Báo cáo nhóm 4: khung sườn FUSIDANES

MỞ ĐẦU Terpen đóng một vai trò quan trọng trong nền công nghiệp cũng như nền y học ngày nay, chúng được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm như nước hoa, hương vị cho thực phẩm, gia vị, các hợp chất tạo môi trường thân thiện để bẫy côn trùng, mô phỏng các kích thích tố đặc trưng của côn trùng, terpen cũng được sử dụng như những loại thuốc để điều trị nhiều bệnh khác nhau trong đó có các khối u. Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng làm nền tảng cho tổng hợp hữu cơ, sửa đổi một vài thành phần trong cấu trúc để đạt được một số tính chất mong muốn sử dụng trong công nghiệp cũng như dược phẩm, tạo nên sự phong phú, đa dạng các dẫn xuất của terpen nói chung cũng như của triterpen nói riêng. Hiện nay, có hơn 30 loại khung sườn triterpen cơ bản được biết đến nhưng vấn đề khai thác và ứng dụng chúng chưa được phổ biến rộng rãi, số các công trình nghiên cứu, các bài báo nói về chúng chưa thật sự đầy đủ và đa dạng cần được đưa vào một quá trình nghiên cứu lâu dài và có hệ thống. Vì vậy, việc nỗ lực không ngừng để đi đến những bước phát triển mới trong nghiên cứu về các hợp chất của triterpen là vô cùng cần thiết cả trong thực tại và tương lai. Trong bài báo cáo này gồm có bốn phần: I.TỔNG QUAN VỀ TERPENOID II.TRITERPENOID III. TETRACYLIC TRITERPENOID: FUSIDANES IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong đó, phần trọng tâm là mục II, III xoay quanh việc tìm hiểu về triterpen và dẫn xuất của chúng trong việc cô lập, ứng dụng các hoạt tính đặc trưng.

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÁO CÁO TRITERPENOID: KHUNG SƯỜN FUSIDANES

GVHD: Cô Tôn Nữ Liên Hương

SVTH:

Nguyễn Thị Thùy Dung 2112006

Lê Thị Xuân Lộc 2112045

Terpen đóng một vai trò quan trọng trong nền công nghiệp cũng như nền y học ngày nay, chúng được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm như nước hoa, hương vị cho thực phẩm, gia vị, các hợp chất tạo môi trường thân thiện để bẫy côn trùng, mô phỏng các kích thích tố đặc trưng của côn trùng, terpen cũng được sử dụng như những loại thuốc để điều trị nhiều bệnh khác nhau trong đó có các khối u

Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng làm nền tảng cho tổng hợp hữu cơ, sửa đổi một vài thành phần trong cấu trúc để đạt được một số tính chất mong muốn sử dụng trong công nghiệp cũng như dược phẩm, tạo nên sự phong phú, đa dạng các dẫn xuất của terpen nói chung cũng như của triterpen nói riêng

Hiện nay, có hơn 30 loại khung sườn triterpen cơ bản được biết đến nhưng vấn

đề khai thác và ứng dụng chúng chưa được phổ biến rộng rãi, số các công trình nghiên cứu, các bài báo nói về chúng chưa thật sự đầy đủ và đa dạng cần được đưa vào một quá trình nghiên cứu lâu dài và có hệ thống Vì vậy, việc nỗ lực không ngừng để đi đến những bước phát triển mới trong nghiên cứu về các hợp chất của triterpen là vô cùng cần thiết cả trong thực tại và tương lai

Trong bài báo cáo này gồm có bốn phần:

I.TỔNG QUAN VỀ TERPENOID II.TRITERPENOID

III TETRACYLIC TRITERPENOID: FUSIDANES

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong đó, phần trọng tâm là mục II, III xoay quanh việc tìm hiểu về triterpen và dẫn xuất của chúng trong việc cô lập, ứng dụng các hoạt tính đặc trưng

Bài viết của chúng em chắc rằng sẽ còn nhiều thiếu sót cũng như các nội dung được dịch từ các bài báo khoa học bằng tiếng anh chưa sát với ý nghĩa thật sự mà tác giả muốn nói, mong cô góp ý sữa chữa để bài viết của chúng em được hoàn thiện hơn

Nhóm báo cáo

I TỔNG QUAN VỀ TERPENOID 1

1 Giới thiệu về Terpenoid 1

2 Cấu trúc của terpen 1

3 Phân loại terpenoid: 2

4 Sinh tổng hợp terpenoid 2

II- TRITERPENOID 4

1.Phân loại 4

a Triterpenoid không vòng: 4

b Triterpenoid 4 vòng: 4

c Triterpenoid 5 vòng: 4

2 Sinh tổng hợp triterpenoid: 4

3 Chiết xuất triterpenoid 6

III- TETRACYLIC TRITERPENOID: FUSIDANES 7

1 Sinh tổng hợp 7

2 Sau đây là 2 dẫn xuất có chứa khung sườn Fusidanes 9

a Dẫn xuất của fusidic acid: 16-deacetoxy-7-β-hydroxy-fusidic acid (1) 9

b Helvolic acid 13

IV.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

TERPEN: TRITERPENOID

I TỔNG QUAN VỀ TERPENOID

1 Giới thiệu về Terpenoid

Trong thiên nhiên, terpenoid có mặt ở khắp nơi chủ yếu có trong các loài thực vât Chúng có vai trò quan trọng đối với cơ chế bảo vệ cũng như trong việc sinh sản của nhiều loại cây, vì phát ra mùi hương để dẫn dụ côn trùng thụ phấn

Các terpenoid tham gia vào những quá trình trao đổi chất như các vitamin, tác nhân điều tiết và bảo vệ như những chất kháng oxy hóa Con người sử dụng terpenoid dưới dạng các dịch chiết từ hoa, quả và các bộ phận khác của cây, chúng được biết đến như tinh dầu, chất thơm của thực vật

Vào năm 1818 người ta đã tìm được một số hợp chất ở tinh dầu và xác định

được rằng tỉ lệ nguyên tử C:H là 5:8 Tiếp theo đó là một số hợp chất hidrocarbon không no, không vòng hoặc có vòng cũng được tách ra Chúng có công chung: (C5H8),

(n≥2) và được đặt tên là Terpen Terpen và terpenoid gọi chung là terpen, đôi khi còn

gọi là isoprenoid để nhấn mạnh rằng nó gồm các mắt xích có khung carbon giống với isoprene

Terpenoid là các dẫn xuất chứa Oxi của terpen như: ancol, andehit, xeton, este, cacboxylic, peoxit terpen cũng được tách ra từ tinh dầu.Chúng thường có mùi thơm hấp dẫn hơn các hydrocarbon terpen

Terpenoid có nhiều trong tinh dầu thảo mộc như tinh dầu thông, sả, quế, chanh, cam, hoa hồng, cây linh sam, bạc hà, cây long não, và các dẫn xuất của chúng (các terpenoid) được dùng làm hương liệu, sản xuất thuốc chữa bệnh, dầu bôi trơn, chất tuyển nổi, thuốc trừ sâu, vv…

2 Cấu trúc của terpen

Terpenoid là nhóm các hợp chất tự nhiên mà phân tử là dẫn xuất oligopolyme (trùng hợp nhiều lần của Isopren CH2=CH(CH3)-CH=CH2, và có chung một nguồn gốc sinh tổng hợp từ acid mevalonic

Acid mevalonic

1

3 Phân loại terpenoid

Có 2 hướng phân loại:

Dựa theo mạch carbon để phân loại có:

 Terpenoid mạch hở: Geraniol có trong tinh dầu hoa hồng Xitronelol

có trong tinh dầu xả Các hợp chất này đều có mùi thơm đặc trưng, là những đơn hương quý dùng trong công nghiệp hương liệu và thực phẩm,

 Terpenoid mạch vòng: Mentol và menton (có trong tinh dầu bạc hà) không những được đưa vào kẹo bánh, kem đánh răng, mà còn dùng để điều chế thuốc chữa bệnh

Dựa vào số mắc xích isopren để phân loại terpenoid:

Loại

terpenoid

Khung carbon

Số lượng

Hemiterpene (Iso-C5) 5 IPP, DMAPP

Monoterpen (Iso-C5)2 10 C10H16, C10H18O,C10H16O

Secquiterpen (Iso-C5)3 15 C15H24, C15H24O,C15H22O

Điterpen (Iso-C5)4 20 C20H32, C20H32O, C20H30O

Triterpen (Iso-C5)6 30 C30H50, C30H50O

Tetraterpen (Iso-C5)8 40 C40H56

Polyterpen (Iso-C5)n 5n Cao su

4 Sinh tổng hợp terpenoid

Phần isopropyl được xác định là đầu, phần etyl còn lại được coi như đuôi Trong các mono-, sesqui-, di-, sesterterpens các đơn vị isopren liên kết với nhau từ đầu đến đuôi, tri- và tetraterpenes chứa liên kết đuôi-đuôi (carbon thứ 4 liên kết với carbon thứ 4) Sinh tổng hợp các terpenoid được tóm tắt trong sơ đồ sau:

3

II- TRITERPENOID

Triterpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật, thực vật chúng tồn tại dưới dạng tự nhiên như các ester hoặc các glycoside Có hơn 5000 triterpen được ghi chép trong các tài liệu, hầu hết trong số này có nguồn gốc từ squalene, với hai đơn vị liên kết farnesane

bằng liên kết đuôi-đuôi

1.Phân loại

a Triterpenoid không vòng:

Squalen (cấu hình trans hexaen), Ambrein

Squalen lần đầu tiên được tìm thấy trong gan cá mập Squalus, ngoài ra còn tìm thấy trong một số loại nấm , dầu olive

b Triterpenoid 4 vòng:

Thuộc loại squalenoxide (mọi vòng 6C đều ở cấu hình trans với nhau): Lanosterol, Protosterol, Agnosterol,…

c Triterpenoid 5 vòng:

Được chia làm 3 nhóm dựa trên quan hệ đã được xác định với một trong 3 chất tiêu chuẩn là  -Amyrin, - Amyrin và Lupeol Triterpen 5 vòng có tính acid phổ biến hơn trong thực vật

2 Sinh tổng hợp triterpenoid:

 Triterpenoid được tổng hợp với chất liệu cơ bản là Pharnesyl pyrophosphate

 Giai đoạn đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp là do enzyme monoxygenase oxi hóa hợp chất squalen tạo thành 2,3-expoxysqualen, tiếp theo là sự đóng vòng Tùy theo việc các phân tử squalen gấp khúc, xếp nếp, với cấu hình trong không gian theo kiểu dạng ghế hoặc dạng tàu mà sau khi đóng vòng, sẽ tạo ra sản phẩm có hình dạng khác nhau Khi phân tử squalen gấp khúc để bố trí các vòng ABCD theo kiểu ghế-tàu-ghế-tàu sẽ tạo cycloartenol, từ đó có thể biến đổi thành Phytosterol

và các dẫn xuất steroid Còn khi phân tử squalen gấp khúc các vòng ABCD theo kiểu ghế-ghế-tàu-tàu sẽ tạo triterpenoid 5 vòng

Squalen

 Cơ chế oxidosqualen:

5

4 Chiết xuất triterpenoid

Nguyên lý chung: Chiết trong nước nóng (trực tiếp hoặc bằng bộ soxhlet) chiết

bằng EtOH 30-80%, chiết bằng Dicloromethan để loại tạp sau đó chiết bằng MeOH, cao chiết được chiết lại trong hệ dung môi n-Butanol:H2O

Thiết bị bộ soxhlet dùng để chiết:

Trang thiết bị của kỹ thuật chiết này có

2 loại là:

1 Các hệ chiết Soxhlet thường và đơn

giản, vận hành bằng tay

2 Các hệ chiết Soxhlet tự động

(Auto-Soxhlet) vận hành tự động

Kỹ thuật chiết này thường sử dụng để

chiết tách các chất hữu cơ nằm trong

mẫu ở dạng rắn, dạng bột, mảnh nhỏ,

hay các vật liệu mẫu khô

III- TETRACYLIC TRITERPENOID: FUSIDANES

1 Sinh tổng hợp

Protonated 2,3-epoxysqualene là tiền thân sinh tổng hợp của polycylic triterpenoid như: protostanes và dammaranes Sự khởi điểm của cation protostane và dammarane bắt đầu từ sự khác nhau giữa hai cấu trạng của ion carbenium, phát sinh trong quá trình

mở vòng epoxy của protonated 2,3-epoxysqualene

7

Sự tạo vòng của Protonated 2,3-epoxysqualene dẫn tới hiện tượng đồng phân lập thể của protostane và dammarane với khung sườn gonane 4 vòng của steroid qua hình dưới đây:

29-Norprotostanes gọi là fusidanes

Quy ước cách đánh số theo khung sườn 4 vòng của steroid

2 Sau đây là 2 dẫn xuất có chứa khung sườn Fusidanes

a Dẫn xuất của fusidic acid: 16-deacetoxy-7-β-hydroxy-fusidic acid (1)

CTPT: C 29 H 46 O 5

Tính chất vật lý:

 Là chất bột màu trắng

 Những thông số vật lý được tìm thấy trong bảng sau:

16-deacetoxy-7-β-hydroxy-fusidic acid (1) được phân lập từ sự lên men của

một loại nấm rừng mưa nhiệt đới Acremonium crotocinigenum.

Ứng dụng: (1) được sử dụng như một loại thuốc kháng sinh chống tụ cầu

khuẩn (đặc biệt tụ cầu vàng), khi (1) xâm nhập vào trong bào tương của vi khuẩn thì phát huy tác động bằng cách ức chế tổng hợp protein Hoạt tính này được coi là kìm khuẩn, nhưng cũng được coi là diệt khuẩn khi ở nồng độ cao

Phương pháp cô lập: lên men lỏng kết hợp với bioautography ( một phương

pháp sàng lọc kiểm tra vi sinh để phát hiện các hoạt động kháng khuẩn), tạo điều kiện cho sự cô lập của hợp chất (1) bằng sắc ký lỏng chân không

Cô lập:

 Nhựa thô HP20 chiết xuất từ dịch lọc nuôi cấy được hòa tan trong methanol (5ml) kết hợp với một khối lượng tương đương của Silicagel (flash chromatography grade; BDH;1.6 g) sau đó để bay hơi tạo nên một lớp bùn, lớp bùn này được đựng trong hộp trước khi ráp cột Biotage silicagel đường kính cột 40mm

 Cột được tách rửa với pha động sau đây: Me: methanol, D: diclometan

 100% D (100 ml),

 2:98 Me :D (200 ml),

 4:96 Me :D (200 ml),

 6:94 Me :D (200 ml),

 8:92 Me :D (200 ml),

 10:90 Me :D (200 ml)

9

Staphylococcus aureus (MRSA)

Tụ cầu khuẩn Acremonium crotocinigenum.

 Nếu không có phần nào chứa hợp chất đích mà có sự tương quan với vùng ức chế trong phân tích bioautographical thì tiếp tục rửa giải với 20:80 Me:D thu tiếp mỗi phần 30ml

 Kết hợp sắc ký bản mỏng cho thấy hợp chất mục tiêu có mặt trong phân đoạn từ 7-18 Những phần đó được kết hợp, bốc hơi đến khô và tái hòa tan trong ethyl acetate:n-hexane (2ml) với tỉ lệ 9:1

 Tiếp theo lên cột Biotage với đường kính 10mm, sử dụng tỉ

lệ 09:01 ethyl acetate : n-hexane làm pha động, hứng mỗi phần rửa giải 7ml Hợp chất đích được chứa trong phân đoạn 5-15, tiếp tục kết hợp làm khô rồi hòa tan lại trong 8:92 Me:D Tiếp tục lên cột Biotage đường kính 10mm, với pha động tương tự Mỗi phần được hứng 3ml, SKLM cho thấy hợp chất đích hiện diện trong phân đoạn 12-32 Những phần này được kết hợp và trọng lượng khô của hợp chất tinh khiết được xác định

Phổ của 16-deacetoxy-7-β-hydroxy-fusidic acid (1)

 Tín hiệu trong 1H và 13C NMR (Bảng 1) cho năm mũi đơn methyl, 1 mũi đôi

 Trong phổ COSY, H-5 ( H=2,31m) cùng với cả 2 proton của methylen ( C - 6 ,

 H 1,45 , 1,67 ) ,nó ghép cặp với một proton được giảm chắn oxymethine proton ( C -7 ,  H 3.00 , t) Phổ HMBC cho thấy C liên quan với proton giảm chắn ghép cặp với các proton của một mũi methine đơn, nhọn ( C - 30 ) , cho thấy có thêm sự ghép cặp với một carbon methine ( C -9 ) và hai C b4 ( C -8 ,  C 45,6 và C-14 ,  C 49,6 ) Điều này hoàn thành sự cộng hưởng cho các vòng A và B của hợp chất (1)

 Kiểm tra COSY cho thấy proton kết hợp với C -9 (H -9 ) tạo thành một phần trong hệ thống spin CH-CH-CH2-CH cho phép xác định rõ vị trí C -9 , C-11 , C-12 và

C -13 C -11 được giảm chắn ( C 68,7 ,  H 4.37) chỉ ra rằng O nên được đặt ở đây Hơn nữa, H -13 (HMQC) cũng được giảm chắn ( H 3.05 ) có tính chất của allyl và

đó là một C có nối đôi ( C -17 ) nên được đặt ở vị trí carbon bên cạnh, điều này là điển hình cho chất chuyển hóa fusidic acid (Rastup - Andersen và Duvold , 2002) )

 Các proton ( C-18 ) ghép cặp với C -13 (3J ) , C-14 (2J ) và một carbon metylen ( C-15 ,3J ) CH 2 – 15 ghép cặp với một nhóm methylene bị giảm chắn bởi nhóm allyl (

 H 2.68 , 2.86 (CH 2-16 ), 1C nữa bị ảnh hưởng do ở vị trí alpha so với carbon có mang nối đôi (C-17  C 160,4 ) Điều này hoàn thành phổ của vòng C và D của hợp chất (1)

 H -13 và H2 -16 cả hai đều cho sự ghép 2J với C -17 và ghép 3J với C – 20, đề xuất ra một liên kết đôi giữa C – 17 và C -20 Trong phổ HMBC C-17 cũng được ghép cặp với các proton của một methylen allyl (C-22,  H 2,44) đó cũng là carbon được ghép cặp với carbon carbonyl của acid cacboxylic (C-21) và một carbon methine có nối đôi (C-24, C 124,0) ) 1 CH2 ở xa hơn (C-23) có thể được đặt giữa C-22 và C-24 bởi sự ghép cặp được quan sát trên phổ COSY Cuối cùng, hai nhóm methyl sinh đôi

có thể được đặt trên một carbon olefin (C-25) thông qua mối tương quan về phổ HMBC của chúng với carbon này và với carbon liên kết với nó C-24 hoàn thành liên kết đôi giữa C-24 và C-25 Những sự cộng hưởng hoàn thành chuỗi tám carbon của khung triterpene Fusidane

 HRESI-MS của hợp chất (1) đề nghị một công thức phân tử của C29H46O5 [M]+

(475,3422) Từ giá trị độ dịch chuyển hóa học của H-3, H-7 và H-11, các nhóm hydroxyl phải được đặt tại các vị trí này Từ công thức phân tử và độ dịch chuyển hóa học của carbon C-21, nhóm axit cacboxylic phải được đặt ở C-21 và điều này giống hệt những gì thấy trong axit fusidic (xem hình)

 Việc xem xét cuối cùng là hóa lập thể của nhóm hydroxyl ở 3 , C -7 và

C-11 Các H tại C-3 và C-C-11 được giả định ở vị trí xích đạo ( rel β) trên cơ sở không) trên cơ sở không thấy rõ sự ghép cặp của các tín hiệu này ,điều đó sẽ làm cho OH tại các vị trí này phải

là cả alpha và trục

11

 Hằng số ghép của H -7 ( 3.99 ,t) là 8,0 Hz cho thấy một sự tương tác trục-trục với carbon liê kết với nó CH2 - 6 ở vị trí trục Điều này sẽ làm cho H -7 ở vị trí trục (α) và OH tại vị trí này là xích đạo (β) H -7 và CH) và OH tại vị trí này là xích đạo (β) trên cơ sở không) H -7 và CH3 - 30 cùng nằm trên mặt alpha của khung fusidane

 Fusidic acid và tất cả các chất tương tự được biết đến cho đến nay không có nhóm thế ở carbon số 7 Hợp chất (1) là hợp chất đầu tiên trong nhóm này

 Crotocinigenum cũng đã được dùng để sản xuất những chất tương tự với một nhóm OH trên C- 16 và hợp chất (1) là thành viên đầu tiên hoàn toàn mất nhóm thế ở

vị trí C -16

 (1) đã được thử nghiệm hoạt tính như một nhóm thuốc kháng khuẩn và sở hữu nồng độ nhỏ chất ức chế 16 lg / ml , mặc dù đôi khi hoạt động hơn erythromycin và norfloxacin , nhưng nếu so với các axit fusidic là yếu hơn đáng kể

b Helvolic acid

CTPT: C 32 H 44 O 8

Tên IUPAC: (-)-6β) trên cơ sở không,16β) trên cơ sở không-diacetoxy-3,7-dioxofusida-1,17(20)-Z,24-dien-21-oic

acid

Tính chất vật lý:

 Acid helvolic là tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy là

2120C, dễ dàng hòa tan trong dung môi hữu cơ, ngoại trừ dầu, nhẹ nhưng không tan trong nước

 Đây là loại kháng sinh chất chuyển hóa và là tác nhân gây bệnh thối bẹ ở lúa

Tính chất hóa học:

 Phản ứng với brom: acid helvolic có tính chất của nối đôi

bất bão hòa, làm mất màu nước brom và permanganat trong trong điều kiện nhiệt độ thấp và phản ứng dễ dàng với ozon Khi acid được xử lý trong điều kiện lạnh với brom

dư trong acid acetic băng, bốn nguyên tử brom phản ứng với 1 phân tử acid, nhưng lượng brom của sản phẩm thấp cho thấy phản ứng chính là phản ứng oxy hóa

 Quá trình oxy hóa với hydrogen peroxide Acid helvolic bị

oxy hóa dễ dàng và thuận lợi bởi hydrogen peroxide (perhydrol) hoặc bởi acid periodic, cùng với hợp chất trung tính, m.p 229-2300C, các thuộc tính đó phù hợp với công thức C32H46O11

Một lời giải thích hợp lý là những kết quả của những hợp chất này từ sự hình thành của 1 diglycol tại 2 liên kết đôi, tiếp theo là mất nước để tạo thành 1 vòng lacton

C32H42-44O8  C32H46-48O12   H 2O C32H44-46O11

 Quá trình oxy hóa với chì tetraacetat : xác định sự có mặt

của 2 liên kết đôi trong phân tử bằng phản ứng làm mất màu kali permanganate ở nhiệt

độ thấp Tác dụng với chì tetraacetat, thu được 1 tinh thể trung tính; điểm nóng chảy trên 2000 C, qua những phân tích với sự nhiễu xạ tia X xác định được công thức sản phẩm là C32H44O11

 Tác dụng với một vài tác nhân khác:

Axit Helvolic và methyl este của nó phản ứng dễ dàng với ozone cho ra 1 sản phẩm trung tính

13

1

3 5 7

9

11 13 17

15 2

4

10

6

8

12

14 16

H

28

19

30

18

20 21 22

23 24

25 26 27

O

O