nông học, chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR trong đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ và một số loài gần 94

3.1.4 Kết quả phân tích hàm lượng chất khô, thành phần dinh dưỡng và vị ngon của củ của 12 giống khoai môn sọ hạt nhân 99

3.2 NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM KHAI THÁC MỘT SỐ NGUỒN GEN BẰNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO KẾT HỢP ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM 104

3.2.1 Nghiên cứu nhân nhanh một số giống khoai môn sọ địa phương bằng nuôi cấy chồi đỉnh in vitro 105

3.2.2 Nghiên cứu tạo củ in vitro và tiềm năng ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong sản xuất 113

3.2.3 Thử nghiệm ứng dụng kết hợp đột biến phóng xạ tia gamma (nguồn

Co 60 ) và nuôi cây mô, tế bào thực vật ở khoai môn sọ 118

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 137

TÀI LIỆU THAM KHẢO 140

PHỤ LỤC 150

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các

phân đoạn được nhân bản

ANOVA Analysis of variance – Phân tích phương sai

EDTA Ethylendiamine tetra acetic acid

FAO Food and Agriculture Orgnization - Tổ Chức lương thực và Nông

nghiệp Liên Hiệp Quốc

IAA Indole-3-acetic acid

IPGRI International Plant Genetic Resources Institute – Viện Tài nguyên

Di truyền Thực vật quốc tế

NAA Naphthalene Acetic Acid

NTSYS Numerial Taxonomy System

PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polymerase

PIC Polymorphic Information Content – Hàm lượng thông tin đa hìnhRAPD Random Amplified Polymorphic DNA – Đa hình ADN được nhân

bội ngẫu nhiên

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các

đoạn cắt giới hạn

SDS Sodium dodecyl sulfate

SSR Simple Sequence Repeat – Sự lặp lại trình tự đơn giản

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Tình hình sản xuất khoai môn sọ ở các nước trên thế giới năm 2010

và tỉ lệ tăng trưởng trung bình hàng năm (2000-2010)

17

1.2 Qui trình thiết lập bộ sưu tập hạt nhân khoai môn sọ các nước Thái

Bình Dương

38

3.1 Sự phân bố của 40 mẫu giống khoai môn sọ theo một số đặc điểm

hình thái – nông học quan trọng

59

3.3 Đặc trưng phân tử có ý nghĩa nhận dạng loài khoai môn sọ và một

số loài gần dựa trên chỉ thị RAPD

70

3.4 Đặc trưng phân tử các giống khoai môn sọ địa phương dựa trên chỉ

thị RAPD

75

3.5 Tổng số băng ADN và số băng ADN đặc trưng vùng được nhân lên

từ 14 mồi ngẫu nhiên của các mẫu giống khoai môn sọ nghiên cứu

76

3.6 Mẫu giống khoai môn sọ và một số loài gần sử dụng trong phân tích

SSR

79

3.8 Các alen SSR có ý nghĩa đặc trưng phân tử nhận dạng các loài

nghiên cứu thuộc họ Ráy

3.12 Bộ sưu tập hạt nhân các giống khoai môn sọ được lựa chọn dựa trên

số liệu hình thái và phân tử

92

3.13 Thành phần dinh dưỡng của củ của một số giống khoai môn sọ địa

phương miền Bắc và Bắc Trung Bộ

3.16 Khả năng tái sinh chồi trực tiếp của các mẫu giống trên môi trường

có bổ sung BAP và α-NAA khác nhau

107

3.17 Hiệu quả nồng độ BAP và α-NAA đến hệ số nhân chồi ở 3 giống

khoai môn sọ

109

3.18 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA đến sự sinh trưởng và hình

thái của bộ rễ của cây khoai môn sọ in vitro

3.22 Ảnh hưởng của BAP và đường đến tỉ lệ nhân chồi củ (số chồi

củ/cụm) ở hai giống khoai môn sọ sau 8 tuần nuôi cấy

115

3.23 Ảnh hưởng của BAP và đường đến khối lượng củ tươi của một số

giống khoai môn sọ sau 8 tuần nuôi cấy

115

3.24 Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) đến tỷ lệ

sống của chồi in vitro của 3 giống khoai môn sọ nghiên cứu

119

3.25 Ảnh hưởng của tia gamma (nguồn Co60) tới hệ số nhân chồi in

vitro và sinh trưởng của cây in vitro

121

3.26 Tần số xuất hiện các biến dị hình thái của cây in vitro ở các liều

chiếu khác nhau của các giống khoai môn sọ nghiên cứu

123

3.27 Đặc điểm nông sinh học các dòng biến dị ở thế hệ M1 1263.28 Đặc điểm nông sinh học một số dòng biến dị thế hệ M2 1273.29 Đặc điểm nông sinh học của một số dòng đột biến thế hệ M3 1313.30 Giá trị PIC trong các dòng khoai môn sọ đột biến và các giống gốc 1323.31 Thành phần dinh dưỡng của củ của 3 dòng khoai môn sọ đột biến và

2 giống gốc môn thơm (Lạng Sơn) và Cụ Cang (Sơn La)

136

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Mối quan hệ giữa các mẫu giống khoai môn sọ dựa trên

20 đặc điểm hình thái - nông học

3.4 Sản phẩm PCR với mồi OPA18 trên gel điện di và các vị trí băng

đặc trưng loài, giống

71

3.5 Quan hệ di truyền giữa 40 mẫu giống trong loài khoai môn sọ

dựa trên số liệu đa hình RAPD

3.8 Đa hình SSR với mồi HK22 trên gel điện di và alen đặc trưng nhận

dạng các giống loài nghiên cứu

83

3.9 Sản phẩm PCR với mồi HK7 trên gel điện di và các vị trí băng đặc

trưng giống khoai môn sọ

87

3.10 Tỉ lệ alen đặc trưng cho mỗi vùng sinh thái của 20 mẫu khoai môn

sọ qua phân tích với 9 mồi SSR

90

3.11 Quan hệ di truyền giữa các loài nghiên cứu trong họ Ráy dựa trên

chỉ thị hình thái – nông học, chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR

95

3.12 Mối quan hệ di truyền giữa các giống khoai môn sọ nghiên cứu

dựa trên chỉ thị hình thái – nông học, chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR

97

3.13 Chồi tái sinh trên môi trường MS bổ sung 5mg/l của mẫu giống

Cụ Cang (Sơn La) và Sáp vàng (Thanh Hóa)

108

3.14 Chồi nhân lên trên môi trường MS có bổ sung BAP và α-NAA

khác nhau ở 3 giống khoai môn sọ nghiên cứu

108

3.15 Cây khoai môn sọ có nguồn gốc in vitro phát triển trên đồng ruộng 111

3.16 Củ in vitro được tạo ra trong môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP 1163.17 Cây khoai môn sọ mọc từ củ in vitro phát triển trên đồng ruộng 1173.18 Biến dị các dạng lá bất thường của chồi in vitro ở liều chiếu 30 Gy

của các giống khoai môn sọ

124

3.19 Củ thu hoạch từ dòng khoai đột biến LS-03-01 và đối chứng 1283.20 Cây LS-03-01 không bị cháy lá và đối chứng 1293.21 Củ của dòng đột biến CC-03-01 và đối chứng 1303.22 Cây của dòng CC-03-01 bị cháy lá nhẹ và đối chứng 1303.23 Mối quan hệ về di truyền giữa các dòng đột biến và giống gốc 1333.24 Kết quả điện di sản phẩm SSR của 4 dòng khoai môn sọ đột biến

và các giống gốc với mồi HK22 và mồi HK29

134

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khoai môn sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) thuộc họ Ráy (Araceae), là

một trong những loài cây trồng lấy củ lâu đời nhất, được trồng nhiều ở vùng nhiệtđới và cận nhiệt đới ẩm

Khoai môn sọ là loài cây trồng có giá trị Ở nhiều giống, hầu như tất cả các

bộ phận của cây bao gồm củ cái, củ con, dải bò, thân, lá và hoa đều có thể ăn được

Củ khoai môn sọ chứa hàm lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp vànhiều khoáng chất canxi, photpho hơn các loại tinh bột khác Lá khoai môn sọ chứahàm lượng protein cao hơn ở củ và chứa hàm lượng cao đáng kể nguồn caroten,khoáng chất, vitamin Ngoài ra cây khoai môn sọ còn được dùng trong các bàithuốc chữa các bệnh: viêm khớp, sưng hạch, sa trực tràng Chất chiết từ tinh bột củkhoai sọ có khả năng chống tế bào ung thư ruột kết Protein globulin (G1 và G2)trong củ khoai sọ có vai trò quan trọng trong cơ chế chống côn trùng và nấm bệnh.Khoảng 400 triệu người sử dụng khoai môn sọ trong các bữa ăn thường ngày Khoaimôn sọ là loại rau được tiêu thụ đứng hàng thứ 14 và là loài cây có củ được tiêu thụnhiều thứ 5 trên thế giới Vì thế, cây khoai môn sọ có vị trí đáng kể trong viễn cảnhkinh tế thế giới về sự ổn định kinh tế và đa dạng hóa cây trồng Hơn nữa, cây khoaimôn sọ là một trong số ít các cây trồng có khả năng phát triển tốt trên đất đầm lầyhoặc đất trống đồi trọc, do đó sẽ rất có ý nghĩa trong xóa đói giảm nghèo Tuy nhiên,loài cây trồng này cũng đang đối mặt với sự xói mòn di truyền do những thay đổi về

cơ cấu cây trồng, sự phát triển diện tích trồng các giống năng suất cao và sự thu hẹpdiện tích đất trồng nông nghiệp do đô thị hóa và cả những áp lực có tính kỹ thuậtđến sự phát triển của loài cây này, bao gồm cả những đặc tính sinh học, tính dễ bịtàn lụi, tỉ lệ nhân giống thấp, vị ngứa, bệnh bạc lá, thiếu nguồn giống sạch bệnh

Trên thế giới, các kỹ thuật phân tử (điện di isozyme, RFLP, RAPD, AFLP,SSR) đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyềnnguồn gen và xác lập bộ sưu tập khoai môn sọ hạt nhân ở nhiều nước Việt Nam cónguồn gen khoai môn sọ rất phong phú Gần 500 mẫu giống từ mọi miền đất nướcđang được bảo tồn tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia và 195 mẫu giống đangđược lưu giữ kép trên đồng ruộng tại điểm sinh thái Đà Bắc – Hòa Bình là nguồn tài

nguyên di truyền khoai môn sọ quí giá cần được đánh giá một cách có hệ thống đểbảo tồn và định hướng khai thác hiệu quả, bền vững Chúng ta đã thành công trongviệc thu thập, lưu giữ, đồng thời cũng đã công bố khá nhiều kết quả đánh giá đadạng nguồn gen quí giá này Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu ở mức hình thái,nông học, một số ở mức sinh hóa và tế bào; nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật ADNđối với nguồn gen khoai môn sọ còn rất hạn chế và mới chỉ bước đầu Tư liệu đặctrưng phân tử của các kiểu hình thái đang được bảo tồn vì thế còn quá ít ỏi Ứngdụng các kỹ thuật phân tử để phân tích đa hình ADN, phát hiện các chỉ thị ADN hữuích không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền và tiến hóa của loài câytrồng này mà sẽ rất có ý nghĩa trong việc đặc trưng phân tử các giống, cung cấp cơ

sở dữ liệu để thiết lập bộ sưu tập hạt nhân (core collection) khoai môn sọ phục vụbảo tồn có hiệu quả hơn

Khai thác nguồn gen bằng ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt ứng dụng

kỹ thuật nuôi cây mô, tế bào thực vật kết hợp với đột biến thực nghiệm, các nhàkhoa học đã phục tráng và chọn tạo ra nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao

và chất lượng tốt Trên thế giới, nghiên cứu cải tiến giống và tạo giống mới bằngứng dụng công nghệ sinh học và đột biến thực nghiệm đã được báo cáo ở loài câykhoai môn sọ (Seetohul, 2007; Sukamto, 2003) Ở Việt Nam, nhóm tác NguyễnPhùng Hà, Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs (2010) cũng đã báo cáo kết quả chọn tạogiống khoai sọ KMC1-TN bằng phương pháp truyền thống Tuy nhiên, vẫn chưa cócông trình về nghiên cứu ứng dụng đột biến thực nghiệm trong chọn giống ở loài câytrồng này Nguồn gen giống khoai môn sọ địa phương nổi tiếng có chất lượng củthơm ngon được người tiêu dùng ưa chuộng khá phong phú, khả năng chống chịucác stress sinh học và phi sinh học ở các giống khoai địa phương rất cao nhưng donăng suất thấp, nguồn giống sạch bệnh thiếu đã hạn chế sự phát triển các giống quínày trong sản xuất hàng hóa Thử nghiệm ứng dụng công nghệ sinh học và đột biếnthực nghiệm trong cải tiến giống và chọn tạo giống mới sẽ góp phần định hướngkhai thác có hiệu quả nguồn gen khoai môn sọ ở nước ta

Xuất phát từ lí luận và thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đa dạng di truyền và cải tiến nguồn gen khoai môn sọ bản địa bằng công nghệ sinh học và đột biến thực nghiệm”

2 Căn cứ pháp lý và cơ sở khoa học của định hướng nghiên cứu

- Văn bản của Chính phủ Việt Nam: Quyết định số 79/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng

chính phủ phê duyệt Kế hoạch hành động quốc gia về Đa dạng Sinh học đến 2010

và định hướng đến năm 2020 thực hiện Công ước Đa dạng sinh học và Nghị định thư Cartagena về An toàn sinh học ngày 31/5/2007 [26]; Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành Danh mục nguồn gen cây trồng quý hiếm cần bảo tồn ngày 05 tháng 12 năm 2005 [3].

- Việt Nam có lịch sử văn hóa trồng trọt lâu đời, sự đa dạng giống khoai môn sọ ởnước ta rất cao, tập đoàn giống khoai sọ đang được lưu giữ rất lớn [9], [12], [13],[14]

- Các nghiên cứu đánh giá đa dạng nguồn gen khoai môn sọ đã được bắt đầu khá lâunhưng chủ yếu ở mức hình thái, nông học hoặc mức sinh hóa và tế bào [12], [13],[14], [28], [29], [30], nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật ADN mới ở bước đầu [8].Các tư liệu về đặc trưng phân tử của các kiểu hình thái đang được bảo tồn vì thế cònquá ít ỏi; bộ sưu tập hạt nhân (core collection) khoai môn sọ chưa được xác lập đểbảo tồn có hiệu quả nguồn tài nguyên di truyền và giảm thiểu kinh phí duy trì Khaithác và sử dụng nguồn gen bảo tồn chỉ mới bước đầu, chưa có thành tựu ứng dụngcông nghệ sinh học để cải tiến và chọn tạo giống khoai môn sọ mới

- Các kỹ thuật phân tử ADN đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu đánh

giá nguồn gen khoai môn sọ ở nhiều nước trên thế giới: RAPD [52], [61], [84], [96],[98], [101]; AFLP [37], [65], [90]; SSR [48], [70], [71], [82], [93], [99]

- Trên thế giới các nghiên cứu chọn giống khoai môn sọ bằng đột biến thực nghiệm

đã đạt được những thành tựu đáng khích lệ [94], [103]

3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

(1) Xác định được mức độ đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ bản địa ở cáctỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ bằng phân tích hình thái – nông học, chỉ thị RAPD

và chỉ thị SSR; cung cấp tư liệu khoa học cơ bản về đa dạng gen, đặc trưng phân tửcủa mẫu giống; đề xuất bộ sưu tập hạt nhân (core collection) khoai môn sọ phục vụcông tác bảo tồn, khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn gen khoai môn sọ bản địa

(2) Xác định được quan hệ di truyền tiến hóa trong loài khoai môn sọ và với một số

loài gần thuộc chi Colocasia và Alocasia dựa trên các số liệu hình thái và phân tử

ADN

(3) Xây dựng được quy trình nhân nhanh in vitro một số giống khoai môn sọ địa

phương cho sản xuất

(4) Xác định được mức độ mẫn cảm với phóng xạ tia gamma của một số giống khoaimôn sọ địa phương và chọn lọc được một số dòng khoai môn sọ đột biến có triểnvọng phục vụ cho nghiên cứu cải tiến giống

4 Nội dung nghiên cứu của đề tài

Để đạt những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu sau:(1) Khảo sát và đánh giá mức độ đa dạng về một số đặc điểm hình thái và đặc tính

nông học của một số giống khoai địa phương thuộc loài khoai môn sọ (C esculenta)

và của một số loài có quan hệ gần phân bố ở miền Bắc và Bắc Trung Bộ

(2) Phân tích đa hình ADN bằng sử dụng kỹ thuật phân tử RAPD và SSR; đánh giá

sự hữu ích của các chỉ thị phân tử để đặc trưng phân tử các mẫu giống

(3) Đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen dựa trên số liệu RAPD và SSR.Phân nhóm giống và phân tích mối quan hệ di truyền trong loài khoai môn sọ và với

các loài có quan hệ gần thuộc chi Colocasia và Alocasia.

(4) Nghiên cứu đề xuất bộ sưu tập hạt nhân từ các mẫu giống khoai môn sọ phân tíchdựa trên các dữ liệu hình thái – nông học, đa hình RAPD và SSR

(5) Phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh và phẩm chất củ của các giống khoai môn sọtrong bộ mẫu giống khoai môn sọ hạt nhân

(6) Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật xây dựng

quy trình nhân giống cây in vitro và củ in vitro của một số giống khoai môn sọ địa

phương phục vụ cho sản xuất

(7) Bước đầu nghiên cứu mức độ mẫn cảm với phóng xạ tia gamma của một sốgiống khoai môn sọ và đề xuất một số dòng đột biến có triển vọng phục vụ nghiêncứu cải tiến giống khoai môn sọ địa phương

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Ứng dụng phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại (phân tích đahình RAPD và SSR) trên các mẫu giống khoai môn sọ và một số loài gần, đề tài đãcung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng và có ý nghĩa trong đánh giá đa dạng di truyềnnguồn gen khoai môn sọ, nghiên cứu tiến hóa và phát sinh hệ thống trong loài vàgiữa các loài khoai môn ở Việt Nam

Đa hình ADN và các chỉ thị ADN đặc trưng phát hiện trong nghiên cứu đãkhắc phục được những khó khăn gặp phải khi xác định vị trí chủng loại phát sinh của

các loài thuộc chi khoai môn (Colocasia) dựa trên hình thái Đề tài đã cung cấp được

một số dữ liệu phân tử ADN hữu ích để đánh giá chính xác hơn đa dạng nguồn gen,đặc trưng phân tử mẫu giống làm cơ sở xác lập tập đoàn hạt nhân khoai môn sọ chobảo tồn và khai thác hiệu quả nguồn gen

Vi nhân giống thành công bằng nuôi cấy đỉnh chồi và tạo củ in vitro đã cung

cấp cơ sở ứng dụng khoa học công nghệ có thể chủ động nguồn giống phục vụ mởrộng diện tích trồng khoai môn sọ đặc sản theo định hướng sản xuất hàng hóa

Kết quả nghiên cứu kết hợp nuôi cây mô, tế bào thực vật với phóng xạgamma (nguồn Co60) đã cho thấy mức độ mẫn cảm khác nhau với phóng xạ gammacủa các kiểu gen giống Bước đầu chỉ ra được liều chiếu xạ có hiệu quả vào giai

đoạn cây in vitro và tiềm năng ứng dụng phóng xạ trong cải tiến giống khoai môn sọ

địa phương ở nước ta

Bảy công trình khoa học đã công bố (5 bài báo đăng tải trên các tạp chí khoahọc, 1 báo cáo khoa học đăng tải trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học quốc gia và 1 báocáo trình bày tại Hội nghị quốc tế về cây họ Ráy) là những tư liệu có giá trị thamkhảo

* Ý nghĩa thực tiễn:

Đã đề xuất 12 mẫu giống trong tổng số 40 mẫu giống nghiên cứu vào bộ sưutập hạt nhân khoai môn sọ cần được bảo tồn lâu dài, và 2 vùng sinh thái có đa dạng

di truyền giống cũng như số lượng alen đặc trưng vùng cao cần có kế hoạch bảo tồntại chỗ nguồn gen.

Đã đề xuất được 1 quy trình nhân nhanh in vitro từ chồi đỉnh và 1 quy trình tạo củ in vitro của 3 giống khoai địa phương để có thể chủ động nguồn củ giống cho

sản xuất

Đã xác định được liều chiếu xạ gamma có hiệu quả áp dụng cho cải tiến 3giống khoai môn sọ địa phương, và chọn lọc được 3 dòng khoai môn sọ đột biến cótriển vọng về một số đặc điểm nông sinh học từ 2 giống gốc để tiếp tục nghiên cứuđánh giá

6 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

* Đối tượng nghiên cứu:

Nghiên cứu sử dụng một số giống khoai môn sọ thu thập từ một số địaphương ở miền Bắc và Bắc Trung bộ Việt Nam và một số loài có quan hệ gần vớiloài khoai môn sọ

* Phạm vi nghiên cứu:

Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ địa phương và phân tíchmối quan hệ di truyền giữa loài khoai môn sọ và một số loài gần sử dụng chỉ thị hìnhthái – nông học và chỉ thị phân tử ADN (RAPD và SSR)

Thử nghiệm ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật kết hợp độtbiến thực nghiệm trong chọn tạo, cải tiến một số giống khoai môn sọ địa phương

7 Đóng góp mới của đề tài

Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam phân tích một cách có hệ thống về sự

đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ địa phương cũng như mối quan hệ di

truyền trong loài Colocasia esculenta và với một số loài có quan hệ gần gũi với loài cây này dựa dựa trên bộ số liệu phong phú về hình thái và phân tử ADN.

Mức độ đa dạng di truyền cao trong các mẫu giống khoai môn sọ nghiên cứu

và các chỉ thị phân tử đặc trưng mẫu giống và đặc trưng vùng sinh thái là nhữngphát hiện mới có ý nghĩa tư liệu hóa nguồn gen

Lần đầu tiên một bộ sưu tập hạt nhân (gồm 12 giống khoai môn sọ) đã được

đề xuất dựa trên số liệu phong phú về đa dạng di truyền ở cả mức hình thái, phân tửADN và một số thành phần dinh dưỡng của củ từ 40 mẫu giống khoai môn sọnghiên cứu, góp phần vào việc bảo tồn và khai thác, sử dụng có hiệu quả hơn nguồngen khoai môn sọ địa phương trong điều kiện còn hạn chế về kinh phí duy trì như ởnước ta

Phát hiện sự gần gũi về mặt di truyền của 2 loài môn hoang dại (Colocasia lihengeae và Colocasia menglaensis) với các loài ráy thuộc chi Alocasia đã cung

cấp cơ sở phân tử có thể giúp giải quyết khó khăn trong việc xác định vị trí chủngloại phát sinh của 2 loài khoai môn hoang dại do chúng mang những đặc điểm hình

thái giống cả Colocasia và cả Alocasia.

Mức độ mẫn cảm với phóng xạ tia gamma thay đổi phụ thuộc kiểu gen giống,

liều chiếu xạ vào giai đoạn chồi in vitro có hiệu quả chọn giống nằm trong khoảng

10 – 50 Gy; 3 dòng đột biến có triển vọng về năng suất và chống chịu hạn, là những

tư liệu đầu tiên ở Việt Nam về ứng dụng đột biến thực nghiệm trong cải tiến giống ởloài cây trồng lâu đời nhất này, mở ra khả năng áp dụng công nghệ sinh học vào pháttriển sản xuất khoai môn sọ vì mục đích xóa đói giảm nghèo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY KHOAI MÔN SỌ

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm sinh thái của cây khoai môn sọ

Khoai môn sọ là loài thực vật thuộc họ Ráy, có tên khoa học là Colocasia esculenta (L.) Schott, là một trong những loài cây trồng lấy củ lâu đời nhất, có niên

đại hơn 9.000 năm [36], [60], [80], [91]

Nguồn gốc của khoai môn sọ hiện vẫn chưa có ý kiến thống nhất hoàn toàntrong các nhà khoa học chuyên nghiên cứu về loài cây này Theo ý kiến của nhiềunhà khoa học, khoai môn sọ hiện nay có chung nguồn gốc ở vùng Indo-Malaysia, có

lẽ ở Tây Ấn Độ và Bangladesh Từ đây, cây khoai môn sọ lan rộng về phía Đôngđến Đông Nam Á, Đông Á và các đảo Thái Bình Dương; về phía Tây tới Ai cập vàĐông Địa Trung Hải và cuối cùng về phía Nam đến châu Phi, từ đó di chuyển đếnCaribê và Mỹ [15], [39], [49], [52], [101], [113] Một quan điểm khác dựa trên dữliệu isozyme và phân tử ADN lại cho rằng đã có sự tiến hóa song song của hai vốngen khoai môn sọ, xuất phát từ hai trung tâm tiến hóa khác nhau (ở vùng Đông Namchâu Á và vùng Tây Nam Thái Bình Dương) [65], [66], [71], [90], [74], [75], [77],[78] Miền tây Melanesia, trung tâm nguồn gốc và thuần hóa của một vài loài câytrồng khác như chuối, dừa, mía, hiện nay có bằng chứng rằng khoai môn sọ có thểcũng đã được thuần hóa ở vùng này Sự chú ý tập chung chủ yếu ở Papua NewGuinea, với bằng chứng về sự định cư của con người khoảng 40.000 năm và có nềnnông nghiệp ít nhất 6.550 – 7.000 năm [56], [57], [41], [42] Phát hiện hạt phấn hóathạch của khoai môn và ráy trên các dụng cụ bằng đá ở phía bắc quần đảo Solomonvới niên đại 28.000 năm đã bổ sung thêm bằng chứng cho quan điểm này [68] Theocách đó, khoai môn sọ trồng được tìm thấy ở Thái Bình Dương đã không được dunhập vào vùng này bởi những người định cư từ vùng Indo-Malaysia như những suyđoán trước đây [87], [67], [60], mà được thuần hóa từ nguồn gốc hoang dại đang tồntại ở Melanesia Từ Melanesia, khoai môn sọ đã được mang đến Polynesia trong suốt

quá trình di cư thời tiền sử của con người với sự suy giảm về số lượng và sự đa dạng[111], [112], [62] Cũng theo cách đó, sự thuần hóa khoai môn sọ cũng diễn ra ởĐông Nam châu Á với sự phân chia của vùng đất Sunda và Sahul Hai vốn gen đãxuất hiện ở Đông Nam Á và Thái Bình Dương với sự gối lợp qua vùng Indonesia[74], [75], [77], [78], [113], [114], [112], [62], [63], [58], [66]

Cây khoai môn sọ thích ứng được với nhiều loại đất khác nhau, được trồngnhiều ở loại đất chua, thành phần đất nhẹ, nhiều mùn và có khả năng chịu được hạn,chịu đất chua, đất mặn, đất nghèo dinh dưỡng phù hợp để khai thác tại những vùngsinh thái khó khăn, nơi những cây trồng khác không thể trồng được hoặc kém pháttriển [9], [14] và [120] Khoai môn sọ là cây dài ngày, yêu cầu độ ẩm cao cho sinhtrưởng và phát triển Cây đạt năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh sángcao, tuy vậy khoai môn sọ lại là loại cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loạicây khác Cây vẫn có thể cho năng suất cao ngay trong điều kiện che bóng, nơinhững cây trồng khác không thể phát triển được Đây là đặc tính ưu việt khiến câykhoai môn sọ được coi là cây trồng xen lý tưởng [14]

1.1.2 Phân loại học cây khoai môn sọ

Trong hệ thống phân loại thực vật, loài khoai môn sọ có vị trí phân loại như sau:

Chi: Khoai môn (Colocasia)

Loài: Colocasia esculenta (L.) Schott [11], [12], [79].

Trên thế giới, họ Ráy (Araceae) là một họ tương đối lớn với 106 chi và 2.823loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới (đặc trưng cho rừng ẩm) và cận nhiệt đới ỞViệt Nam, họ Ráy có khoảng 30 chi với khoảng 156 loài, chủ yếu là những loài cây

ưa bóng ở tầng thấp trong rừng hoặc bì sinh trên cây khác Đã có rất nhiều loài Ráy

mới được phát hiện, tính đến năm 2009, có thêm 38 loài Ráy mới được phát hiện ởĐông Dương và Việt Nam [4], [5].

Cây khoai môn, khoai sọ thuộc chi khoai môn (Colocasia) là một trong

những chi quan trọng nhất của họ ráy Trên thế giới chi này bao gồm khoảng 8 loài.Các loài trong chi này được sử dụng làm nguồn lương thực, thực phẩm cho người và

thức ăn cho gia súc Theo các tài liệu đã công bố, Việt Nam có 5 loài là C esculenta (L.) Schott, C gigantea, C indica, C lihengeae và C menglaensis [4], [5], [14] Khoai môn sọ trồng được định loại loài C esculenta (L.) Schott là một loài phức

Chi Colocasia được xác định bởi Schott năm 1832 trên cơ sở hai loài đã được Linnacus mô tả lần đầu tiên vào năm 1753 là Arum colocasia và Arum esculentum [14] Schott cũng đã đặt lại tên của hai loài này là C esculenta và C antiquorum Hiện nay, trong nghiên cứu phân loại chi Colocasia vẫn còn nhiều tranh cãi chưa ngã ngũ Một số nhà phân loại thực vật học cho rằng có một loài đa hình là C esculenta và ở mức độ dưới loài biết đến có C esculenta var esculenta và C esculenta var antiquorum (Ghani, 1984) [55] Một số khác lại cho rằng chi Colocasia có một loài phức là C antiquorum và ở mức độ dưới loài là C antiquorum var typica, C antiquorum var euchlora, C autiquorum var esculenta

(Kumazawa, 1956) [59] Tuy nhiên, có trường phái lại cho rằng, chắc chắn có hai

loài C esculenta và C antiquorum được phân biệt dựa vào những đặc điểm hình thái hoa (Purseglove, 1972) [88] Theo quan điểm này thì loài C esculenta có phần phụ vô tính ở đỉnh bông mo thò ra khỏi mo hoa, ngắn hơn cụm hoa đực Còn loài C antiquorum có phần phụ vô tính ở đỉnh bông mo không thò ra khỏi mo hoa, dài hơn

cụm hoa đực

Ở Việt Nam, trong nhiều tài liệu nghiên cứu về cây khoai môn sọ, các tác giảđều sử dụng danh từ chung “Cây khoai môn” vừa để chỉ giống cây thích nghi vớimôi trường đất bị ngập nước hoặc ẩm ướt, với tên thường gọi là “Cây khoai nước”

và cũng để chỉ nhóm cây chịu hạn mà không chịu được ngập úng tên thường gọi là

“Cây khoai sọ” (Bùi Công Trừng và cs, 1963) [27], (Nguyễn Đăng Khôi và NguyễnHữu Hiến, 1985) [18] Đến nay, tên của loài cây môn sọ trong các tài liệu hiện hành

cũng được sử dụng rất khác nhau Có tác giả cho rằng “Cây khoai môn” là tên chung

để chỉ hai nhóm cây hoàn toàn khác nhau về loài là cây khoai nước (C esculenta) và cây khoai sọ (C antiquorum) Một số khác lại cho rằng “Cây khoai môn” với tên loài của nó C esculenta (L.) Schott là tên chung của cả hai nhóm khoai nước và

khoai sọ (Nguyễn Hữu Bình, 1963) [2], (Nguyễn Đăng Khôi và Nguyễn Hữu Hiến,1985) [18] Nhóm nghiên cứu cây có củ thuộc Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệpViệt Nam vào những năm thập kỷ 60 lại cho rằng “Cây khoai môn” với tên loài của

nó C antiquorum là tên chung của hai nhóm cây khoai nước và khoai sọ (dẫn theo Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs, 2004) [14]

Từ năm 1998, khi nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ ởViệt Nam, các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trương Văn Hộ, Nguyễn Văn Viết,

Nguyễn Phùng Hà, cho rằng giả thiết có hai loài phụ dưới loài C esculenta là C esculenta var esculenta và C esculenta var antiquorum với tên gọi khoai môn và

khoai sọ là có lý hơn cả Nguồn gen khoai môn sọ bao gồm 3 biến dạng thực vật làkhoai môn (Dasheen type), khoai sọ (Eddoe type) và nhóm trung gian Ba biến dạngnày có mối quan hệ khá gần gũi trong quá trình tiến hoá từ cây khoai nước đếnkhoai môn và sau cùng là cây khoai sọ [14]

Loài phụ C esculenta var esculenta theo phân loại dưới loài cho thấy có hai

nhóm cây là nhóm khoai nước (chịu ngập úng) và nhóm khoai môn (sử dụng củ cái

và trồng trên đất cao) Hai nhóm này sử dụng củ cái để ăn, củ con để làm giống vàdọc lá dùng để chăn nuôi Hoa có phần phụ vô tính ngắn hơn so với phần cụm hoađực

Loài phụ C esculenta var antiquorum gồm nhóm cây khoai sọ Nhóm này có

củ cái kích thước nhỏ đến trung bình kèm theo nhiều củ con có tính ngủ nghỉ Nhómkhoai sọ phân bố rộng có thể trồng trên đất ruộng lúa nước hoặc trên đất phẳng cótưới, thậm chí trên đất dốc sử dụng nước trời Hoa có phần phụ vô tính dài hơn phầncụm hoa đực Vì vậy nên gọi nhóm cây khoai môn sọ là chính xác nhất, kể cả khi

cho rằng có một loài đa hình là C antiquorum và ở mức độ dưới loài là C.

antiquorum var typica, C antiquorum var euchlora và C antiquorum var esculenta [14]

Để nhận biết các giống của hai nhóm này, cần dựa vào kết quả phân tích tổnghợp của 3 nhóm đặc điểm:

Hình thái của củ cái và củ con

Số lượng nhiễm sắc thể

Đặc điểm hình thái hoa

Dựa vào hình thái của củ cái và củ con thấy rằng:

Nhóm C esculenta var esculenta (Dasheen) bao gồm các giống khoai môn

và khoai nước Đặc điểm của chúng là có một củ cái lớn quyết định năng suất khómkhoai, với một vài củ con nhỏ hoặc dải khoai (Stolon) không dùng để ăn Bông mocủa nhóm này có phần phụ vô tính ngắn hơn phần hoa đực Khả năng thích nghi củacác giống khoai thuộc nhóm này từ điều kiện đất bị ngập nước (khoai nước ở vùngchiêm trũng Nam Định, Thái Bình) tới những vùng đất cao thuộc các tỉnh trung dumiền núi và cao nguyên sử dụng nước trời như Sơn La, Hoà Bình, Lào Cai, LạngSơn, Cao Bằng, Thanh Hoá, Lâm Đồng với các giống điển hình như khoai mônThuận Châu, Hậu Doàng, Phước Ỏi, Phứa Lanh, khoai Mán vàng [14]

Nhóm C esculenta var antiquorum (Eddoe) gồm hầu hết các giống khoai sọ.

Đặc điểm chính của nhóm này là có một củ cái kích thước nhỏ hoặc trung bình, ănsượng và hơi ngái Xung quanh củ cái có nhiều củ con hình cầu hoặc hình trứng kíchthước khác nhau tuỳ thuộc giống Ở các giống khoai sọ, củ con là yếu tố quyết địnhnăng suất thương phẩm [14]

Trong những năm gần đây, thực hiện quyết định của Thủ tướng Chính phủ

về “Kế hoạch hành động đa dạng sinh học Việt Nam”, dự án “Xây dựng ngân hànggen cây trồng quốc gia” những loài thực vật hữu ích của Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đã và đang được triển khai tại Viện Khoa học Nông nghiệp ViệtNam Tính đến năm 2012, Trung tâm Tài nguyên thực vật đã thu thập được một tập

đoàn giống cây có củ khá lớn, đáng chú ý là tập đoàn khoai môn sọ (C esculenta)

với 478 mẫu giống chiếm 21,08% tập đoàn cây có củ được lưu giữ và bảo quản tại

An Khánh - Hoài Đức - Hà Nội và 195 mẫu giống đang được lưu giữ kép tại điểmsinh thái thuộc Đà Bắc - Hòa Bình [9].

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây khoai môn sọ

Cây khoai môn sọ (C esculenta (L.) Schott) là cây thân thảo, cao từ 0,5 - 2,0

m Cây có một củ cái ở giữa, các củ con xung quanh Rễ chùm, ngắn, mọc từ đốtmầm xung quanh thân củ Phần gốc phình to thành củ chứa tinh bột Củ cái là cấutrúc thân chính của cây, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh Mỗidọc lá lụi đi thì thân củ có thêm một đốt Đỉnh củ cái là điểm sinh trưởng của cây,kích thước và hình dạng củ rất khác nhau và phụ thuộc vào kiểu gen giống và cácyếu tố sinh thái

Lá là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, toàn bộ phần dọc lá tạo nên thân giảcủa cây Mỗi lá cấu tạo bởi một cuống lá thẳng và một phiến lá

Phiến lá hình khiên, gốc hình tim, có rốn gần giữa (điểm nối giữa cuống vàphiến lá) Trên phiến lá có 3 tia gân chính, một gân chạy từ rốn lá đến đỉnh phiến lá,hai gân còn lại chạy ngang về 2 đỉnh của thùy lá Từ 3 gân chính có nhiều gân nhỏtỏa ra tạo thành hình mắt lưới Cuống lá (dọc lá) xốp, trong nhu mô có nhiềukhoảng trống Dọc lá mập có bẹ ôm chặt phía gốc tạo nên thân giả Bẹ của dọc lá cóchiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc

Hoa thuộc loại đơn tính cùng gốc, hoa đực và hoa cái ở trên cùng một trục.Cụm hoa cấu tạo bởi một cuống ngắn, một trục hoa và một bao mo dài khoảng 20

cm Hoa không có bao, hoa đực màu vàng có nhị tụ nhiều cánh, hạt phấn tròn, bao

phấn nứt rãnh Hoa cái có bầu một ô, vòi rất ngắn [9], [12], [13], [14]. Từ khi trồngđến khi thu hoạch, cây khoai môn sọ trải qua 3 thời kỳ sinh trưởng: ra rễ mọc mầm,sinh trưởng thân lá, phình to của thân củ

Giai đoạn ra rễ mọc mầm: Ngay sau khi mọc mầm, rễ hình thành và pháttriển nhanh chóng, tiếp đó là sự phát triển nhanh của chồi (mầm) củ Chồi (mầm) rakhỏi mặt đất thì rễ dài khoảng 3 - 5 cm Sự phát triển của rễ tỷ lệ thuận với sự pháttriển của lá: cứ ra một lá thì lại sinh thêm một lớp rễ

Giai đoạn sinh trưởng thân lá: Sự hình thành củ cái bắt đầu sau trồng khoảng

3 tháng, ngay sau đó là sự hình thành củ con Trong giai đoạn này cây cũng đẻnhánh phụ Sự phát triển của lá và chồi giảm mạnh sau trồng khoảng 5 - 6 tháng

Giai đoạn phình to của thân củ: Khi sự phát triển của chồi giảm thì củ cái và

củ con phát triển rất nhanh Cuối vụ, bộ rễ và các chồi chính chết là thời điểm thuhoạch củ

Quá trình ra hoa và kết hạt ở khoai môn sọ là rất hiếm thấy trong tự nhiên,chỉ xảy ra đối với một số ít kiểu gen Hoa quan sát thấy khá sớm cùng với sự hìnhthành của củ, hoa được thụ phấn nhờ côn trùng Tuy nhiên, hầu hết các giống kếtthúc vòng đời trên đồng ruộng mà không có thời kì ra hoa Ở Việt Nam, trong điềukiện tự nhiên chỉ có các giống khoai nước thường ra hoa, còn khoai sọ rất hiếm Từkhi bắt đầu ra hoa đến khi hoa bắt đầu lụi mất khoảng 20 - 25 ngày [14]

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng của cây khoai môn sọ

* Thành phần dinh dưỡng

Phần có giá trị kinh tế chính của khoai môn sọ là củ cái, củ con và một sốgiống là dọc lá Trong củ tươi, nước chiếm 63 - 85%, hydratcacbon chiếm 13 - 29%,protein chiếm 1,4 - 3,0% với rất nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể Tinh bộtchiếm tới 77,9 % lượng hydratcacbon với 4/5 là amylopectin và 1/5 là amylose Hạttinh bột của khoai môn sọ rất nhỏ, dễ tiêu hoá Chính yếu tố này đã khiến khoaimôn sọ có thể thay thế các loại cây lương thực khác, là món ăn đặc biệt dành cho trẻnhỏ bị dị ứng, những người rối loạn dinh dưỡng và người ăn chay [13], [14]

Củ khoai môn sọ chứa 7% protein theo khối lượng khô, cao hơn khoai mỡ,sắn và khoai lang với rất nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể [14] Lượng proteinnằm ở phía gần vỏ củ cao hơn lượng protein nằm ở trung tâm của củ vì vậy nếu gọt

vỏ củ quá dày sẽ làm mất đi lượng protein trong củ [14]

Lá khoai môn sọ rất giàu protein, chứa khoảng 23% khối lượng khô, ngoài ra

lá chứa nhiều Ca, P, Fe, Vitamin C, B1 và B2 [13], [14], [43]

Có nhiều giống khoai môn sọ khi ta ăn hoặc da tiếp xúc với củ khoai thườngcảm thấy bị ngái hoặc ngứa Độ ngứa này biến động rất lớn giữa các giống [14],

[85], [121] Người tiêu dùng và người sản xuất thích sử dụng các giống không gâyngứa hoặc ít ngứa Hiện tượng này gây ra bởi sự hiện diện của các bó tinh thểoxalate canxi trong các mô tế bào của củ [14], [34] Tuy nhiên khi khoai được nấuchín độ ngứa này sẽ mất đi [14].

* Giá trị kinh tế và sử dụng

Cây khoai môn sọ được sử dụng làm lương thực và thực phẩm khá phổ biếntrên thế giới Các bộ phận của cây là củ cái, củ con, dọc lá và dải bò đều có thể chế biếnthành các món ăn [35] Theo nhiều nguồn tài liệu, cây khoai môn sọ có vai trò quantrọng như nguồn lương thực chính ở các nước ở quần đảo Thái Bình Dương và nhiềunước Châu Á [14], [35], [37], [50] Khoai môn sọ là loài cây trồng quan trọng nhất

của chi Colocasia (họ Ráy) cung cấp nguồn thức ăn, dinh dưỡng và đưa lại nguồn

thu nhập cho người nghèo Khoảng 400 triệu người sử dụng khoai môn sọ trong cácbữa ăn thường ngày Khoai môn sọ là loại rau được tiêu thụ đứng hàng thứ 14 [91]

và là loài cây có củ được tiêu thụ nhiều thứ 5 trên thế giới [48] Vì thế cây khoaimôn sọ có vị trí đáng kể trong viễn cảnh kinh tế thế giới về sự ổn định kinh tế và đadạng hóa cây trồng [61]

Ngoài ra cây khoai môn sọ còn có tác dụng chữa bệnh: là vị thuốc trong nhiềubài thuốc dân gian chữa các bệnh viêm khớp, sưng hạch, bạch huyết, sa trực tràng,kiết lị, đau dạ dày [14] Chất chiết từ tinh bột củ khoai sọ có khả năng chống tếbào ung thư ruột kết [36]

Protein globulin (G1 và G2) trong củ khoai sọ có vai trò quan trọng trong cơchế chống côn trùng và nấm bệnh [110]

Hơn nữa, cây khoai môn sọ là một trong số ít ỏi các cây trồng có khả năngphát triển tốt trên đất đầm lầy hoặc đất trống đồi trọc [61], phù hợp để khai thácnhững vùng sinh thái khó khăn, nơi những cây trồng khác không thể trồng hoặc kémphát triển [9], [14]

Khoai môn sọ có giá trị cao về văn hóa xã hội tại các nước có truyền thốngtrồng loại cây này Cây khoai môn sọ đã trở thành một hình ảnh trong văn hóa ẩm

thực, có mặt trong những lễ hội, ngày tết, được làm quà tặng bày tỏ mối quan hệràng buộc… [10], [14]

1.1.5 Tình hình sản xuất khoai môn sọ trên thế giới và Việt Nam

Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên HiệpQuốc (FAO, 2012) năm 2010 [54], diện tích trồng khoai môn sọ trên thế giới đạtkhoảng 1.260 triệu ha, năng suất bình quân 7,179 tấn/ha, sản lượng đạt khoảng9.112.600 tấn với tỉ suất gia tăng sản lượng hàng năm trung bình từ năm 2000 đếnnăm 2010 là 0,2% Tại châu Á – Thái Bình Dương, khoai môn sọ chiếm vị trí đáng

kể trong nông nghiệp, đặc biệt ở các nước châu Đại Dương, khoai môn sọ là câylương thực chính, có vai trò rất quan trọng trong an toàn lương thực của quốc gia,cộng đồng và hộ gia đình [14] Tính đến năm 2010, châu Á - Thái Bình Dương códiện tích trồng khoai môn sọ đạt khoảng 194.900 ha, năng suất trung bình: 13,132tấn/ha, sản lượng: 2.559.500 tấn với tỉ lệ gia tăng sản lượng hàng năm trung bình1,2% Một số nước ở châu Á - Thái Bình Dương có diện tích trồng và sản lượngkhoai môn sọ cao như Trung Quốc: 91.400 ha, năng suất trung bình: 18,795 tấn/ha,

sản lượng 1.768.500 tấn với sản lượng gia tăng trung bình hàng năm 0,9%; Papua NewGuinnea: 47.200ha, đạt 271.100 tấn với sản lượng tăng bình quân hàng năm 2,8%;Philippines: 17.200 ha, đạt 110.800 tấn với sản lượng bình quân tăng trưởng hàng

năm 2,0% (Bảng 1.1) [54].

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất khoai môn sọ ở các nước trên thế giới

năm 2010 và tỉ lệ tăng trưởng trung bình hàng năm (2000-2010)

Nước

Diện tích trồng Năng suất Sản lượng

Năm 2010

Tỉ lệ tăng trưởng trung bình hàng năm (2000- 2010)

Năm 2010

Tỉ lệ tăng trưởng trung bình hàng năm (2000- 2010)

Năm 2010

Tỉ lệ tăng trưởng trung bình hàng năm (2000- 2010)

(Ghi chú: … : Không có dữ liệu (Data not available).

Các dữ liệu ở bảng trên được tổng hợp từ các dữ liệu về diện tích, năng suất và sản lượng trồng khoai môn sọ năm 2010 của các nước trên thế giới theo FAO (2012) [54].)

Ở Việt Nam, khoai môn sọ, đặc biệt là khoai môn nước được thuần hóa từ rấtsớm, trước cả cây lúa nước, cách đây khoảng 10.000 - 15.000 năm [14] Cây khoaimôn sọ từng là cây lương thực quan trọng của cư dân các vùng Châu thổ sôngHồng, sông Cửu Long Cây khoai môn sọ được sử dụng trong các bữa ăn của ngườiViệt Nam từ ngàn đời nay, góp phần quan trọng vào cơ cấu thành phần lương thựccủa sản xuất nông nghiệp Tuy chưa có số liệu thống kê cụ thể về diện tích, năngsuất và sản lượng khoai môn sọ (FAO, 2012) [54], song kết quả điều tra của Trungtâm Tài nguyên di truyền thực vật cho thấy tiềm năng sản xuất khoai môn sọ ở một

số vùng như Bắc Ninh, Bắc Giang, Quảng Ninh, Sơn La, Hòa Bình và Lạng Sơn làrất lớn [14]

Diện tích trồng khoai môn sọ ở nước ta tuy nhỏ hơn so với các cây trồngkhác nhưng được người nông dân trồng phổ biến ở khắp các vùng sinh thái nôngnghiệp Hiện nay, tại một số tỉnh miền núi như Bắc Kạn, Hòa Bình, Sơn La… nhiềugiống khoai môn sọ được các hộ gia đình trồng với diện tích lớn, bởi vì các giốngnày là nguồn đảm bảo an toàn lương thực và đáp ứng yêu cầu chất lượng của thịtrường tại các thị trấn và các thành phố lớn Ngược lại, nhiều giống khác lại chỉđược trồng với diện tích nhỏ nhằm mục đích phục vụ bữa ăn hàng ngày của hộ giađình [14] Khoai môn sọ còn là mặt hàng nông sản được xuất khẩu sang Nhật Bản.Trong tương lai, cây khoai môn sọ sẽ có vị trí xứng đáng trong sản xuất nôngnghiệp nước ta [14]

1.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY KHOAI MÔN SỌ

1.2.1 Khái niệm đa dạng di truyền

Theo Công ước đa dạng sinh học 1992, đa dạng di truyền được hiểu là sựphong phú những biến dị trong cấu trúc di truyền của các cá thể bên trong hoặc giữacác loài; những biến dị bên trong hoặc giữa các quần thể [20]

Đa dạng di truyền biểu hiện ở nhiều cấp độ khác nhau từ hình thái đến phân

tử Đa dạng sinh học dù trong phạm vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh tháivới nhau thì đều xuất phát từ loại đa dạng này Đa dạng di truyền là nhân tố quyếtđịnh cuối cùng sự phân chia cũng như mối liên quan giữa các sự sống Bên cạnh đó,

đa dạng di truyền và đa dạng trao đổi chất là đặc biệt quan trọng để hiểu được lịch

sử, quá trình tiến hóa và các đặc tính phân loại đặc trưng của sự sống Vật chất ditruyền chính là cơ sở cho sự hình thành đa dạng sinh học trong tương lai [17]

1.2.2 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn, lai tạo những giống, loài mới

Đa dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế Đa dạng về

hệ sinh thái có chức năng bảo vệ môi trường sống Đồng thời các hệ sinh thái đượcduy trì và bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó [17],[120]

Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính (FAO, 1996) [53]:

Giá trị ổn định (Porfolio value): Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các

hệ thống nông nghiệp ở qui mô toàn cầu, quốc gia và địa phương Sự thiệt hại củamột giống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống khác cùngloài hoặc các cây trồng khác

Giá trị lựa chọn (Option value): Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học

cần thiết chống lại sự thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạnghữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi Giá trị của đa dạng di truyềnđược thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quí, hiếm của tàinguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, khả năng thích nghi, năng suất vàchất lượng Lấy thí dụ, năm 1946, giống lúa mì lùn Nhật Bản, Norin được nhập vào

Mỹ và đã góp phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mì Cácgiống lúa trồng có nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâubệnh cho nhiều vùng khác nhau trên thế giới Giống lúa tẻ tép của Việt Nam đượcIRRI sử dụng như nguồn kháng bệnh đạo ôn để tạo giống lúa kháng đạo ôn cho thếgiới Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng lúa bình quân của châu Á lên30% giữa những năm 1981 và 1986 (FAO,1996) [53]

Giá trị khai thác (Exploration value): Đa dạng di truyền được xem là kho dự

trữ tiềm năng các tài nguyên chưa được biết đến Đây cũng là lý do cần phải duy trì

cả các hệ sinh thái hoang dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống Đa dạng ditruyền là cơ sở cho việc tuyển chọn, lai tạo những giống, loài mới

Ngoài ra đa dạng di truyền còn có giá trị thẩm mỹ (thưởng thức, giải trí) vàgiá trị về đạo đức Có một số loài có cả giá trị sử dụng, thẩm mỹ và đạo đức; song

về giá trị cũng không đều nhau giữa các mặt giá trị và giữa các loài [120]

1.2.3 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ

Trong phân tích đa dạng di truyền thực vật nói chung và khoai môn sọ nóiriêng, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, từ phân tích các đặcđiểm hình thái, nông học, sinh lí và hóa sinh đến các đặc điểm của phân tử ADN

1.2.3.1 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị hình thái

Trong nghiên cứu, các đặc điểm hình thái được sử dụng như một chỉ thị đểphân tích đa dạng di truyền thực vật khi các tính trạng hình thái được kiểm soát bởimột locus gen đơn Mặc dù, chỉ thị hình thái được sử dụng như một chỉ thị ditruyền, song khả năng ứng dụng của nó trong chọn giống còn gặp phải hạn chế bởicác đặc điểm hình thái, nông học phần lớn do nhiều gen xác định, chịu ảnh hưởngcủa các nhân tố môi trường

Trên đối tượng khoai môn sọ, nhiều nghiên cứu khoa học trong nước vàquốc tế đã sử dụng chỉ thị hình thái để đánh giá đa dạng di truyền Ở Việt Nam,trong số 478 giống đang lưu giữ tại Trung tâm Tài nguyên Thực vật – Viện Khoahọc Nông nghiệp Việt Nam, 201 mẫu giống đã được nghiên cứu đánh giá đa dạng ditruyền sử dụng chỉ thị hình thái hoặc kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh, tếbào (Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs (2000, 2003, 2004) [12], [13], [14]; Nguyễn XuânViết và cs (2002, 2006, 2007) [28], [29], [30]) Trên thế giới, chỉ thị hình thái được

sử dụng kết hợp với chỉ thị sinh hóa và các chỉ thị khác đã thành công trong việcđánh giá đa dạng di truyền, phân loại khoai môn sọ trồng [47], [63] và đặc biệttrong xây dựng bộ sưu tập hạt nhân khoai môn sọ địa phương, quốc gia và khu vựccho mục đích bảo tồn và sử dụng hiệu quả nguồn gen [65], [85], [99]

1.2.3.2 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị hóa sinh học

Các chỉ thị hóa sinh đa hình như isozyme và các protein dự trữ được phântích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid để phát hiện cácbiến dị khác nhau của phân tử enzyme Các biến dị này có thể cung cấp thông tinnhư một loại chỉ thị đồng trội Các phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặtkinh tế và kỹ thuật đơn giản hơn phương pháp phân tích ADN Tuy nhiên, isozyme

là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giaiđoạn nhất định trong quá trình phát triển cá thể Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phảnánh chính xác một phần bản chất di truyền

Ở loài khoai môn sọ (C esculenta), bằng phương pháp điện di isozyme,

Hirai và cs (1989) đã phát hiện các biến dị đối với hệ isozyme esterase vàperoxidase trong các giống khoai sọ Nhật Bản và đã kết luận rằng có thể sử dụngbiến dị điện di của 2 hệ enzym này để phân loại các giống khoai môn sọ [44] Lebot

và cs (1992) khi nghiên cứu biến dị điện di đối với 7 hệ enzyme (MDH, IDH, PGI,6-PGD, ME, SKDH và ADH) trong 1417 giống khoai môn trồng và mọc dại ở châu

Á và Thái Bình Dương, đã phát hiện được 143 kiểu hình isozyme, kết quả này chothấy biến dị isozyme đối với các giống khoai môn sọ ở hai vùng này là rất cao.Đồng thời cũng cho rằng không có mối tương quan nào giữa kiểu hình điện diisozyme và kiểu hình thái hay mức bội nhiễm sắc thể [63] Nguyen và cs (1998) đã

sử dụng đa hình enzyme esterase để phân tích mối quan hệ phát sinh trong 69 mẫu

giống khoai môn sọ (C esculenta), và 15 mẫu giống thuộc một số loài có quan hệ gần gũi với khoai môn sọ (C gigantea, Xanthosoma sagittifolium, Xanthosoma violaceum, Alocasia odora và Alocasia macrozzhiza) [80] Kết quả phân tích cho thấy, dọc mùng (C gigantea) có quan hệ gần với các loài ráy hơn với khoai môn sọ

và vùng Yunnan có thể là vùng quan trọng trong sự mở rộng tiến hóa ở loài khoaimôn sọ Phân tích di truyền các biến dị isozyme của 13 hệ enzyme (ADH, EST,LAP, PGM, ACP, DIA, GQT, HEX, IDH, PGD, PGI, SKDH và SOD của Nguyen

và cs (1998, 1999) [79], [81], các tác giả đã phát hiện 21 locus gen chi phối và cungcấp nhiều chỉ thị di truyền có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn

giống ở loài khoai môn sọ Lebot và cs (2010) [66] đã đánh giá đa dạng di truyềnkhoai môn sọ ở Châu Á – Thái Bình Dương dựa trên các dữ liệu phân tích isozyme

và các đặc điểm hình thái - nông học Tổng số 2.298 mẫu giống khoai môn sọ thuthập ở các nước Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippines, Papua NewGuinea và Vanuatu đã được miêu tả dựa trên 23 đặc điểm hình thái 2081 mẫugiống được lựa chọn phân tích isozyme sử dụng 6 hệ enzyme (MDH, PGI, ICD,PGD, ME và SKDH) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự đa dạng hình thái làkhá cao trong vùng, mức độ đa dạng di truyền khác nhau rất nhiều giữa các nước,các vùng Nguyên nhân của sự khác biệt này bắt nguồn từ sự khác biệt di truyềngiữa các quần thể khoai môn hoang dại do sự cô lập về mặt địa lý giữa Đông Nam

Á và Melanesia Hai vốn gen khoai môn sọ khác biệt đại diện cho kết quả của haiquá trình thuần hóa khác nhau Ở Melanesia, khoai môn sọ là mùa vụ chính và cácgiống khoai môn sọ đã được cải tiến nhằm thỏa mãn nhu cầu đa dạng của người sửdụng Hầu hết các giống khoai môn sọ trồng ở vùng này được chọn lọc trong môitrường không có các tác nhân gây bệnh Còn các giống khoai môn sọ ở châu Á ítđược cải tiến hơn, nhưng các dòng gen thường xuyên được trao đổi Ở vùng này,hầu hết các giống khoai môn sọ trồng đã cùng tiến hóa với nguồn gây bệnh nguy hại

nhất của chúng: Phytophthora colocasiae Có lẽ đó cũng là nguyên nhân lí giải cho

khả năng kháng bệnh bạc lá thấp của các giống khoai môn sọ ở Melanesia và cácnước thuộc quần đảo Thái Bình Dương [66] Phân tích đa dạng di truyền 677 mẫugiống khoai môn sọ thu thập ở 7 vùng khác nhau của Indonesia sử dụng 6 hệenzyme (MDH, PGI, ME, PGD, IDH VÀ SH), Prana và cs (2010) [89] đã chỉ rarằng các kiểu hình điện di enzyme khác nhau được tìm thấy ở các cây khoai môn sọtrồng thuộc các vùng sinh thái khác nhau Điều đáng ngạc nhiên là có đến 17,43%kiểu enzyme xuất hiện trong bộ sưu tập chỉ phát hiện ở một mẫu giống Trên quanđiểm bảo tồn, kết quả này chỉ ra sự mong manh việc lưu giữ vì mẫu giống quan tâm

có thể mất đi bất cứ khi nào Sự đa dạng di truyền cao quan sát thấy ở các mẫugiống có nguồn gốc từ 3 vùng: Tây Java, Nam Sulawesi và Lampung của NamSumatra Nghiên cứu cũng cho thấy, không có mối tương quan giữa kiểu hình điện

di enzyme và kiểu hình thái Phát hiện này cũng được Lebot và cs (1992) đưa ra khinghiên cứu đa dạng di truyền khoai môn sọ ở châu Á – Thái Bình Dương [63].Manzano và cs (2010) [72] nghiên cứu sự đa dạng hình thái – hóa sinh của 42 giốngkhoai thu thập ở Cuba dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và phân tíchenzyme peroxydase và esterase trong dịch chiết mô lá của khoai môn sọ 28 đặcđiểm hình thái – nông học (gồm 12 đặc điểm của củ và 16 đặc điểm của lá) đã được

sử dụng là những đặc điểm quan trọng nhất cho đánh giá hình thái – nông học cácgiống khoai này Trong đó, 13 đặc điểm được đề xuất là có thể sử dụng cho việcxây dựng bộ sưu tập hạt nhân ở Cuba Tổng số 27 alen đa hình được phát hiện ở 12locus của 2 hệ ezyme peroxydase và esterase, phát hiện 20 alen trong đó là alenhiếm (ở hệ enzyme esterase) Số alen trung bình/locus là 2,25 Từ kết quả phân tíchhình thái và enzyme, tác giả đã cho rằng, sự tiến hóa của khoai môn sọ ở Cuba cónguồn gốc từ khoai môn sọ ở châu Phi và Nhật Bản cũng như từ Trung tâm củanguồn gốc khoai môn sọ ở Ấn Độ và Philippines [72] Nghiên cứu đa dạng ditruyền khoai môn sọ ở Yunnan, Trung Quốc dựa trên các phân tích về thực vật họcdân tộc, đa hình isozyme và RAPD, Xixiang và cs (2010) [109] đã phát hiện thấymức độ khác nhau về đa dạng di truyền của các giống khoai môn sọ ở các địaphương và các dân tộc

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Viết đã có nhiều nghiên cứu phân tích đa hìnhđiện di isozyme để đánh giá đa dạng di truyền khoai môn sọ, mối liên quan giữa đadạng di truyền khoai môn sọ và vùng địa lý sinh thái; kết hợp giữa phân tíchisozyme và đặc điểm hình thái để phân loại khoai môn sọ, các loài gần với khoai

môn sọ; xác định sự tiến hóa trong chi Colocasia, phát hiện loài lai trong tự nhiên…

[4], [26], [29], [30] Nguyễn Thị Ngọc Huệ và cs (2004) đã sử dụng kỹ thuật điện ditrên 6 hệ enzyme: MDH, PGI, ICD, PGD, ME và SKDH với dịch chiết từ lá của câymôn sọ để khảo sát sự biến động di truyền của tập đoàn môn sọ Kết quả tập hợpnhóm trên cơ sở của biến động enzyme cho thấy trong tập đoàn 201 mẫu giống tồntại 74 zymotypes Trong số đó có 39 zymotypes đặc trưng chỉ có ở Việt Nam Biểu

đồ minh họa chỉ số tương đồng của các mẫu giống khoai sọ cho thấy Việt nam có 2

kiểu nhóm gen khoai môn sọ rõ rệt Một nhóm mang các kiểu gen của miền núi phíaBắc tương tự như các giống của Vân Nam Trung Quốc Nhóm kia bao gồm các kiểugen đặc trưng của vùng Đông Nam Á Nghiên cứu sự phân bố của các zymotypes tạicác vùng sinh thái của Việt Nam cho thấy các tỉnh ở miền núi phía Bắc có sự đadạng di truyền cao hơn các vùng khác Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn môn

sọ theo vùng địa lý cũng đã được nghiên cứu Kết quả đánh giá dựa vào giá trị chỉ số

đa dạng Shanon - Weaver (H’) cho thấy có sự biến động khá rõ nét tại các vùng sinhthái về các đặc điểm hình thái nông học Kết quả đánh giá dựa trên kết quả giá trịchỉ số Shanon - Weaver cũng trùng với kết quả phân tích thống kê NTSYS và phântích isozyme cho phép kết luận Vùng Đông Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Bắc là 3

vùng có sự đa dạng nhất nguồn gen môn sọ (C esculenta) ở Việt Nam Các vùng

này có thể chọn để xây dựng các điểm bảo tồn tại chỗ cho nguồn gen môn sọ ở nước

ta Vùng có nhiều nguồn gen quí như Đông Bắc và Trung du có thể xây dựng thànhvùng sản xuất hàng hoá để phát triển nông nghiệp và nông thôn bền vững, góp phầnxoá đói giảm nghèo và đảm bảo an ninh lương thực cho đồng bào vùng cao [14]

1.2.3.3 Phân tích đa dạng di truyền khoai môn sọ sử dụng chỉ thị phân tử ADN

* Một số chỉ thị ADN thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật

Chỉ thị phân tử ADN gồm nhiều loại khác nhau Trong thời gian đầu chủ yếu

là RFLP, dựa trên cơ sở mẫu giống dò đặc hiệu Sau khi phát minh ra PCR, người ta

đã phát triển tiếp các chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD, AFLP, SSR …

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt ADN hệgen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn ADN có độ dài xác định, sốlượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Đa hình độ dàinày được phát hiện sử dụng các mẫu giống dò ADN (probe) RFLP là chỉ thị đồngtrội, có độ tin cậy cao, được sử dụng nhiều trong phân tích liên kết và chọn giốngthực vật, phát hiện tính biến dị của ADN trong các giai đoạn phát triển, mối quan hệ

di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng Tuy vậy, RFLP đòi hỏi kỹ thuật phức tạp,tốn kém, mất thời gian và cần một lượng ADN lớn (50 – 200 ng từ mỗi cá thể) [24]

Kỹ thuật RAPD phân tích sự đa hình các phân đoạn ADN được nhân bảnngẫu nhiên, do hai nhóm Williams và CS phát minh năm 1990, Welsh và McClelland hoàn thiện năm 1991 Kỹ thuật này được phát hiện dựa trên phản ứngchuỗi polymerase (PCR) sử dụng mồi ngẫu nhiên nhằm nhân các đoạn ADN đặctrưng Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên ngắn, quátrình nhân bản ADN là ngẫu nhiên nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trênphân tử ADN khuôn là rất lớn Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sửdụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xác định tính đa dạng sinh học vàquan hệ họ hàng của các giống thực vật, động vật khác nhau trong các loài [24],[52], [61]… Hạn chế chủ yếu của kỹ thuật RAPD là độ đặc hiệu không cao, kết quảphân tích không ổn định Do đó, phân tích di truyền để đảm bảo kết quả có độ chínhxác cao, cần sử dụng kết hợp kỹ thuật RAPD với các kỹ thuật khác [24], [93], [99].

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR AFLP phát hiện mộtcách có chọn lọc các đoạn ADN hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn vớiđoạn tiếp hợp (adaptor) AFLP hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tự như RAPD,tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15

bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2 - 4 bp.AFLP rất có hiệu quả trong xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ Hiện nay,phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cócao hơn so với phương pháp RAPD và việc thiết kế mồi phức tạp nhưng AFLP có

ưu điểm là thời gian cho kết quả nhanh, đòi hỏi lượng ADN ít, cho đa hình cao [24]

Kỹ thuật SSR được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên lý củaPCR Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân thực tồn tại nhiều trình tự 2 - 6nucleotide lặp lại nhiều lần Các trình tự lặp mang tính đặc trưng loài và phân bố rảirác trong hệ gen của thực vật bậc cao Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảothủ ở hai đầu của đoạn SSR Do đó các phân đoạn ADN được nhân sẽ có độ dàingắn khác nhau (đa hình độ dài SSR) Các trình tự lặp lại thường tập trung ở vùng

dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể, có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, gópphần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào SSR là công

cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội

có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao Trong thực tế chỉ thị này đã được sửdụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, xác định giới tính, phântích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…[24], [45] Tuy vậy, sự phức tạp trong thiết

kế mồi đặc hiệu cho mỗi locus do phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớncác đoạn ADN bộ gen chứa SSR đã hạn chế số lượng các mồi được phát triển đốivới nhiều loài

* Ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong các nghiên cứu trên khoai môn sọ

Đã có nhiều báo cáo nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn sọ

sử dụng các chỉ thị phân tử ADN khác nhau như RAPD [52], [61], [73], [84], [96],[98], [101]; AFLP [37], [65], [90]; SSR [48], [70], [71], [82], [93], [99]

Chỉ thị RAPD được Irwin và cs sử dụng đầu tiên trên đối tượng khoai môn

sọ vào năm 1998 (Irwin, 1998) Sau đó là các nghiên cứu của Ochiai và cs (2001),Lakhanpaul và cs (2003)… Các nghiên cứu đã cho thấy sự đa dạng di truyền caocủa khoai môn sọ ở các vùng nghiên cứu [52], [61], [73], [96], [98], [101], [84] Chỉthị RAPD không chỉ hữu ích trong nghiên cứu đa dạng trong loài khoai môn sọ màcòn là một chỉ thị hữu ích cho phân biệt các dạng khoai môn sọ lưỡng bội và tambội từ các kiểu băng điện di nhân bản đặc trưng [52], [73], [84]; nhận dạng cácgiống khoai môn sọ nhờ các băng ADN đặc trưng được nhân lên từ các mẫu giống[52], [84], [96], [101]; nhận dạng phân tử các loài có quan hệ gần với khoai môn sọ

như các loài khoai mùng (Xanthosoma) và loài dọc mùng (C gigantea) [52] hay phân biệt giữa khoai môn sọ (C esculenta) với một số loài khoai mùng (Xanthosoma), dọc mùng (C gigantea) và ráy (Alocasia) [84] Các nghiên cứu đều

cho thấy loài dọc mùng có quan hệ về mặt di truyền gần gũi với khoai môn sọ hơn

với Alocasia hay Xanthosoma và được phân biệt rõ ràng với khoai môn sọ trong sơ

đồ hình cây xây dựng từ số liệu RAPD Kết quả phân tích đa dạng di truyền khoaimôn sọ sử dụng chỉ thị RAPD còn cho thấy mối quan hệ giữa sự phân nhóm khoaimôn sọ và áp lực chọn lọc của cộng đồng dân cư qua quá trình thuần hóa và canhtác (Maolin và cs, 2010) [73]