Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh (tóm tắt)

- 2 - vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA

- 1 -

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị

cao về dinh dưỡng, kinh tế và là nguyên liệu cho công nghiệp, có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trường Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ

bị nhiễm nhiều loại virus, như Soybean mosaic virus – SMV gây bệnh khảm

lá, Bean yellow mosaic virus – BYMV gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ, và một số virus gây bệnh khác Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương

SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp làm môi giới và virus có thể truyền qua hạt Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít

và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87] Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt [95]

Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV Các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả thấp

và tốn nhiều công sức Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế Chính vì

- 2 - vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm

nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh

theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi)

RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng

dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật Dựa trên nguyên lý bất

hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật

RNAi trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề

tài luận án là: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát

triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương

chuyển gen kháng bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung: Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh

khảm trên cây đậu tương bằng kỹ thuật RNAi

2.2 Mục tiêu cụ thể: (i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây

bệnh khảm ở cây đậu tương Việt Nam; (ii) Phát triển vector chuyển gen

mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và cả hai loài SMV và

BYMV; (iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả

năng kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen; (iv)

Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi nhân

đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV Phân tích

sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP

phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng

gen quốc tế

3.2 Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV

phân lập từ nhiều nguồn khác nhau Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và

tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP

- 27 -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÒ THỊ MAI THU

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC

VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014

- 26 -

Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại,

Khoa Sinh– KTNN, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên và Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Phòng DNA Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

PGS.TS Chu Hoàng Hà

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 2:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp

Họp tại Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư

viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia Việt Nam

- 3 -

3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của

SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway Biến nạp

vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A tumefaciens

3.4 Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá Phân tích sự có mặt của đoạn

gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ

thuật PCR Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen

so với cây đối chứng không chuyển gen

3.5 Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A tumefaciens Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương

chuyển gen

4 Những đóng góp mới của luận án

4.1 Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước

720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid Hai trình tự đoạn gen CP của SMV

đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103

4.2 Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV

4.3 Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng cả hai loài SMV và BYMV

4.4 Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Về khoa học

Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV, BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ

sở khoa học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ

- 4 - chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây trồng

chuyển gen kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi

5.2 Về thực tiễn

Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu

tương đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang

cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả

năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống

đậu tương ở Việt Nam Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen

CPi của SMV và BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây

chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu

ứng dụng kỹ thuật RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn

chọn giống cây trồng ở Việt Nam

6 Cấu trúc luận án: Luận án có 128 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được

chia thành các chương, phần: Mở đầu 4 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu

35 trang, Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, Chương

3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 46 trang, Kết luận và đề nghị 2 trang;

Các công trình công bố liên quan đến luận án 1 trang; Tài liệu tham khảo 19

trang Luận án có 18 bảng, 40 hình và tham khảo 182 tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo tài liệu 26 tiếng Việt và 155 tài liệu tiếng Anh để

tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Bệnh khảm do virus ở cây

đậu tương, (2) Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương, và (3) Kỹ thuật

RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus

Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp trên toàn thế giới và gây thiệt

hại lớn đến năng suất và chất lượng hạt SMV và BYMV là hai loài virus

gây bệnh khảm và khảm vàng ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ

Potyviridae Cây đậu tương có thể bị nhiễm đồng thời SMV và BYMV và

triệu chứng rất khó phân biệt Nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ

dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80%

- 25 -

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, and Chu Hoang Mau (2014) Development of RNAi-Based Vector Aims at Creating Antiviral

Soybean Plants in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), Vol 4, No 3, pp 208-211

2 Lò Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2013) Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen

CP của SMV và BYMV Tạp chí sinh học 35 (3), tr 129-135

3 Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu

(2014) Chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương nhờ vi khuẩn A tumefaciens Tạp chí khoa học&Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115

(01), tr 3-12

4 Lò Thị Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu

(2014) Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng soybean

mosaic virus và bean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học&Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 (02), tr 111-115

5 Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ Soybean Mosaic Virus Tạp chí sinh học 36 (1), tr

Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế

1 Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM (2014) Soybean

mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL1 GenBank,

Accession: HG965102

2 Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM (2014) Soybean

mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL2 GenBank,

Accession: HG965103

- 24 -

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1 KẾT LUẬN

1.1 Tách dòng và xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV dòng SL1,

SL2 Đoạn gen CP phân lập được có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino

acid, trong đó số amino acid của vùng poty-coat là 208 Trình tự đoạn gen

CP của SMV dòng SL1 và dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen

quốc tế với mã số HG965102, HG965103 SMV dòng SL1, SL2 phân bố

cùng nhóm với hai dòng của Trung Quốc

1.2 Phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn

gen CPi kháng đơn loài SMV và vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi

chứa đoạn gen CPi kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV Tạo được

chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi này

1.3 Tạo được 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi

(SMV-BYMV)] có kết quả dương tính với phản ứng PCR, trong đó có 19/26

dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn đồng thời cả

SMV và BYMV (chiếm 73,08%)

1.4 Đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu

tương ĐT12 và DT2008 Thu được 5 dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế

hệ T0 từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008 dương

tính với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt lần lượt là 1,35% và 2,24%

2 ĐỀ NGHỊ

2.1 Cần tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiện tính kháng đơn loài SMV và

tính kháng đồng thời cả hai loài SMV và BYMV ở thế hệ đậu tương chuyển

gen T1 và các thế hệ tiếp theo phục vụ công tác chọn giống đậu tương kháng

virus

2.2 Nghiên cứu thiết kế cấu trúc RNAi chứa đồng thời hai hoặc một vài gen

của SMV, BYMV để tăng hiệu quả kháng virus của cây đậu tương chuyển

gen

- 5 - SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và nucleic acid Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)) Jayaram và đtg (1992) đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của các chủng SMV G2 và G7 (Hình 1.2)

Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein vỏ (CP) được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C Chức năng của CP thể hiện trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong sự truyền virus của rệp Sự phân loại các thành viên của nhóm Potyvirus có thể dựa trên trình tự gen CP và trình tự amino acid của

CP Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, trong đó vùng mã hóa gồm dài 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, trong đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 33 đến 264; còn ở BYMV, gen CP có kích thước 933 nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong

đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272

Hình 1.2 Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease

Bản đồ này được dựa trên cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo Jayaram và đtg,

1992 Các hộp khác nhau đề cập đến các gen khác nhau và vùng 5 'và 3' là vùng chưa dịch mã (UTR) Các số dưới đây bộ gen đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein và các con số trong ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen của SMV G2 và G7 CP là protein vỏ của virus, CI là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và protease; NIb là RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là protease; VPg là protein liên kết

Chuyển gen là biện pháp công nghệ được ứng dụng để tạo dòng đậu tương kháng virus Cho đến nay, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng

bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens đã được ứng dụng phổ

biến và thành công đối với cây đậu tương Kể từ khi giống đậu tương đầu tiên

được chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua A tumefaciens lây

- 6 -

nhiễm vào nách lá mầm tổn thương trong nuôi cấy in vitro vào năm 1988,

đến nay phương pháp chuyển gen này đang được sử dụng, nghiên cứu và

ứng dụng khá phổ biến đối với cây đậu tương và đạt được những thành tựu

rất đáng khích lệ

Virus gây bệnh trên cây đậu tương rất đa dạng về chủng loại, chủ yếu

là virus RNA Các virus thường có phổ gây bệnh rộng, có loài gây hại tới

trên 900 loại thực vật khác nhau với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó

nhận biết Ứng dụng kỹ thuật RNAi bằng cách sử dụng nguồn gen của chính

virus gây bệnh và chuyển vào cây trồng, các nhà khoa học đã thành công trong

việc tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen

sau phiên mã

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu

Mẫu lá nghi nhiễm bệnh do SMV và BYMV được thu từ một số địa

phương được sử dụng trong thí nghiệm phân lập gen CP từ SMV

Sử dụng giống thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 và hai giống đậu tương

ĐT12, DT2008 để thử nghiệm chuyển gen kháng SMV và BYMV do Phòng

Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Nguồn virus SMV và BYMV sử

dụng trong lây nhiễm nhân tạo do viện Bảo vệ thực vật cung cấp

Vector tách dòng pBT và pENTRTM/D-TOPO, vector chuyển gen

pK7GWIWG2(II); Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; E coli One Shot® Top

10 và A tumefaciens CV58 pGV 2660 được dùng trong phân lập gen, thiết

kế vector chuyển gen và chuyển gen

Hóa chất được mua tại các hãng nổi tiếng trên thế giới; các thí nghiệm

được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng,

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ

gen, Viện Công nghệ sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Phòng

thí nghiệm Công nghệ tế bào Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại

học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên

- 23 -

Hình 3.31 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống DT2008

(-): Đối chứng âm; 1-32: 32 dòng đậu tương DT2008 chuyển gen

M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) Cũng bằng phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín đậu

tương nhờ A tumeffaciens, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất là 0,24%; Nguyễn Thu Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen HA1 của virus H5N1 vào 650

mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất chuyển gen là 1,23% Trong nghiên cứu của chúng tôi, hiệu suất chuyển gen với cấu trúc RNAi (pK7GW –CPi (SMV-BYMV) ở giống ĐT12 là 1,35%, ở giống DT2008 là 2,24% Như vậy có thể thấy rằng hiệu suất chuyển gen ở cây đậu tương không chỉ phụ thuộc vào khả năng tiếp nhận gen của kiểu gen cây đậu tương, mà còn phụ thuộc vào đặc điểm của cấu trúc gen được chuyển vào cây đậu tương Bệnh do virus ở cây đậu tương có triệu chứng rất khó phân biệt, cây đậu tương có thể nhiễm đồng thời nhiều loại virus, như SMV gây bệnh khảm, BYMV gây bệnh khảm vàng, virus gây bệnh xoăn lá…Hai loài virus SMV và BYMV gây bệnh khảm trên cây đậu tương được chúng tôi chọn làm đối tượng để nghiên cứu tạo cây chuyển gen theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi (SMV-BYMV) được chúng tôi thiết kế và chuyển vào cây thuốc lá và cây đậu tương Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của 26 dòng cây thuốc

lá chuyển gen đã thu được tỷ lệ kháng khá cao (73,08%) Những kết quả này chứng minh tính hiệu quả của chiến lược ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus và là cơ sở cho việc xác định tính khả thi của nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loại virus SMV và BYMV

500bp

500bp

- 22 -

Bảng 3.10 Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu

tương ĐT12 và DT2008 nhờ A tumefaciens qua nách lá mầm

Giống Lô thí

nghiệm

Số mẫu biến nạp

Số mẫu tạo chồi

Số chồi kéo dài

Số chồi

ra rễ

Số cây trồng trên giá thể

Số cây sống trên giá thể

Số cây dương tính với PCR

Hiệu suất chuyển gen (%)

ĐT12

Tổng 370 112 40 31 24 16

5 1,35

DT2008

Tổng 850 403 164 105 90 32

19 2,24

3.4.2 Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T 0

Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu

SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R từ DNA hệ gen để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng đậu

tương chuyển gen, kết quả PCR nhân bản đoạn gen CPi (SMV-BYMV) có

kích thước là 573 bp từ DNA tổng số của 16 dòng cây chuyển gen từ giống

ĐT12 nhận được 5 dòng cây dương tính với PCR (T12-3, T12-10, T12-11,

T12-12 T12-16) (Hình 3.30), với hiệu suất chuyển gen là 1,35%

Hình 3.30 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc

CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống ĐT12

1-16: 16 dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific)

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen CPi

(SMV-BYMV) với cặp mồi đặc hiệu từ DNA tổng số của 32 dòng đậu tương

chuyển gen giống DT2008 nhận được 19 dòng cây dương tính với PCR

(1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14,

T08-15, T08-16, T08-17, T08-22, T08-24, T08-25, T08-26, T08-27, T08-29,

T08-30) (Hình 3.34), với hiệu suất chuyển gen là 2,24%

500 bp 

- 7 -

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) phân lập gen, (2) thiết kế vector chuyển gen, (3) chuyển gen, (4) phân tích cây chuyển gen và (4) phân tích, xử lý số liệu Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát như mô tả trong hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.2.1 Nhóm các phương pháp phân lập gen

Thu thập mẫu bệnh và tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá đậu tương nghi nhiễm SMV: i) Thu thập và bảo quản mẫu lá đậu tương nghi nhiễm SMV,

BYMV; ii) Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá nghi nhiễm SMV

Phương pháp tổng hợp cDNA, nhân bản đoạn cDNA của gen CP từ SMV bằng PCR

Kỹ thuật tách dòng gen và xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT, iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α; iv) Chọn dòng

MẪU LÁ ĐẬU TƯƠNG NHIỄM SMV

PHÂN LẬP GEN ĐOẠN GEN

CP TỪ SMV

THIẾT KẾ ĐOẠN BẢO THỦ CPi-SMV VÀ CPi (SMV-BYMV)

THIẾT KẾ VECTOR RNAi CHỨA ĐOẠN BẢO THỦ CPi (SMV-BYMV)

Phân tích gen

CP bằng BASLT trên NCBI

CHUYỂN CẤU TRÚC CPi (SMV-BYMV) VÀO CÂY THUỐC LÁ C9-1

CHUYỂN CẤU TRÚC CPi (SMV-BYMV) VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12, DT2008

Phân tích đoạn CPi (SMV-BYMV bằng PCR

Đánh giá tính kháng SMV và BYMV

Kỹ thuật GATEWAY

Thông qua

A tumefaciens

Xác định sự có mặt của đoạn CPi (SMV-BYMV)

Cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)]

- 8 - khuẩn lạc bằng colony-PCR, v) Tách chiết plasmid, vi) Xác định và phân

tích trình tự nucleotide

2.2.2 Nhóm các phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi

Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CP của SMV

và BYMV được thiết kế theo mô hình ihpRNA bằng kỹ thuật Gateway

(Invitrogen) Các bước chính trong kỹ thuật này theo Karimi và đtg (2002),

bao gồm: (1) Thiết kế và tổng hợp nhân tạo đoạn gen CPi (SMV-BYMV)

của SMV và BYMV) và khuếch đại đoạn CPi(SMV-BYMV), (2) Lai ghép

đoạn CPi (SMV-BYMV) với vector pETRTM/D-TOPO® và (3) Thực hiện

phản ứng LR để trao đổi đoạn CPi (SMV-BYMV) từ vector pENTRTM

/D-TOPO® sang vector pK7GWIWG(II) (Hình 2.4)

Hình 2.4 Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ

thuật Gateway

2.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens

Biến nạp pK7GW/SMV-BYMV-CPi vào tế bào A tumefaciens

CV58C1 pGV2260 bằng xung điện

Chuyển cấu trúc RNAi mang vùng gen CPi (SMV-BYMV) vào cây

thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A Tumefaciens

Chuyển vector chứa cấu trúc RNAi mang đoạn gen CPi (SMV-BYMV)

vào giống đậu tương ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A tumefaciens

- 21 - Thí nghiệm chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) đối với giống đậu tương ĐT12 ở 3 lần biến nạp trong 370 mẫu thu được 112 mẫu tạo chồi và có 40 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong

đó 31 chồi ra rễ, đem trồng 24 cây trên giá thể và đã nhận được 16 cây T0 sống và phát triển trên giá thể Đối với giống đậu tương DT2008 với 850 mẫu trong 4 lần biến nạp thu được 403 mẫu tạo chồi, chọn được 164 chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 105 chồi

ra rễ, mang 90 cây trồng trên giá thể và đã nhận được 32 cây T0 sinh trưởng

và phát triển trên giá thể (Bảng 3.10)

Hình 3.28 Tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT2008 bằng kỹ thuật

lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín

A – Nách lá mầm hạt chín; B - Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn và lây nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; D - Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM lần 1 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2 mg/l + kanam ycin 50 mg/l); E - Cắt

bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM trong 2 tuần (bổ sung GA3 0,5 mg/l

+ IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l); G - Ra rễ trên môi trường RM (bổ sung IBA 0,1 mg/l) trong 20 ngày; H - Ra cây (giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng)

Nách lá mầm

- 20 - khảm và xoăn, còi cọc và sinh trưởng kém Trong khi đó, các dòng cây

kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường, lá xanh tốt

Các giống thuốc lá K326 và Longjiang 911 được chuyển cấu trúc mang

gen CP của TMV theo cơ chế RNAi thông qua Agrobacterium tumefaciens

có khả năng kháng TMV tương ứng là 83% và 90% (Yan và đtg, 2007)

Zhang và đtg (2012) đã đề cập đến thiết kế cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn

lặp lại đảo chiều của cDNA CP của virus Y ở khoai tây (PVY) và chuyển

vào cây thuốc lá, khả năng kháng PVY của các dòng thuốc lá chuyển gen là

83,54%… Ở Việt Nam, thành công đầu tiên ứng dụng kỹ thuật RNAi trong

tạo cây chuyển gen kháng virus là công trình nghiên cứu tạo các dòng cây

thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng CMV là 70,9%, kháng PVY là

84,1%, kháng TMV là 74,5% và khả năng kháng đồng thời hai loại virus

TMV và CMV lên tới 70,8% Trong nghiên cứu này đoạn gen CPi của hai

loại SMV và BYMV được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc

pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chuyển vào cây thuốc lá và thu được kết quả

khả quan, với 73,08% dòng cây chuyển gen kháng hoàn toàn đối với SMV

và BYMV, thuộc nhóm cây chuyển gen có tính kháng cao đối với virus

Chúng tôi cũng đồng tình với quan điểm của Kumar và Sarin (2013) cho

rằng, việc sử dụng các can thiệp bằng kỹ thuật RNAi đã cung cấp một cách

tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo ra cây trồng kháng virus và côn

trùng, mà cho đến nay khó có kỹ thuật nào thay thế

3.4 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG CẤU TRÚC RNAi

3.4.1 Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây đậu tương

Tiến hành chuyển cấu trúc vector CPi (SMV-BYMV) vào mô đậu tương

của hai giống ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A tumefaciens bằng kỹ

thuật lây nhiễm qua nách lá mầm hạt chín theo quy trình chuyển gen ở đậu

tương đã được tối ưu (Hình 3.28)

- 9 -

Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen: Mỗi mẫu biến nạp là

mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm và qua hai lần chọn lọc bằng kháng sinh Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể Số cây sống trên giá thể của mỗi mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành một dòng cây chuyển gen Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức:

Hiệu suất chuyển gen =

Số dòng cây chuyển gen dương tính với PCR

Tổng số mẫu biến nạp

100(%)

2.3.4 Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR Phân tích, đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA SMV

3.1.1 Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV

Kết quả so sánh 96 trình tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI cho thấy các trình tự gen CP trên GenBank có độ tương đồng từ 94% đến 100% và kích thước vùng tương đồng được xác định có số lượng hơn 700 nucleotide Từ kết quả so sánh và xác định vùng tương đồng của các trình tự gen CP và dựa vào trình tự gen CP có mã số X63771 trên GenBank chúng tôi đã thiết kế cặp mồi PCR SMVcp-F/SMVcp-R để nhân đoạn tương đồng của gen CP dự tính có kích thước là 720 nucleotide

RNA tổng số được tách chiết từ lá đậu tương, tiến hành phản ứng phiên mã ngược để tạo cDNA và tiến hành phản ứng PCR Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP được thực hiện và kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel argarose và nhận được một băng DNA đặc hiệu với kích thước khoảng 0,7kb, đúng với kích thước được dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.1)

- 10 - Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel và tinh sạch và gắn trực tiếp vào

vector tách dòng pBT sau đó được biến nạp vào tế bào E coli DH5 Tiến

hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR, kết quả điện di cho thấy sản

phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 0,7kb

(Hình 3.2)

Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP phân lập từ SMV

dòng SL1 và SL2 gây bệnh khảm trên cây đậu tương thu tại Sơn La có 720

nucleotide Khi so sánh với trình tự của đoạn gen CP trên Ngân hàng gen

quốc tế có mã số X63771 (trình tự sử dụng để thiết kế cặp mồi nhân đoạn

gen CP) bằng BLAST trong NCBI cho thấy đoạn gen CP (cDNA) mà chúng

tôi phân lập được từ SMV dòng SL1 có độ tương đồng là 100%, còn trình tự

đoạn gen CP phân lập từ dòng SL2 có độ tương đồng là 99,3%, và hai trình

tự đoạn gen CP của dòng SL1 và SL2 có độ tương đồng là 99,3% Như vậy

có thể kết luận rằng trình tự cDNA mà chúng tôi phân lập được là đoạn gen

CP mã hóa protein CP của SMV dòng SL1 và SL2

Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản

phẩm RT-PCR khuếch đại

đoạn gen CP (cDNA) của SMV

(1, 2: SL1, SL2; M: Thang DNA

chuẩn 1 kb)

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc (M: thang DNA

chuẩn 1 kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc) dòng SL1; 4, 5, 6: Gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc dòng SL2)

3.1.2 Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV

Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen CP của SMV dòng

SL1 và SL2 (Việt Nam) với 18 trình tự gen CP đã công bố trên GenBank (8

dòng Nhật Bản, 2 dòng Hàn Quốc, 2 dòng Mỹ, 4 dòng Trung Quốc, 1 dòng

1 2 M

 1kb

M 1 2 3 4 5 6

- 19 -

Kết quả đánh giá tính kháng bệnh virus khảm của 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen và 10 cây đối chứng được trình bày ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả lây nhiễm nhân tạo và khả năng kháng SMV, BYMV của các dòng thuốc lá chuyển gen T0 và cây đối chứng

không chuyển gen

Ghi chú: (+); (++); (+++) mức độ biểu hiện bệnh nhẹ, trung bình và nặng

Kết quả thống kê ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ kháng hoàn toàn của các dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) khá cao (19 cây kháng/26 cây lây nhiễm), tương ứng với 73,08%) Những cây đối chứng và các dòng cây chuyển gen nhiễm bệnh đều biểu hiện có lá bị

Các dòng cây chuyển gen Đối chứng không chuyển gen Lần

lây nhiễm

Số cây được lây nhiễm

Số cây kháng hoàn toàn

Số cây biểu hiện bệnh

Tỷ lệ kháng (%)

Số cây được lây nhiễm

Số cây kháng hoàn toàn

Số cây biểu hiện nhiễm bệnh nặng

Tỷ lệ kháng (%)

Hình 3.27 Hình thái lá của một số dòng thuốc lá chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen

A Dòng cây chuyển gen T0-5 kháng virus;

B: Dòng cây chuyển gen T0-12 nhiễm nhẹ virus;

C: Dòng cây chuyển gen T0-9 nhiễm nặng virus;

D: Cây đối chứng không chuyển gen nhiễm nặng virus