CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC —– Công nghệ proteins enzyme Chuyên đề 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN GVHD: TS. Đặng Xuân Nghiêm Sinh viên thực hiện: Triệu Thị Linh Mã SV: 550362 Hà nội, 42013 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN 1. Khái Niệm 1.1 Protein 1.1.1 Protein là gì? Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho sự sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “thứ nhất”. Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương . 1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại học Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin. Hiên nay đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo ra hàng trăm, hàng nghìn các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5 loại cấu trúc không gian, ứng với 5 chức năng của Protein như sau:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

—&–

Công nghệ proteins- enzyme

Chuyên đề 7:

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC

NĂNG CỦA PROTEIN

GVHD: TS Đặng Xuân Nghiêm

Sinh viên thực hiện: Triệu Thị Linh

Mã SV: 550362

Hà nội, 4/2013

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN

PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

1 Khái Niệm

1.1Protein

1.1.1 Protein là gì?

Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho

sự sống Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa

là “thứ nhất” Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương

1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein

Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C Lauritzen thuộc đại

học Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin Hiên nay đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo

ra hàng trăm, hàng nghìn các phân tử protein có cấu trúc khác nhau Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi” Trình tự axit amin xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng Có 5 loại cấu trúc không gian, ứng với

5 chức năng của Protein như sau:

• Kháng thể

(antibody)

Đây là các protein có

khả năng bám vào các

phân tử ngoại lai như vi

khuẩn, vi rút, sau đó vô

hiệu hóa chúng để bảo

vệ cơ thể Trong hình

bên là cấu trúc không

gian của protein kháng thể:

Immunoglobulin G (lg G).

• EnzymeEnzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong

tế bào Chúng cũng giúp đỡ hình thành những phân tử mới bằng cách đọc thông tin di truyền lưu trữ trong DNA

Vídụ hình bên:

Phenylalanine hydroxylase.

sinh học giữa các tế bào,

mô, cơ quan khác nhau

Ví dụ: hormone tăng

trưởng (Growth

hormone)

• Thành phần cấu trúc

Những protein này cung cấp cấu trúc và nuôi dưỡng tế bào Trong một phạm vi lớn hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển Ví dụ: Actin

trong tế bào và lưu

thông trong cơ thể Ví

dụ: Ferritin

1.2 Vai trò Protein trong sinh học

Như đã nói ở trên, Protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh học nói chung cũng như con người nói riêng

1.2.1 Vai trò

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axit amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết

peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.

• Protein hình thành, duy trì và thay thế các tế bào trong cơ thể Protein chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưởng xấu đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể

• Protein là tham gia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men, kháng thể, các tuyến bài tiết và nội tiết Vì vậy, protein có liên quan đến mọi chức năng sống của cơ thể (tuần hoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài tiết hoạt động thần kinh và tinh thần )

• Protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt là các vitamin và chất khoáng Khi thiếu protein, nhiều vitamin không phát huy đầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số lượng

• Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể, thường cung cấp 10%-15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4 Kcal (trong khi đó Gluxit là 4 Kcal, Lipit là 9kcal và rượu là 7kcal)

• Protein kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các chế độ ăn khác nhau Thiếu protein gây ra các rối loạn quan trọng trong cơ thể như ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn

2 Phân tích cấu trúc Protein

2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì?

Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành phần và trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong sinh học Từ các thông tin đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có chức năng gì, để từ tìm cách tổng hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần hoặc loại bỏ các protein có hại Phân tích cấu trúc Protein chính là nhằm mục đích này

Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất được đẩy mạnh Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được công bố cho phép con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử protein Và chúng cũng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,

…

2.2 Các phương pháp phân tích

Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường của chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được Chính vì vậy, để nghiên cứu những đối tượng này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các phương tiện khoa học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu trúc protein chỉ thực sự khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật

Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin giới thiệu sơ lược một vài phương pháp hữu hiệu nhất

2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography)

William Henry Bragg (1862-1942) là người đi tiên phong trong việc phát triển phương pháp X-ray Bragg có vô số hứng thú nghiên cứu, nhưng công trình mang lại tên tuổi cho ông là một nhà khoa học hàng đầu là tiến bộ mang tính lịch sử của ông trong tinh thể học tia X Làm việc với người con trai, William Lawrence Bragg, ông

đã phát triển một phương pháp bắn phá các tinh thể với tia X năng lượng cao phát ra bởi những ống chân không được cấu trúc đặc biệt Khi tia X đi qua đơn tinh thể, chúng bị nhiễu xạ theo một điều kiện do cha con Bragg khám phá ra và do đó suy luận định lượng ra đường đi của chúng Hình ảnh tia X nhiễu xạ có thể được chụp trên kính ảnh, vì tia X làm phơi sáng các hạt bạc bromide khi chúng va vào Bằng cách khảo sát hình ảnh tia X nhiễu xạ bởi những tinh thể khác nhau, Bragg và con trai của ông đã có thể thiết lập một số mối liên hệ toán học cơ bản giữa một cấu trúc tinh thể nguyên tử và hình ảnh nhiễu xạ của nó Với thành tựu này, , William Henry Bragg và William Lawrence Bragg được tặng Giải Nobel Vật lí năm 1915

Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) được ứng dụng nhiều trong sinh học để xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA hay RNA Và các phân tử này phải được chuyển về dạng tinh thể Lí do sử dụng tia X là vì ta không thể nhìn thấy chi tiết một vật nhỏ hơn nửa bước sóng đang sử dụng Mà kích thước nguyên tử quá nhỏ, nên phải dùng tia X vì có bước sóng đủ ngắn để thấy được chi tiết nguyên

tử Tuy nhiên, năng lượng sóng thì tỉ lệ nghịch với bước sóng, nghĩa là bước sóng càng ngắn thì năng lượng càng cao, càng dễ phá hỏng mẫu phân tử sinh học Đó là lí

do mà phải chuyển về dạng tinh thể để giảm sự phá hoại của tia X Tuy nhiên việc

phá hoại của tia X là vẫn không thể tránh khỏi, kết quả thu được cần được xem xét kỹ.

2.2.2 Cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR )

Công nghệ mới này không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian ba chiều của các phân tử sinh học mà còn cho biết đặc điểm nhiệt động học và từ tính của nó Điều nay cho thấy đây là một công cụ quan trọng cho phép đi sâu tìm hiểu chức năng của các phân tử sinh học ở mức độ phân giải cỡ các nguyên tử trong tương lai

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quang phổ được sử dụng rộng rãi Sự

đa dạng tuyệt vời của quang phổ cho phép xác định cấu trúc ba chiều của các protein Phần dưới sẽ cung cấp một cái nhìn tổng quan về các khái niệm lý thuyết trong phương pháp NMR cũng như giới thiệu các bước xác định cấu trúc của một protein bằng phương pháp này

3 Nghiên cứu về chức năng của protein

3.1 Hệ protein học (proteomics)

Việc phát triển của các kỹ thuật giải mã trình tự ADN, kết hợp với các phương pháp tách chiết, tinh sạch và phân tích trình tự protein đã mở đường cho sự hình thành một chuyên ngành mới gọi là hệ protein học Proteomics là chuyên ngành nghiên cứu về toàn bộ tập hợp protein được một mô, tế bào hoặc cơ thể tạo ra trong các điều kiện đặc thù, phân tích mức độ phổ biến của từng protein và sự tương tác của chúng với nhau và với các phân tử khác (ví dụ như ADN) trong quá trình hoạt động của tế bào Nếu như các kỹ thuật phân tích vi dãy phản ứng (microarray) có thể giúp nhận biết được sự biểu hiện của các gen trên cở sở phân tích hệ gen, thì các kỹ thuật proteomics cho phép xác định được hình ảnh tổng thể về toàn bộ vốn protein của một tế bào, mô hoặc cơ thể.Hệ protein học được dựa trên ba phương pháp cơ bản: điện di hai chiều trên gel polyacrylamid để tiến hành phân tách các protein, khối phổ để xác định khối lượng phân tử và định tính protein (hoặc các đoạn peptit từ phân tử protein đó), và tin sinh học

để đối chiếu các phân tử protein và các đoạn peptit với các trình tự mã hóa của chúng trong hệ gen Một tế bào riêng lẻ thường ít nhất tạo ra hàng nghìn loại protein khác nhau, trong khi việc sử dụng đơn lẻ phương pháp điện di truyền thống trên gel polyacrylamid thường không đủ để phân lập và tách biệt các protein này Vì vậy, như tên gọi của nó, phương pháp điện di hai chiều cho phép phân tách các phân tử protein trên gel điện di theo hai chiều được thực hiện kế tiếp nhau.

Trong bước thứ nhất, các phân tử protein được phân đoạn dựa trên điểm đẳng điện của chúng (theo nguyên tắc hội tụ đẳng điện) Theo nguyên tắc này, khi một gradient pH được tạo ra từ đầu này đến đầu kia của bản điện di, thì tại vị trí pH tương ứng làm trung hòa điện tích của một phân tử protein sẽ làm các phân tử protein tập trung (hội tụ) tại vị trí đó Trong bước thứ hai, các phân tử protein tại điểm hội tụ được tiếp tục phân tách trên cơ sở khối lượng và kích thước của chúng khi di chuyển trên trường điện di polyacrylamid đã được gây biến tính bởi SDS như mô tả ở trên Do các phân tử protein được đồng thời phân tách dựa trên hai thuộc tính (điểm đẳng điện và trọng lượng phân tử), nên hàng nghìn loại protein khác nhau có thể được phân tách khỏi nhau trong một thí nghiệm duy nhất Sau khi được phân đoạn theo phương pháp điện di hai chiều, mỗi loại protein riêng biệt sẽ được đưa vào phân tích khối phổ để xác định chính xác khối lượng phân tử Như đã nói ở trên, để tăng hiệu quả phân tích, thông thường protein được cắt thành các đoạn peptit nhỏ nhờ sử dụng protease thay cho việc phân tích phân

tử protein ở dạng nguyên vẹn có phân tử lượng lớn và cấu trúc phức tạp Kỹ thuật phân tích MS /MS cho phép giải trình tự chi tiết của các đoạn peptit và xác định phân tử protein

Cuối cùng các dữ liệu về trình tự hệ gen hoàn chỉnh của một cơ thể và các trình tự peptit từ các loại protein được quan tâm nghiên cứu sẽ được đưa vào phân tích bằng các phần mềm sinh tin học để có thể xác định được một trình tự mã hóa đặc thù trong hệ gen tương ứng với loại protein có chức năng được quan tâm nghiên cứu Như vậy, các nghiên cứu hệ gen học (genomics) và hệ protein học (proteomics) có mối quan hệ chặt chẽ trong các nghiên cứu di truyền học phân tử

3.1.1 điện di hai chiều trên gel polyacrylamid

Điện di trên gel polyacrylamide để tách các protein có kích thước khác nhau

Polyacrylamide có khe hở giữa các phân tử nhỏ hơn agarose và do đó phù hợp cho protein, bởi vì đây là những thường nhỏ hơn các phân tử DNA Khi một điện trườngđược áp dụng cho một mẫu protein, những người có kích thước nhỏ hơn có thể đi vòng quanh khe hở của acrylamide dễ dàng hơn và sẽ di chuyển ra khỏi cực

âm nhanh hơn protein lớn hơn

Hình 9.1 Gel Polyacrylamide SDS điện di Một khi một protein đã được đun sôi trong SDS, nó được tích điện âm Tổng số đoạn tương quan với kích thước của protein Sau khi được nạp vào một mẫu tốt của một loại gel polyacrylamide, các protein di chuyển đi từ cực âm và về phía cực dương Khả năng sàng lọc của gel cho phép các protein nhỏ hơn để di chuyển nhanh hơn so với lớn hơn Quãng đường đi trong một thời gian nhất định là tỷ lệ thuận với khối lượng của các phân tử

Điện di gel polyacrylamine hai chiều

Các protein được tách ra nhờ đi qua một ống gel polyacrylamine theo gradient nồng

độ pH từ 3 đến 10, nó di chuyển đến khi bị vô hiệu hóa, sau đó lấy ống gel ra và xử

lí bằng SDS, các protein được tách theo kích thước, và chúng di chuyển từ âm sang dương, mảnh nào có khối lượng nhỏ, chạy xa hơn những protein có khối lượng lớn

Tóm lại phương pháp điện di gel polyacrylamine dùng để phân tách các protein có khối lượng khác nhau

3.2.phương pháp khối phổ

3.2.1 phương pháp khối phổ kế tiếp

Phương pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS) có thể được dùng để xác định các vùng trình tự protein khác nhau Khối phổ là phương pháp xác định chính xác khối lượng của các các phân tử nhỏ Một cách vắn tắt phương pháp này được mô tả như sau: phân tử cần phân tích được cho bay qua một thiết bị (trong điều kiện chân không) trong điều kiện tốc độ di chuyển của nó tương quan với tỉ số khối lượng / điện tích Trên cơ sở này người ta có thể đo được thời gian bay của phân tử và xác định được

khối lượng của nó Đối với các phân tử sinh học có kích thước nhỏ như các chuỗi peptit và các phân tử protein nhỏ, thì trọng lượng phân tử của nó có thể xác định chính xác đến từng Dalton.

Để xác định khối lượng phân tử protein bằng phương pháp MS /MS, trước tiên phân tử protein thường được cắt thành các đoạn peptit có trình tự ngắn (thường dưới

20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu, chẳng hạn như trypsin Hỗn hợp các đoạn peptit này sau đó được đưa vào phân tích khối phổ và chúng phân tách nhau ra dựa trên tỉ số khối lượng / điện tích Các đoạn peptit riêng rẽ sau đó sẽ bị bắt giữ và phân đoạn thành các chuỗi peptit thành phần Khối lượng của mỗi peptit thành phần được xác định bằng phổ khối như minh họa trên hình 15 Sự kết hợp các dữ liệu về khối lượng của các đoạn peptit thành phần sẽ cho biết trình tự rõ ràng của phân tử protein ban đầu Cũng giống như trong phương pháp biến tínhdman, việc xác định được trình tự của của khoảng 15 axit amin là đủ để so sánh với trình tự protein được luận ra từ các trình tự ADN đã được giải mã

Kỹ thuật MS /MS thực sự là một kỹ thuật có tính cách mạng trong việc xác định và giải trình tự protein Trong phương pháp này, thông thường chỉ cần một lượng mẫu nhỏ và hơn hết là có thể phân tích hỗn hợp nhiều loại protein đồng thời.

4.2.2 Khối phổ ion hóa bằng tia điện

Máy dò kết hợp tồn tại có thể sử dụng cả hai TOF và bẫy ion tứ cực Lợi thế mà ESI hơn MALDI là các protein được phân lập từ HPLC không yêu cầu chuẩn bị đặc biệt

và có thể được sử dụng trực tiếp Những bất lợi của ESI là khối lượng tối đa khoảng

5000 Việc sử dụng quang phổ khối lượng sẽ trở nên phổ biến như các kỹ thuật cải tiến Ví dụ, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) khối phổ lấy

các mẫu chất lỏng và ion hóa các protein mà tuân theo một thanh kim loại được điều trị Kỹ thuật này cho thấy nhiều hứa hẹn cho các chất dịch cơ thể như máu và nó