Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu các nghiên cứucơ bảnvề chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm: đặc điểm sinh hóa, độc lực và thành phần protein.Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất vaccin phòng bệnh trên cá chẽm cũng như các đối tượng cá biển nuôi thương phẩm ở nước ta.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ THOA

ĐỘC LỰC VÀ THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA CÁC

CHỦNG VI KHUẨN Vibrio alginolyticus PHÂN LẬP TỪ

CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BỊ BỆNH LỞ LOÉT TẠI

CÁC BÈ NUÔI THƯƠNG PHẨM Ở KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Cán bộ hướng dẫn Khoa học: TS Nguyễn Hữu Dũng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện dưới sự chỉ bảo tận tình, chu đáo của Thầy hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Dũng

Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả

Nguyễn Thị Thoa

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu nhà trường Đại Học Nha Trang, các thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp thạc sỹ

Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự chỉ dẫn tận tình, những góp

ý quý báu, kịp thời của thầy giáo hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Dũng Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy đã luôn bên cạnh và hướng dẫn nhiệt tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi nghiên cứu tại hợp phần bệnh, dự án Nufu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Trung, trưởng phòng bệnh Thủy sản và Dự báo, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Trung, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể tham gia và hoàn thành khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn Ban điều phối dự án NUFU đã cung cấp mọi điều kiện vật chất trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi: Bố, mẹ cùng anh, chị và các em, chồng tôi Trần Huy Chinh và hai con:Khánh Ninh và Khánh Ngân đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc và tạo mọi điều kiện thời gian và vật chất giúp tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn

Nguyễn Thị Thoa

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt v

Danh mục các hình ảnh vi

Danh mục các bảng vii

Mở đầu 1

Chương 1 - Tổng quan .3

1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam 5

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở thế giới 5

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam 7

1.4 Một vài đặc điểm vi khuẩn V alginolyticus 8

1.4.1 Hệ thống phân loại của V alginolyticus 8

1.4.2 Đặc điểm phân bố của V alginolyticus 8

1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V alginolyticus 9

1.4.4 Yếu tố gây độc của V alginolyticus 11

Chương II: Phương pháp nghiên cứu 14

2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng 14

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 14

2.2.3 Nghiên cứu độc lực, LD50 của vi khuẩn 16

2.2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực 16

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm 17

2.2.3.3 Phân lập lại vi khuẩn 18

2.2.4 Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS)

của vi khuẩn 19

2.2.4.1 Phương pháp nhuộm Pr 20

2.2.4.2 Phương pháp nhuộm LPS 21

2.3 Phương pháp xủ lý số liệu 22

Chương III: Kết quả nghiên cứu 23

3.1 Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa 23

3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V alginolyticus 25

3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10 26

3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01 28

3.2.3 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoK03 30

3.2.4 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoVL03 31

3.2.5 Kết quả phân lập trở lại V alginolyticus 32

3.2.6 Kết quả kiểm tra độc lực 4 chủng V alginolyticus đợt 2 33

3.3 Thành phần Protein và LPS của 4 chủng V alginolytics 35

3.3.1 Thành phần Protein của 4 chủng V alginolytics 35

3.3.2 Kết quả phân tích LPS của 4 chủng V alginolytics 37

Chương IV: Kết luận và đề xuất ý kiến 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Đề xuất ý kiến 38

Tài liệu tham khảo 39

Phụ lục

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS: Ammonium Persulphate

SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine

SDS: Sodium dodecyl sulfate Electrophoresis purity reagent

Tris: Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) - aminomethane Rpm: Revolutions per minute

KDa : Kilodalton

DNA : Deoxyribonucleic acid

TSA: Tryptic Soy Agar

TSB: Tryptic Soy Broth

API: Analytical Profile Index

TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar

CFU: Colony forming units

LD50: Mean Lethal Dose, 50% (Liều gây chết 50%)

NMSL: Nước muối sinh lý

LPS : lipopolysaccharides

P : page (trang)

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia giá trị ở khu vực

châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006 3

Hinh 1.2 Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở Australia từ năm 1986 đến năm 2004 5

Hình 2.1 Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm 18

Hình 3.1 Đặc điểm sinh hóa trên test kit API - 20E của vi khuẩn V alginolyticus 25

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn V alginolyticus trên môi trường TCBS và nhuộm Gram 25

Hình 3.3 Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 25

Hình 3.4 Độc lực chủng CH10 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy và b: tỷ lệ biểu hiện bệnh 26

Hình 3.5 Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CH10 28

Hình 3.6 Độc lực chủng CoS01 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy và b: tỷ lệ biểu hiện bệnh 28

Hình 3.7 Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CoS01 30

Hình 3.8 Tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét của cá chẽm đối với chủng CoK03 31

Hình 3.9 Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CoK03 31

Hình 3.10 Biểu hiện cá bị bệnh khi tiêm kiểm tra độc lực vi khuẩn V alginolyticus và cá khỏe mạnh ở lô đối chứng 32

Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc V alginolyticus trên môi trường TCBS và TSA 32

Hình 3.12 Độc lực và tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét của hai chủng CH10 và CoS01 trên cá chẽm khỏe đợt 2 33

Hình 3.13 SDS-PAGE protein của 4 chủng V alginolyticus 35

Hình 3.14 SDS-PAGE lipopolysaccharides của 4 chủng V alginolyticus 37

Trang

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập của đối tượng nghiên cứu 14

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hoá của 4 chủng V alginolyticus 23 Bảng 3.2 LD50 của các chủng V alginolyticus qua 2 đợt thí nghiệm 34

MỞ ĐẦU

Nghề nuôi cá biển Việt Nam trong vài năm trở lại đây đã phát triển mạnh mẽ Nhiều đối tượng cá biển được đưa vào nuôi với nhiều hình thức nuôi ao đìa hoặc nuôi lồng, bè Trong đó, cá chẽm với nhiều ưu điểm như lớn nhanh, phân bố rộng muối, có giá trị kinh

tế, và đã được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo thành công, nên nghề nuôi cá chẽm đã phát triển mạnh ở khu vực miền Trung (Khánh Hòa, Phú Yên) và một số nơi ở phía Bắc như Hải Phòng, Quảng Ninh … Đến nay cá chẽm trở thành đối tượng nuôi xóa đói giảm nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang bị suy thoái Tuy nhiên, trong quá trình nuôi do kỹ thuật chăm sóc, quản lý môi trường còn nhiều hạn chế nên nghề nuôi cá chẽm đang đối mặt với nhiều đợt dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi

Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán - Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân với tốc độ lây lan nhanh, gây chết khoảng 80% trong vòng 1 tuần, bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôi lớn

(2 - 3kg) Nguyên nhân ban đầu xác định do vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra

Trước tình hình thực tế trên và để có cơ sở cho việc xác định chính xác tác nhân

gây bệnh, nghiên cứu vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, tôi đề xuất thực hiện đề tài: “ Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ

cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa”

Mục tiêu của đề tài:

Xác định mối tương quan giữa độc lực và thành phần protein của chủng vi khuẩn

V.alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất

vaccin phòng bệnh trên cá biển nuôi, giúp giảm thiệt hại và nâng cao hiệu quả kinh tế cho nghề nuôi cá biển

Nội dung thực hiện đề tài:

1 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn V.alginolyticus

2 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn V.alginolyticus

3 Xác định thành phần protein của chủng vi khuẩn V.alginolyticus

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu các nghiên cứu

cơ bản về chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm: đặc điểm sinh

hóa, độc lực và thành phần protein

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở cho nghiên cứu sản

xuất vaccin phòng bệnh trên cá chẽm cũng như các đối tượng cá biển nuôi thương phẩm ở nước ta

Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới

Cá chẽm có giá trị dinh dưỡng cao, là loài phân bố rộng và dễ nuôi nên đã trở thành một trong những đối tượng được lựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nhiều nước trong khu vực Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên

1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam và Australia, và gần đây

ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan, Anh và Israel [35]

Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần lớn cá chẽm được nuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển [36] Năm 2004, sản lượng cá chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn [61] và năm 2006 tăng lên 27.522 tấn [62]

Thái Lan: Là nước dẫn đầu về sản lượng nuôi cá chẽm trong khu vực Châu Á -

Thái Bình Dương Năm 2004, giá trị sản lượng cá chẽm của Thái Lan là 65,08 triệu USD,

Hình 1.1 Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia (cột) và giá

trị ( đường) ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006

(Nguồn Mike ) [61]

năm 2005 là 68,52 triệu USD với giá bán khá ổn định, trung bình mỗi kg cá thương phẩm dao động trong khoảng 2,50 - 2,60 USD [62] Theo FAO (2006), sản lượng cá chẽm nước mặn và lợ của Thái Lan tăng hằng năm, từ 3.884 tấn (năm 1995) và tăng lên 14.550 tấn (năm 2004) [36]

Malaysia: Cá chẽm là loài được nuôi truyền thống, đến năm 2007 vẫn là loài nuôi

dẫn đầu trong nghề nuôi cá lồng ở Malaysia Theo thống kê của FAO (2006) sản lượng cá chẽm của Malaysia là 4.003,73 tấn (năm 2002), 4.210,93 tấn (năm 2003), và 4.000,54 tấn

(năm 2004) [36]

Indonesia: Là quốc gia có sản lượng cá có vảy (finfish) biển lớn nhất trong khu

vực Đông Nam Á Trong đó cá chẽm cũng là một trong những loài nuôi chính của nước này với sản lượng năm 2004 vào khoảng 2.900 tấn[36]

Singapore: Dự tính đến năm 2012 sản lượng cá chẽm là 3.000 tấn và đến năm

2020 sản lượng sẽ tăng lên 20.000 tấn [94]

Hàn Quốc: Tổng sản lượng cá nuôi của Hàn Quốc năm 2003 khoảng 72.393 tấn,

trong đó cá chẽm khoảng 2.778 tấn [36]

Australia: Cá chẽm được nuôi ở hầu hết các bang của Australia (ngoại trừ bang

Tasmania)[36], [93], nhưng sản lượng cá chẽm tập trung chủ yếu ở Queensland (phần lớn

là nuôi nước ngọt), Northern Territory (nuôi lồng biển và nuôi ao nước lợ) và Nam

Australia (nuôi nước ngọt) [26] Cá chẽm được nuôi công nghiệp bắt đầu từ những năm

1980, hiện nay có khoảng 100 trang trại được cấp phép nuôi [93] Theo dữ liệu của FAO năm 2004, sản lượng cá chẽm khoảng 1.600 tấn, giá trị đạt 9,9 triệu USD [36] Theo báo cáo của O’Sullivan và cộng sự (2005) niên vụ 2003/2004 sản lượng cá chẽm khoảng 2.800 tấn, đạt giá trị 17,6 triệu USD [36] Niên vụ 2008/2009 sản lượng cá chẽm cả nước ước khoảng 6.000 tấn và sẽ tăng lên 7.000 tấn trong niên vụ 2009/2010 [93]

1.1.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam

Ở nước ta, cá biển được nuôi chủ yếu ở 3 vùng là vùng biển phía Bắc, vùng Nam Trung Bộ và vùng phía Nam Năm 2001, sản lượng cá nuôi biển cả nước khoảng 2.600 tấn, năm 2002 sản lượng tăng lên 5.000 tấn, ước tính năm 2010 sẽ đạt 20.000 tấn Các loài

nuôi chính là các loài cá mú (Epinephelus sp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcarifer), cá vược mõm nhọn (Psammoperca waigiensis), cá hồng đỏ (Lutjanus

erythropterus), cá tráp đen (Rhabdosargus sarba) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) [36]

Cá chẽm được xem như là vật nuôi xóa đói giảm nghèo và là đối tượng nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta Hiện nay chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta, nhưng qua tìm hiểu thông tin từ các báo cho thấy cá chẽm đã nuôi thành công ở một số nơi như ở Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa) [87], [88], [89], Hương Trà (Thừa Thiên Huế) [90], Hà Tĩnh [91], Đồng Nai, Bình Định [92], Cà Mau [86]

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá chẽm (Lates calcarifer) trên thế giới

Tác nhân do vi khuẩn, phần lớn bệnh do vi khuẩn xuất hiện do sự tương tác giữa tác nhân, cá và môi trường Cá nuôi trong điều kiện mật độ cao dẫn đến môi trường bị thay đổi bất thường, điều này ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của cá

Bệnh Vibriosis: là bệnh do một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V

anguillarum and V alginolyticus… gây nên với biểu hiện gây mòn vây, cụt đuôi, xuất

Hình 1.2 Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở

Australia từ năm 1986 đến năm 2004 (nguồn FAO, 2006 được trích dẫn bởi [36]

hiện nhiều đốm xuất huyết trên bề mặt cơ thể gây lở loét, xuất huyết dưới da và phần cơ Đôi khi phần mô xung quanh hậu môn bị viêm và sưng đỏ Nội quan bên trong cũng bị sung huyết ở gan, lá lách và thận, thường đi kèm bị hoại tử Bệnh xảy ra ở nhiều loài cá biển và cửa sông, chúng thường xuất hiện khi môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu

dinh dưỡng [35] Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên sậm màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết

loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng [32]

Nghiên cứu của Renaul cho thấy V damsela là nguyên nhân gây chết hàng loạt ở

cá chẽm con nuôi ở Tahiti (nằm ở khu vực Thái Bình Dương, thuộc Pháp), dấu hiệu chính

của bệnh là cá lờ đờ, xuất huyết ở gốc đuôi và lở loét lan rộng ra [59]

Theo nghiên cứu của Ransangan và cs (2009) thấy sự xuất hiện bệnh do Vibriosis gây ra cá chẽm Lates calcarifer nuôi lồng ở Malaysia gây tỷ lệ chết cao, tác động rất lớn

đến sản lượng cá nuôi ở nước này Thông thường cá ở giai đoạn nhỏ biểu hiện bỏ ăn, cơ thể sậm màu, sau đó chết hàng loạt Ở giai đoạn trưởng thành, cá có biểu hiện xuất huyết quanh hậu môn và các gốc vây Từ các mẫu bệnh nghiên cứu đã phân lập được 21 chủng vi khuẩn

từ các cơ quan bên trong như thận, tim, lá lách và gan Dựa vào đặc điểm hình thái và hóa

sinh đã xác định sự có mặt của V alginolyticus [56]

Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do Pseudomonas sp gây ra và tác động lên cá ở

tất cả các giai đoạn phát triển và gây cá chết từ 20 – 60% Kumaran(2009) nghiên cứu

trên cá chẽm Lates calcarifer ở một trang trại vùng bờ biển Đông Nam của Ấn Độ Cá bị

bệnh thối vây, xuất huyết ở vây, lớp cơ ở miệng và da, màu sắc nhạt Phân lập vi khuẩn từ mẫu cá bệnh cho thấy sự có mặt của vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn Định danh bằng

thử phản ứng hóa sinh và giải trình tự 16S rDNA đã xác định là Pseudomonas sp

KUMS3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn này trên cá khỏe thấy cá chết sau 2 ngày tiêm

và tỷ lệ chết tích lũy sau 12 ngày tiêm là 70% [46]

Ngoài giống vi khuẩn Vibrio và Pseudomonas thì vi khuẩn Aeromonas cũng gây xuất huyết trên cá Bệnh gây ra bởi Aeromonas hydrophila, Aeromonas sorbia,

Aeromonas caviae, Aeromonas spp Các vi khuẩn này thường nhiễm ở cá chẽm nuôi

nước ngọt, làm cho cá bị xuất huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt Bệnh thường xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương [32]

Bệnh do Streptococcus nhiễm trên cá được xem là một bệnh ảnh hưởng đến cá nuôi

và cá ngoài tự nhiên trên khắp thế giới [45], [17], [64] Streptococcus iniae là tác nhân gây bệnh chính của bệnh streptococcosis ở cá rô phi (Oreochromis spp.) tại Mỹ và Israel,

và cá hồi vân tại Israel Tuy nhiên, S iniae cũng được phân lập từ cá biển bao gồm cá chẽm châu Âu và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) tại Israel, và cá chẽm (L calcarifer) ở

Úc với liều gây chết LD50 là 2,5 x 105 CFU/g trong 2 ngày và 3,2 x 104 CFU/g trong 10 ngày [60], [27], [28], [29], [18] Loài này cũng được phân lập từ cá tự nhiên từ Vịnh Eilat [23] Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn nước mặn và kết quả là làm cho

cá chết với tỷ lệ cao Bệnh này được ghi nhận là tác nhân gây bệnh trên cá chẽm nuôi lồng biển ở Northern Territory (Australia) năm 2005 Trong trường hợp cấp tính, cá có thể gần chết hoặc chết với một vài dấu hiệu bên ngoài và trong các nội tạng Trong trường hợp ít trầm trọng hơn thì cá bị nhiễm bệnh có thể bơi nhấp nhô gần mặt nước, có thể bị mù và không đáp ứng với sự kích thích bên ngoài, xuất huyết có thể thấy ở da và đặc biệt ở chân vây Cầu mắt bị lồi và xuất huyết bên trong mắt, mang bị xung huyết Bên trong, sự xuất huyết nhiều có thể thấy ở bề mặt của các nội quan lớn, thường thì cơ xương có màu đỏ hồng [35]

Ngoài ra vi khuẩn Flexibacter cũng liên quan đến bệnh lở loét ở cá Flexibacteriosis

nước mặn gây bệnh ở cá nuôi và cá ngoài tự nhiên ở châu Âu, Nhật Bản, Bắc Mỹ và Australia [76], [57], [20], [24], [37], [68], [14] Trong nhóm cá nuôi, căn bệnh này đã được báo cáo ở cá chẽm Bệnh xuất hiện trên cả cá trưởng thành và cá giống, tuy nhiên cá nhỏ chịu ảnh hưởng bệnh nặng hơn cá lớn Bệnh gia tăng về tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng khi nhiệt độ nước nuôi cao (trên 15oC) Ngoài ảnh hưởng bởi nhiệt độ nước, bệnh này ảnh hưởng bởi điều kiện gây sốc của môi trường (stress) và yếu tố liên quan đến vật chủ (điều

kiện bề mặt da) Nhìn chung, cá bị bệnh biểu hiện miệng bị xuất huyết và mòn cụt, lở loét

ở da, vây bị xơ và thối đuôi [52]

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cá chẽm ở Việt Nam

Ở Việt Nam, theo báo cáo “ Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển” của Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2007) thuộc viện Nghiên

Cứu Nuôi trồng Thủy sản II cho thấy một số vi khuẩn như: Vibrio anguillarum, V ordalii,

V salmonicida, V vulnificus là tác nhân chủ yếu gây lên bệnh lở loét trên cá mú, cá chẽm

khu vực Đông Nam Á với biểu hiện: xuất huyết, đốm đỏ, lở loét, vây bị ăn mòn [1] Kết quả nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biến động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới [3]

Ở Việt nam, trong nghề nuôi cá lồng trên biển, bệnh Flexibacter đã xảy ra ở một số loài cá biển có giá trị kinh như cá mú, cá chẽm, vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, vào mùa mưa ở miền Nam [3]

Theo Đỗ Thị Hòa và cs (2008), cá biển nuôi tại Khánh Hòa có 10 bệnh thường gặp trên cá biển nuôi là trong đó có bệnh Vibriosis gây bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú, cá hồng, cá chẽm Thời gian xuất hiện bệnh chính là mùa khô [4]

1.4 Một vài đặc điểm về vi khuẩn V alginolyticus

1.4.1 Hệ thống phân loại của V alginolyticus

Giới Bacteria

Ngành Proteobacteria Lớp Gamma proteobacteria

Bộ Vibrionales

Họ Vibrionaceae Giống Vibrio

Loài Vibrio alginolyticus (http://en.wikipedia.org/wiki/ Vibrio alginolyticus) [85]

1.4.2 Đặc điểm phân bố của V alginolyticus

Vibrio alginolyticus là một loài vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng có mặt ở

hầu hết các mẫu thu từ nhiều đối tượng thuỷ sản khác nhau như cá, giáp xác, nhuyễn thể,

rong biển V alginolyticus có mặt trong môi trường nước mặn ở vùng biển nhiệt đới ôn

hòa và liên quan tới tỷ lệ chết cao trong hệ thống nuôi trồng thủy sản ở vùng biển Tunisian Vi khuẩn này thường có mặt ở những người thường ăn hải sản tươi sống hoặc chưa nấu chín dẫn đến viêm dạ dày ruột và bệnh đại tràng Những bệnh này thường xuất hiện vào mùa hè, khi nhiệt độ nước tăng [70]

Stephen đã phân lập V alginolyticus từ 9 / 12 loại hải sản ở vùng biển Ả Rập, với

hầu hết các chủng có nguồn gốc từ việc đánh bắt cá mòi tươi, cá thu, và cua [71] Vi

khuẩn V alginolyticus đã được biết là cùng môi trường sống giống với vi khuẩn V

parahaemolyticus và thường được phân lập từ cùng một loại mẫu Cả hai đều có thể tồn

tại ở mẫu hải sản bán phổ biến ở chợ tại Jakarta [43]

Vi khuẩn V alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với V parahaemolyticus

đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập tại Na Uy, Hà Lan, và Nhật

Bản [34], [44], [67] Sự phong phú tương đối của V alginolyticus và V parahaemolyticus

trong nước biển nhiệt đới và các nguồn hải sản ít được nghiên cứu, nhưng một báo cáo gần đây cho thấy một tỷ lệ lớn các mẫu cá biển tươi sống thu được khuẩn lạc màu vàng

hơn là khuẩn lạc xanh trên môi trường thạch TCBS [69] Sakazaki đã đề xuất V

alginolyticus là một chỉ số so sánh cho bề mặt bị ô nhiễm thứ cấp của hải sản và đồ dùng

so với V parahaemolyticus Tuy nhiên, đề xuất này nên áp dụng đối với các vùng ở khu vực nhiệt đới, nơi và 2 loài vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus phát triển

phong phú [67]

Theo Zhi, V alginolyticus được phát hiện từ mẫu tôm ướp muối từ vụ ngộ độc thực

phẩm, là tác nhân gây bệnh thông qua điều tra dịch tễ và kiểm tra nguyên nhân gây bệnh

V alginolyticus gây nhiễm trùng máu cho người và nhiễm vào vết thương và nó được tìm

thấy từ mẫu phân của người bị tiêu chảy chưa tìm được nguyên nhân gây bệnh Từ các

mẫu thức ăn dẫn đến ngộ độc thức phẩm [82] Vi khuẩn V alginolyticus cũng liên quan

đến dịch bệnh ở cá biển nuôi và tự nhiên cũng như dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của

nhuyễn thể và giáp xác trên thế giới [84], [81], [19], [41] Dựa vào nghiên cứu của

Hörmansdorfer, V alginolyticus được tìm thấy sự có mặt của chúng trong nước biển, chất

lắng cặn ở bề mặt đá san hô [40]

1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của V alginolyticus

Dựa theo nghiên cứu của Hoa T.T.T , V alginolitycus có đặc điểm phản ứng

dương tính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với ure, arginine và không phát sáng Vi khuaant phát triển tốt trong môi trường peptone 1% có chứa 3, 6, 8, 10% NaCl, nhưng lại không phát triển ở 0% NaCl Ngoài ra vi khuẩn còn dương tính với glucose, glycerol, mannitol, sucrose nhưng âm tính với lactose, salicin và H2S [38]

Theo miêu tả của Austin, V alginolitycus có đặc điểm đặc trưng là phát triển thành

từng cụm trên bề mặt thạch rắn, di động và lên men, Gram (-), hình que, phản ứng dương tính với catalase, oxidase, Indol, LDC, ODC, nhưng âm tính với ADH Vi khuẩn này có khả năng làm tan huyết, phân giải chitin, lipid, gelatin và tinh bột, nhưng không phân giải aesculin Lên men đường với Glycerol, maltose, mannitol, mannose, salicin và sucrose nhưng không lên men đường với arabinose, inositol và lactose Vi khuẩn phát triển tốt ở

370C, và trong môi trường 7%NaCl, có hoặc không trong 10% NaCl, không mọc trong 0%NaCl, nhạy với 0/129 [13]

Theo một nghiên cứu gần đây của Viên Đại Phúc, V alginolyticus là vi khuẩn

gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng, bờ không đều Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang Vi Khuẩn

V alginolyticus có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 3, 7, 10%, nhưng không mọc

được trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-) [8]

Ulitzur đã xác định Vibrio alginolyticus có tốc độ phát triển tốt nhất ở 37oC Yếu tố nhiệt độ, độ muối và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển của vi khuẩn nghiên cứu này, trong đó nhiệt độ có tác động lớn nhất Ở 39oC thời gian phát triển giữa các thế hệ là 10 – 11 phút, còn ở 21° C thời gian là 60 phút [74] Cũng theo Ulitzur ,

sự phát triển các lông rung của roi và hoạt động bơi của vi khuẩn V alginolyticus phụ

thuộc vào một mối quan hệ phức tạp giữa nhiệt độ, nồng độ muối và độ pH Ở nhiệt độ

trên 28 ° C các các lông rung của roi V alginolyticus không phát triển, trừ khi sự có mặt

nồng độ NaCl trong đó; ở nhiệt độ và nồng độ NaCl cao thì quy định sự tổng hợp các lông rung của roi Quy định này thấy rõ hơn ở pH 9 so với ở pH 6 Khi nhiệt độ cao và nồng độ NaCl thấp thì cũng ức chế hoạt động bơi của các tế bào roi có lông rung Các ion dương, chẳng hạn như Li+ , K+ và Mg2+ , chỉ thay thế NaCl ở nhiệt độ dưới 28 ° C [75]

Theo Gjerde và Boe cho biết tỷ lệ tăng V alginolyticus ở trai, cá, nước, và các

mẫu trầm tích từ bờ biển Na Uy trong những tháng hè (tháng Sáu đến tháng Chín) khi nhiệt độ nước ấm nhất (10 - 16 ° C) Trong kết quả một báo cáo ở đây, sự xuất hiện của

V alginolyticus biến động theo mùa, phụ thuộc vào nhiệt độ nước ấm hơn trong mùa khô

(tháng 5-Tháng 9) tại các khu vực nhiệt đới [34]

1.4.4 Yếu tố gây độc của V alginolyticus

Theo nghiên cứu của Josenhans và cs (2002), nhiều vi khuẩn gây bệnh của người,

động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển Sự xem xét lại các kết luận nghiên cứu gần đây đã phân tích vai trò của việc di động của các vi khuẩn gây bệnh Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng đối với nhiều tác nhân gây bệnh, vận động là điều cần thiết trong một

số giai đoạn của chu kỳ cuộc sống của nó và độc tính đó cùng với sự vận động được điểu

khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen [42] Hörmansdorfer và cs (2000), V alginolyticus được

tìm thấy trong 5 mẫu từ 20 mẫu thu từ biển và chất lắng cặn ở bề mặt đá san hô Dựa vào đặc điểm hóa sinh đã xác định được 45 chủng vi khuẩn trong đó có 13 chủng là

V alginolyticus Tất cả các chủng này đều có tính độc tạo ra sản phẩm men phân

giải casein và lipid, 11 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7 chủng thể hiện tác dụng với lecithin và 2 chủng có men phân giải hồng cầu Tất cả các chủng thể

hiện tính không độc với mẫu tế bào thực vật ở tảo nước mặn Asteromonas

gracilis Điều này có thể khẳng định vai trò của vi khuẩn trong việc làm tàn lụi

và tẩy trắng các rạn san hô cũng như tác nhân gây bệnh trên người [40] Vi khuẩn

V alginolyticus là một trong những tác nhân chính gây bệnh Vibriosis trên cá

tráp Sparus aurata L [22], [15], [83] Tuy nhiên, một vài chủng V alginolyticus không

độc và được sử dụng làm chủng vi sinh ở các trại tôm giống thuộc Ecuado, có tác dụng

ngăn chặn bệnh do Aeromonas salmonicida, V anguillarum và V ordalii [12]

Xie và cs (2005) cũng báo cáo rằng độ bám dính và các hoạt động thủy phân là

những yếu tố cần thiết cho dấu hiệu bệnh lý và sự nhiễm bệnh của vi khuẩn V

alginolyticus [81] Hoạt động thủy phân đã được xem là yếu tố độc tính bởi vì chúng cho

phép vi khuẩn sống sót, sinh sản và xâm lấn các mô vật chủ hoạt động phân giải protein của các sản phẩm ngoại bào đã được tương quan với các khả năng gây bệnh của nhiều

loài vi khuẩn Vibrio và Aeromonas Kết quả đã chỉ ra rằng hầu hết các chủng V

alginolyticus phân lập trong nghiên cứu này đều có sản phẩm của enzym gelatin, lipid,

ADN và casein, tất cả các yếu tố độc này có thể giúp các sinh vật khác nhiễm vào và sinh sôi nảy nở [30], [9]

Theo nghiên cứu của Narjol và cs (2006), V alginolyticus phân lập từ hầu ở

Alaskan có chứa gen trh (thermostable direct haemolysin-related haemolysin), quy định

tiết ra chất có tác dụng làm tan hồng cầu, trước đây đã được báo cáo chỉ có ở Vibrio

parahaemolyticus (là yếu tố gây độc của vi khuẩn này) Gen giống trh này đã được tách

dòng và giải trình tự giống đến 98% so với gen trh2 V parahaemolyticus [54] Snoussi (2008) nghiên cứu trên 28 chủng V alginolyticus phân lập từ nước biển từ các bờ biển của

Monastir (Khenis; Tunisia) trên TCBS và xác định các tính chất hóa sinh, eyzym phân

giải protein và khả năng làm tán huyết Tám gen độc của vi khuẩn V cholerae (toxR,

toxS, toxRS, toxT, ctxA, VPI, ace, zot) dùng làm mồi trong phân tích PCR để tìm các gen

tương tự trong bộ gen của chủng V alginolyticus Hầu hết các chủng nghiên cứu có gen

tán huyết dạng β và sản phẩm phân giải của vài enzym protein Kết quả phân tích PCR

dựa trên các gen V cholerae cho thấy sự phân bố lớn trong bộ gen của tất cả các chủng V

alginolyticus Các gen mở toxR đã được tìm thấy trong 9 V alginolyticus chủng trong số

28 chủng nghiên cứu Chỉ 1 chủng dương với toxS và toxRS, 5 chủng dương với tính độc của tác nhân gây bệnh (vpi), 7 chủng với toxT, 3 chủng với ctxA và 9 chủng đối với độc

tố (zot) Các chủng này có thể sản xuất ra vài enzyme có tính độc và dễ nhiễm vào các

biểu mô ở người và cơ của cá [70]

Wang và cs (2007) đã chứng minh rằng sự tiết ra enzym phân giải protein ngoại bào và các chất làm tan huyết cũng như sự lấy sắt được theo quy định của LuxO và σ54

của V alginolyticus [77]

Gần đây, Amel Ben Kahla-Nakbi (2009) nghiên cứu trên 34 chủng vi khuẩn V

alginolyticus phân lập từ cá tráp biển (Sparus aurata L.) và cá chẽm (Dicentrarchus labrax L.) nuôi trong trang trại nuôi cá trên bờ biển Địa Trung Hải Tunisia cho thấy sự

hiện diện của một số độc tính như sự sản sinh các sản phẩm ngoại bào (ECP), tăng trưởng trong điều kiện giới hạn sắt và sự tồn tại trong huyết thanh cá Ngoài ra ông còn kiểm tra

sự hiện diện của gen độc tương đồng với với các gen độc ở V cholerae (toxR, toxS, vpi

và ace); toxR đã được tìm thấy trong 16 chủng V alginolyticus và toxS trong 17 chủng và vpi trong 12 chủng trong số 34 chủng phân tích Như vậy, khả năng gây bệnh của V

alginolyticus có thể là kết quả của một sự kết hợp của tất cả các yếu tố Một số yếu tố,

chẳng hạn như khả sắt trong huyết thanh cá, mà ảnh hưởng đến sự sống còn, đã được liên

quan đến đóng góp cho căn bệnh do vi khuẩn V alginolyticus gây bệnh [11] Độc lực

cũng liên quan đến khả năng của mầm bệnh để sản xuất các sản phẩm ngoại bào [48],

[16] Theo Balebona và cs (1998b), ECPs chủ yếu bao gồm protease, có thể tạo thuận lợi các vi khuẩn nhiễm vào phần lớn mô tế bào vật chủ, do đó làm giảm sự cung cấp protein

[16]

Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu:

Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên Cứu NTTS III

Thời gian nghiên cứu: từ ngày 15/05/2010 đến ngày 15/03/2011

Đối tượng nghiên cứu: 4 chủng V alginolyticus phân lập từ cá chẽm nuôi

lồng bị bệnh lở loét, lưu giữ ở tủ đông băng -70oC và trong bình nitơ lỏng tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập của đối tượng nghiên cứu STT Ký hiệu Nguồn phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét

1 CH10 Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán

2 CoVL03 Vết loét cá chẽm bị bệnh thu ngày 28.10.2009 tại bè Vũng Ngán

3 CoS01 Lách cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán

4 CoK03 Thận cá chẽm bị bệnh thu ngày 17.12.2009 tại bè Vũng Ngán

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phương pháp thu thập, lưu giữ và phục hồi chủng:

Các chủng vi khuẩn được thu thập ở Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III, được nuôi cấy tăng sinh trong 10ml môi trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30oC sau

24 giờ bổ sung 20% glycerol tiệt trùng, phân liều vào trong các tube với thể tích 0,5 ml dịch khuẩn/tube, dán nhãn và lưu ở tủ đông băng -70oC Khi lấy chủng ra nghiên cứu cần phục hồi chủng bằng cách, lấy mỗi chủng 1 tube, để ra ngoài ở nhiệt độ phòng cho tan băng, sau khi tan băng, chuyển dịch khuẩn trong mỗi tube sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB 2%NaCl, nuôi ở nhiệt độ 30oC sau 18 đến 24 giờ, đưa các chủng cấy ria trên đĩa thạch TSA 2% NaCl, ủ ở 30oC sau 18 đến 24 giờ ta được các khuẩn lạc rời và tiếp tục đưa các chủng kiểm tra đặc điểm sinh hóa

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa:

Theo phương pháp truyền thống Gồm các đặc điểm sinh hóa sau:

- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên,1992) [5] Các bước tiến hành:

+ Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng hay từ khuẩn lạc

+ Dùng que cấy phết , dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch

+ Để mẫu khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn

+ Nhuộm Gram theo các bước sau:

 Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây

 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

 Nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút

 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

 Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton, nghiêng lam cho cồn chảy qua vi khuẩn

để tẩy màu

 Rửa nhanh nước và vẩy cho khô

 Nhỏ dung dịch Fuchsin trong 1-2 phút

 Rửa nước, để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô nhưng không làm xước mẫu)

 Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản

 Vi khuẩn có màu xanh tím – Gram dương (+)

 Vi khuẩn có màu đỏ hồng – Gram âm (-)

- Thực hiện dãy các phản ứng sinh hóa bằng test kit API-20E (Analytical Profile Index) để xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn:

22 ARA (Arabinose)

23 NO2 (khử nitrate)

+ Kiểm tra khả năng chịu đựng muối của vi khuẩn ở các nồng độ 0%, 3%, 7% và 10%

+ Kết quả định danh dựa vào kết quả dãy phản ứng sinh hóa, bảng tra kết quả API – 20E

và hệ thống phân loại vi khuẩn của Faddin (1980) [31] , Frerichs (1993) [33] , Holt và cs (1994) [39]

2.2.3 Nghiên cứu độc lực, xác định LD 50 của vi khuẩn

2.2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực

Lấy vi khuẩn được giữ đông băng ở nhiệt độ -70oC để ở nhiệt độ phòng cho rả đông, lấy 0.2 ml dịch khuẩn nuôi trong bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trường TSB 2% NaCl Sau đó đặt trên máy lắc với tốc độ lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng Sau khoảng thời gian 18h nuôi cấy thu 1 ml mẫu đem ly tâm với tốc độ 6000 rpm/4oC trong thời gian 10 phút Hút bỏ phần dịch nổi, rồi hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lý sao cho mật độ vi khuẩn ở khoảng 108 (tạm gọi là dịch gốc) Pha loãng dịch vi khuẩn để cấy xác định mật độ tế bào trên môi trường TCBS

 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trên môi trường TCBS

+ Hệ thống pha loãng: hệ số pha loãng bằng 10

+ Lấy 0.1 ml nước mẫu ở 2 độ pha loãng cuối cùng, nuôi cấy trên môi trường TCBS Mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 3 hộp lồng

+ Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-32oC, sau 24 giờ đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa hợp lồng có cùng độ pha loãng

+ Số lượng vi khuẩn tính theo công thức:

X: Số lượng vi khuẩn/ml (cfu/ml)

A: Số khuẩn lạc trung bình ở một độ pha loãng

V: Thể tích mẫu đưa vào nuôi cấy (0.1 ml)

2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực:

Cá thí nghiệm: cá chẽm mua từ trại sản xuất giống nhân tạo có chiều dài khoảng 10- 12 cm, được nuôi thuần dưỡng trong bể composit trong 2-3 tuần cho đến khi cá quen với bể nuôi và bắt mồi bình thường Chọn cá khoẻ mạnh cân đo và phân bố vào hệ thống

 Sục khí liên tục, nước biển qua xử lý chảy liên tục

 Cho ăn thức ăn tổng hợp Uni-president

Thí nghiệm cảm nhiễm: Các chủng vi khuẩn thu từ các đợt cá chẽm dịch bệnh bị lở loét tại địa điểm nuôi ngoài bè Vũng Ngán – Nha Trang của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III được bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Mỗi chủng vi khuẩn được bố trí ở 4 thang nồng độ cảm nhiễm lần lượt là 102, 103, 104, 105 cfu/g cá bằng cách tiêm dưới da 0.1 ml dịch khuẩn/con cá 1 nhóm đối chứng tiêm mỗi con 0.1 ml nước muối sinh lý tiệt trùng và 1 nhóm đối chứng không tiêm vi khuẩn Thí nghiệm được lặp lại 2 lần cho mỗi chủng vi khuẩn

Chăm sóc cá thí nghiệm: Theo dõi tình trạng sức khoẻ cá thí nghiệm trong thời gian 10 ngày, hàng ngày cho ăn, siphon lấy thức ăn thừa Theo dõi ghi chép tình trạng sức khỏe cá trong thời gian thí nghiệm Khi xuất hiện cá bệnh, quan sát ghi lại dấu hiệu lâm sàng và thu mẫu để tiến hành phân lập lại vi khuẩn Ghi chép số lượng cá chết, tính LD50

Công thức tính LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [58]

(Ở đây, bậc pha bằng 10)

A: Độ pha gây tỷ lệ chết tích lũy cao nhất dưới 50%

a: Tỷ lệ chết tích lũy ở độ pha A B: Độ pha gây tỷ lệ chết tích lũy thấp nhất trên 50%

50 - a LgLD50 = [ LgA + (

b-a x Lg (bậc pha)) ]

b: Tỷ lệ chết tích lũy ở độ pha B Công thức tính tỷ lệ biểu hiện bệnh:

Đánh giá tỷ lệ biểu hiện (TLBH) bệnh lở loét của cá chẽm sau khi cảm nhiễm vi khuẩn theo công thức sau:

2.2.3.3 Phân lập lại vi khuẩn:

Dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thuỷ sản của Frerichs (1993) [33] , Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên,1992 [5]), Bùi Quang Tề (1995) [6] , Đỗ Thị Hòa (2003) [1]

* Môi trường phân lập vi khuẩn:

- Môi trường tổng hợp: TSA + 2% NaCl

- Môi trường chọn lọc: TCBS

- Môi trường tăng sinh: TSB + 2% NaCl

* Sơ đồ phân lập lại vi khuẩn:

Hình 2.1: Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm

* Nuôi cấy, phân lập lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus ở cá thí nghiệm

Thử các phản ứng sinh hóa

Kết luận giống loài vi khuẩn Phân loại vi khuẩn Nhuộm gram Nuôi cấy, phân lập

Cá bệnh ở lô thí nghiệm

 Thu cá có dấu hiệu bỏ ăn, bơi yếu, có hiện tượng tróc vẩy, lở loét tại vùng xung quanh vị trí tiêm và bề mặt cơ thể Tiến hành mổ cá, dùng que cấy hơ nóng dưới ngọn đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp mẫu bệnh phẩm (ở chỗ vết loét, thận, gan) cấy trên môi trường TCBS, đặt trong tủ ấm 30oC trong 24 giờ

 Nuôi cấy thuần chủng: chọn khuẩn lạc rời, màu vàng, tròn, lồi, bóng, chiếm

ưu thế trên đĩa TCBS, sau đó cấy chuyển sang môi trường TSA 2% NaCl để kiểm tra độ thuần và đủ lượng vi khuẩn để định danh

 Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992 [5])

 Định danh lại bằng test API 20E khẳng định là V alginolyticus

2.2.4 Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS) của vi khuẩn:

Sử dụng kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) theo phương pháp của Laemmli (1970) [47] được bổ sung bởi (Tsang

và cs, 1983 [73]) và nhuộm protein bằng bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981) [80] Bước 1: Rửa tấm kính sau đó lắp kính vào khuôn

Bước 2: Đổ khuôn gel

 Resolving gel: (Dùng cho 2 bản gel)

 Dung dịch nước : 2,96 ml

 Acry 30% : 4,44 ml

 Tris 1,5 : 2,5 ml

 SDS 10% : 0,1 ml Sau đó cho vào dung dịch trên 5µl TEMED và 50 µl 10%APS Hỗn hợp gel phải làm nhanh để tránh polyme hóa Đổ nhẹ nhàng vào khuôn bằng pipet, tránh tạo bọt Quan sát sự rò rỉ, sau đó phủ lên một lớp nước cất để phá bọt Chú ý, trước khi đổ gel cần đánh dấu mức đổ gel bằng khoảng cách răng lược Đợi 45 – 60 phút ở nhiệt độ phòng

 Stacking gel:

 Dung dịch nước :5,55 ml

 Acry 30% : 1,85 ml

 Tris 0,5 :2,5 ml

 SDS 10% :0,1 ml Sau đó cho vào dung dịch trên 10µl TEMED và 50 µl APS Dùng giấy thấm hút phần nước cất trong khuôn ra, đổ hỗn hợp gel vào khuôn cho ngập phiến kính, cài lược vào khuôn, tránh tạo bọt, đánh dấu vào mỗi răng lược để dễ dàng thao tác khi cho mẫu vào khuôn Để ở nhiệt độ phòng 30 – 45 phút

Bước 3: Lắp gel vào khung

Bước 4: Chuẩn bị electrode buffer:

Pha 100 ml electrode buffer 10X với 900 ml dung dịch nước cất, sau đó đổ vào khuôn điện di (đổ ngập buồng nhỏ của 2 gel)

Bước 5: Chuẩn bị mẫu vi khuẩn và protein chuẩn

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA 2% NaCl, sau 24 giờ lấy vi khuẩn hòa trong dung dịch muối PBS để đạt được độ đục khoảng 108 cfu/ml Đem ly tâm dung dịch

vi khuẩn 6000 rpm/4oC trong thời gian 10 phút Sau khi hút bỏ phần dịch nổi Tiếp theo pha loãng 2 lần theo tỷ lệ 1:1 bằng dung dịch Sample buffer Cùng lúc, chuẩn bị protein chuẩn, cũng hòa vào dung dịch Sample buffer với tỷ lệ 1:20 Các mẫu đã chuẩn bị được đem ủ nóng ở 95oC trong 5 phút Cuối cùng, đổ mẫu vào các giếng trên bản gel 5µl/giếng

và chạy điện di ở điện thế 200 V trong 40 phút

Gel sau khi điện di được nhuộm bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981)[80]

2.2.4.1 Phương pháp nhuộn Protein

Đổ hết dung dịch cố định vào can đựng nước thải độc hại, sau đó đổ nước cất vào khay, lắc nhẹ trên máy lắc trong 10 phút, rửa 2 lần

Bước 3: Nhuộm protein

Dung dịch nhuộm dùng cho 2 gel

 Nước cất: 35 ml

 Silver complex solution: 5ml

 Reduction moderator solution: 5ml

 Image development reagen: 5ml Trộn đều bằng máy khuấy từ, rồi cho thêm vào 50 ml dung dịch Development acclerator solution Đổ hỗn hợp này vào khay, lắc nhẹ cho đến khi các vạch protein xuất hiện thì dừng phản ứng

Bước 4: Dừng phản ứng

Sau khi các vạch protein xuất hiện rõ, đổ hết dung dịch nhuộm vào can đựng chất thải độc, rồi đổ dung dịch acid acetic 5% để dừng phản ứng nhuộm, lắc nhẹ trong khoảng 15 phút, rửa sạch bằng nước cất trong 5 phút Sau đó đặt gel lên tấm kính và đưa

đi quan sát và chụp hình

2.2.4.2 Phương pháp nhuộm LPS:

Theo phương pháp của Tsai và Frasch (1982) [72]

Bước 1: Gel sau khi điện di, cố định trong dung dịch cố định LPS, ủ qua đêm ở 4oC

Dung dịch cố định LPS (dung dịch A): tính cho 1 gel

Chuẩn bị dung dịch oxidase solution (1 gel) dung dịch B

 Periodic acid (H5CO6, M = 227,94 g/mol): 0,7 g

 Fix solution LPS (dung dịch A) : 100 ml

Để nhiệt độ phòng 5 phút, lắc đều cho hòa tan

Bước 3: Đổ hết dung dịch cố định ra thùng chứa nước thải độc, cho dung dịch B vào, để 5

phút

Bước 4: Đổ hết dung dịch B ra, rửa trong nước 3 lần, mỗi lần 10 phút

Bước 5: Chuẩn bị dung dịch nhuộm LPS (Staining solution) dung dịch C (1gel)

 25% ammoni hydroxide (NH4OH) NH3 trong H2O: 2ml

 0,1M Natri hydroxide (NaOH) : 28 ml

 20% Silver nitrate (AgNO3, M: 169,87 g/mol) : 5ml (giữ trong bóng tối)

 Nước: 115 ml

Bước 6: Đổ hết nước ra, đổ dung dịch C vào để 10 phút

Bước 7: Rửa gel 3 lần, mỗi lần 10 phút trong dung dịch nước

Bước 8: Development solution (dung dịch D)

Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V alginolyticus gây bệnh lở loét trên

cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa

Đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V alginolyticus kiểm tra bằng test API 20E của

hãng Bio Mérieux (France) và kết hợp phương pháp truyền thống được thể hiện ở bảng

3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hoá của 4 chủng V alginolyticus

Các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Ghi chú: -: phản ứng âm tính, +: phản ứng dương tính, v: phản ứng thay đổi trong các lần thử

Qua bảng 3.1 cho thấy các đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V alginolyticus phân lập

được đều tương tự nhau Do có đặc điểm giống với đặc điểm mô tả của Holt và cs (1994) [39], Balebona và cs (1998a) [15] Các chủng này có đặc điểm gram (-), hình que ngắn, di động; trên môi trường TCBS: khuẩn lạc có màu vàng, bóng, lồi, bờ không đều; trên môi trường TSA: khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang Các chủng đều có thể phát triển tốt nhiệt độ 37oC và ở các nồng độ muối 3%, 7%, 10%, nhưng không mọc được trong môi trường muối 0%; nhạy với vibriostat 0/129 (150 g); dương tính với Oxidase, Catalase, LDC, CIT, IND, GLU, MAN, SOR, SAC, AMY, NO2 nhưng âm tính với ADH, ODC, Theo các nghiên cứu của Đỗ Thị Hoà và cs (2004) [3], Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005) [7], Austin và cs (2007) [13], Viên Đại Phúc (2011) [8] cũng cho kết quả tương tự

Cả 4 chủng V alginolyticus đều có khả năng chịu đựng muối ở nồng độ 10%, tuy nhiên 2

chủng CoVL03 và CoK03 kém phát triển trong NaCl 10% hơn so với 2 chủng còn lại

Theo kết quả của Narjol và cs (2006), chủng V alginolyticus ATCC 33787 có thể phát

triển được ở 10% NaCl và ở nhiệt độ từ 20 – 40oC; điều này cũng trùng với kết quả của

Gjerde và Boe (1981), V alginolyticus phát triển phong phú ở vùng biển nước ấm[54], [34] Theo nghiên cứu của Molitoris và cs (1985), khi nghiên cứu 340 chủng V

alginolyticus phân lập từ nước biển, mẫu hải sản tươi từ chợ ở Jakarta ở Indonexia cho

thấy 78,5% các chủng phát triển được ở nồng độ muối 10% [53] Hoa T.T.T và cs (2001)

khi nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn V alginolyticus cũng khẳng định

nó có khả năng phát triển trong muối 10% [38]